Brain Ventricular Microinjections av lipopolysakkarid i Larval Zebrafish for å vurdere nevroinflammasjon og nevrotoksisitet

Summary

Denne protokollen demonstrerer mikroinjeksjon av lipopolysakkarid i hjernens ventrikulære region i en sebrafisklarvemodell for å studere den resulterende nevroinflammatoriske responsen og nevrotoksisiteten.

Abstract

Nevroinflammasjon er en nøkkelspiller i ulike nevrologiske lidelser, inkludert nevrodegenerative sykdommer. Derfor er det av stor interesse å undersøke og utvikle alternative in vivo nevroinflammasjonsmodeller for å forstå rollen som nevroinflammasjon i nevrodegenerasjon. I denne studien ble en larvesebrafiskmodell av nevroinflammasjon mediert av ventrikulær mikroinjeksjon av lipopolysakkarid (LPS) for å indusere en immunrespons og nevrotoksisitet utviklet og validert. De transgene sebrafisklinjene elavl3:mCherry, ETvmat2:GFP og mpo:EGFP ble brukt til sanntidskvantifisering av hjernenevronenes levedyktighet ved fluorescenslevende avbildning integrert med fluorescensintensitetsanalyse. Den lokomotoriske oppførselen til sebrafisklarver ble registrert automatisk ved hjelp av en videosporingsopptaker. Innholdet av nitrogenoksid (NO) og mRNA-ekspresjonsnivåene av inflammatoriske cytokiner, inkludert interleukin-6 (IL-6), interleukin-1β (IL-1β) og human tumornekrosefaktor α (TNF-α) ble undersøkt for å vurdere LPS-indusert immunrespons i larvesebrafiskhodet. Ved 24 timer etter hjernens ventrikulære injeksjon av LPS ble det observert tap av nevroner og bevegelsesmangel hos sebrafisklarver. I tillegg økte LPS-indusert nevroinflammasjon NO-frigjøring og mRNA-ekspresjon av IL-6, IL-1β og TNF-α i hodet 6 dager etter befruktning (dpf) sebrafisklarver, og resulterte i rekruttering av nøytrofiler i sebrafiskhjernen. I denne studien ble injeksjon av sebrafisk med LPS i en konsentrasjon på 2,5-5 mg/ml ved 5 dpf bestemt som den optimale tilstanden for denne farmakologiske nevroinflammasjonsanalysen. Denne protokollen presenterer en ny, rask og effektiv metodikk for mikroinjeksjon av LPS i hjerneventrikkelen for å indusere LPS-mediert nevroinflammasjon og nevrotoksisitet i en sebrafisklarver, som er nyttig for å studere nevroinflammasjon og kan også brukes som en high throughput in vivo drug screening assay.

Introduction

Nevroinflammasjon har blitt beskrevet som en avgjørende anti-nevrogen faktor involvert i patogenesen av flere nevrodegenerative sykdommer i sentralnervesystemet (CNS)¹. Etter patologiske fornærmelser kan nevroinflammasjon resultere i ulike negative konsekvenser, inkludert inhibering av nevrogenese og induksjon av nevroncelledød ^2,3. I prosessen som ligger til grunn for responsen på induksjon, utskilles flere inflammatoriske cytokiner (som TNF-α, IL-1β og IL-6) i det ekstracellulære rommet og fungerer som avgjørende komponenter i nevrondød og undertrykkelse av neurogenese ^4,5,6.

Mikroinjeksjon av betennelsesmediatorer (som IL-1β, L-arginin og endotoksiner) i hjernen kan forårsake nevroncellereduksjon og nevroinflammasjon ^7,8,9. Lipopolysakkarid (LPS, figur 1), et patogent endotoksin som er tilstede i celleveggen til gramnegative bakterier, kan indusere nevroinflammasjon, forverre nevrodegenerasjon og redusere nevrogenese hos dyr¹⁰. LPS-injeksjon direkte inn i CNS i musehjernen økte nivåene av nitrogenoksid, proinflammatoriske cytokiner og andre regulatorer¹¹. Videre kan stereotaksisk injeksjon av LPS i det lokale hjernemiljøet indusere overdreven produksjon av nevrotoksiske molekyler, noe som resulterer i nedsatt nevronfunksjon og påfølgende utvikling av nevrodegenerative sykdommer 10,12,13,14,15. I nevrovitenskapsfeltet er levende og tidskurs mikroskopiske observasjoner av cellulære og biologiske prosesser i levende organismer avgjørende for å forstå mekanismene som ligger til grunn for patogenese og farmakologisk virkning¹⁶. Imidlertid er levende avbildning av musemodeller av nevroinflammasjon og nevrotoksisitet fundamentalt begrenset av den begrensede optiske penetrasjonsdybden av mikroskopi, som utelukker funksjonell avbildning og levende observasjon av utviklingsprosesser^17,18,19. Derfor er utviklingen av alternative nevroinflammasjonsmodeller av stor interesse for å lette studiet av patologisk utvikling, og mekanismen som ligger til grunn for nevroinflammasjon og nevrodegenerasjon, ved levende bildebehandling.

Sebrafisk (Danio rerio) har dukket opp som en lovende modell for å studere nevroinflammasjon og nevrodegenerasjon på grunn av dets evolusjonært konserverte medfødte immunsystem, optisk gjennomsiktighet, stor embryokoblingsstørrelse, genetisk trekkraft og egnethet for in vivo-avbildning 19,20,21,22,23 . Tidligere protokoller har enten direkte injisert LPS i eggeplommen og bakhjernens ventrikel av larvesebrafisk uten mekanistisk vurdering, eller bare tilsatt LPS til fiskevann (kulturmedium) for å indusere en dødelig systemisk immunrespons^24,25,26,27. Her utviklet vi en protokoll for mikroinjeksjon av LPS i hjernens ventrikler, for å utløse en medfødt immunrespons eller nevrotoksisitet i 5 dager etter befruktning (dpf) sebrafisklarver. Denne responsen fremgår av nevroncelletap, lokomotorisk atferdsunderskudd, økt nitrittoksidfrigivelse, aktivering av inflammatorisk genuttrykk og rekruttering av nøytrofiler i sebrafiskhjernen ved 24 timer etter injeksjon.

Protocol

AB wild-type sebrafisk og transgene sebrafisklinjer elavl3: mCherry, ETvmat2: GFP og mpo: EGFP ble hentet fra Institutt for kinesisk medisinsk vitenskap (ICMS). Etisk godkjenning (UMARE-030-2017) for dyreforsøkene ble gitt av Animal Research Ethics Committee, University of Macau, og protokollen følger institusjonens retningslinjer for dyrepleie. 1. Sebrafiskembryo og larvehold Generer sebrafiskembryoer (200-300 embryoer per parring) ved naturlig parring som tidlige…

Representative Results

Arbeidsflyten beskrevet her presenterer en ny, rask og effektiv metodikk for å indusere LPS-mediert nevroinflammasjon og nevrotoksisitet hos sebrafisklarver. I denne beskrevne protokollen ble 5 dpf sebrafisk injisert med LPS (figur 1) i hjerneventriklene ved hjelp av en mikroinjektor (figur 2A-C). Vellykket injeksjon i hjernens ventrikkelsted ble verifisert ved bruk av 1% Evans blå flekk (figur 2D…

Discussion

En økende mengde epidemiologiske og eksperimentelle data impliserer kroniske bakterielle og virusinfeksjoner som mulige risikofaktorer for nevrodegenerative sykdommer³⁶. Infeksjonen utløser aktivering av inflammatoriske prosesser og vertsimmunresponser³⁷. Selv om responsen virker som en forsvarsmekanisme, er overaktivert betennelse skadelig for nevrogenese, og det inflammatoriske miljøet tillater ikke overlevelse av nyfødte nevroner³⁸. Som et res…

Materials

Agarose	Sigma-Aldrich	A6361
Agarose, low gelling temperature	Sigma-Aldrich	A9414
Drummond Nanoject III Programmable Nanoliter Injector	Drummond Scientific	3-000-207
Fluorescence stereo microscopes	Leica	M205 FA
GraphPad Prism software	GraphPad Software	Ver. 7.04
Lipopolysaccharides from Escherichia coli O111:B4	Sigma-Aldrich	L3024
Manual micromanipulator	World Precision Instruments	M3301
Mineral oil	Sigma-Aldrich	M5904
Mx3005P qPCR system	Agilent Technologies	Mx3005P
Nanovue plus spectrophotometer	Biochrom	80-2140-46
Nitrite concentration assay kit	Beyotime Biotechnology	S0021M
Phosphate-buffered saline	Sigma-Aldrich	P4417
Programmable Horizontal Pipette Puller	World Precision Instruments	PMP-102
PTU (N-Phenylthiourea)	Sigma-Aldrich	P7629
Random primers	Takara	3802
SuperScript II Reverse Transcriptase	Invitrogen	18064014
SYBR Premix Ex Taq II kit	Accurate Biology	AG11701
The 3rd Gen Tgrinder	Tiangen	OSE-Y30
Thin wall glass capillaries (4”) with filament, OD 1.5 mm	World Precision Instruments	TW150F-4
Tricaine (3-amino benzoic acid ethyl ester)	Sigma-Aldrich	A-5040
TRNzol Universal reagent	Tiangen	DP424
Zebrafish tracking box	ViewPoint Behavior Technology