Hjärnan ventrikulära mikroinjektioner av lipopolysackarid i larv zebrafisk för att bedöma neuroinflammation och neurotoxicitet

Summary

Detta protokoll visar mikroinjektionen av lipopolysackarid i hjärnans ventrikulära region i en zebrafisklarvmodell för att studera det resulterande neuroinflammatoriska svaret och neurotoxiciteten.

Abstract

Neuroinflammation är en nyckelspelare i olika neurologiska sjukdomar, inklusive neurodegenerativa sjukdomar. Därför är det av stort intresse att forska och utveckla alternativa in vivo neuroinflammationsmodeller för att förstå neuroinflammationens roll i neurodegeneration. I denna studie utvecklades och validerades en larvzebrafiskmodell av neuroinflammation medierad genom ventrikulär mikroinjektion av lipopolysackarid (LPS) för att inducera ett immunsvar och neurotoxicitet. De transgena zebrafisklinjerna elavl3: mCherry, ETvmat2: GFP och mpo: EGFP användes för kvantifiering i realtid av hjärnans neuronlivskraft genom fluorescens levande avbildning integrerad med fluorescensintensitetsanalys. Det lokomotoriska beteendet hos zebrafisklarver registrerades automatiskt med hjälp av en videospårningsinspelare. Innehållet av kväveoxid (NO) och mRNA-uttrycksnivåerna av inflammatoriska cytokiner inklusive interleukin-6 (IL-6), interleukin-1β (IL-1β) och human tumörnekrosfaktor α (TNF-α) undersöktes för att bedöma det LPS-inducerade immunsvaret i larvzebrafiskhuvudet. Vid 24 timmar efter hjärnans ventrikulära injektion av LPS observerades förlust av neuroner och rörelsebrist hos zebrafisklarver. Dessutom ökade LPS-inducerad neuroinflammation NO-frisättning och mRNA-uttrycket av IL-6, IL-1β och TNF-α i huvudet på 6 dagar efter befruktning (dpf) zebrafisklarver och resulterade i rekrytering av neutrofiler i zebrafiskhjärnan. I denna studie bestämdes injektion av zebrafisk med LPS i en koncentration av 2,5-5 mg/ml vid 5 dpf som det optimala tillståndet för denna farmakologiska neuroinflammationsanalys. Detta protokoll presenterar en ny, snabb och effektiv metod för hjärnkammarmikroinjektion av LPS för att inducera LPS-medierad neuroinflammation och neurotoxicitet i en zebrafisklarv, vilket är användbart för att studera neuroinflammation och kan också användas som en högkvalitativ in vivo-läkemedelsscreeninganalys.

Introduction

Neuroinflammation har beskrivits som en avgörande anti-neurogen faktor som är involverad i patogenesen av flera neurodegenerativa sjukdomar i centrala nervsystemet (CNS)¹. Efter patologiska förolämpningar kan neuroinflammation leda till olika negativa konsekvenser, inklusive hämning av neurogenes och induktion av neuronal celldöd ^2,3. I processen som ligger till grund för svaret på inflammationsinduktion utsöndras flera inflammatoriska cytokiner (såsom TNF-α, IL-1β och IL-6) i det extracellulära utrymmet och fungerar som avgörande komponenter i neurondöd och undertryckande av neurogenes ^4,5,6.

Mikroinjektion av inflammationsmediatorer (såsom IL-1β, L-arginin och endotoxiner) i hjärnan kan orsaka neuronal cellreduktion och neuroinflammation ^7,8,9. Lipopolysackarid (LPS, figur 1), ett patogent endotoxin som finns i cellväggen hos gramnegativa bakterier, kan inducera neuroinflammation, förvärra neurodegeneration och minska neurogenes hos djur¹⁰. LPS-injektion direkt i CNS i mushjärnan ökade nivåerna av kväveoxid, proinflammatoriska cytokiner och andra regulatorer¹¹. Dessutom kan stereotaxisk injektion av LPS i den lokala hjärnmiljön inducera överdriven produktion av neurotoxiska molekyler, vilket resulterar i nedsatt neuronal funktion och efterföljande utveckling av neurodegenerativa sjukdomar 10,12,13,14,15. Inom neurovetenskap är levande och tidsförloppsmikroskopiska observationer av cellulära och biologiska processer i levande organismer avgörande för att förstå mekanismerna bakom patogenes och farmakologisk verkan¹⁶. Levande avbildning av musmodeller av neuroinflammation och neurotoxicitet begränsas emellertid i grunden av mikroskopins begränsade optiska penetrationsdjup, vilket utesluter funktionell avbildning och levande observation av utvecklingsprocesser^17,18,19. Därför är utvecklingen av alternativa neuroinflammationsmodeller av stort intresse för att underlätta studien av patologisk utveckling och mekanismen bakom neuroinflammation och neurodegeneration genom levande avbildning.

Zebrafisk (Danio rerio) har framstått som en lovande modell för att studera neuroinflammation och neurodegeneration på grund av dess evolutionärt bevarade medfödda immunsystem, optisk transparens, stor embryokopplingsstorlek, genetisk dragbarhet och lämplighet för in vivo-avbildning 19,20,21,22,23 . Tidigare protokoll har antingen injicerat LPS direkt i äggulan och bakhjärnan hos larvzebrafisk utan mekanistisk bedömning, eller helt enkelt tillsatt LPS till fiskvatten (odlingsmedium) för att inducera ett dödligt systemiskt immunsvar^24,25,26,27. Häri utvecklade vi ett protokoll för mikroinjektion av LPS i hjärnventriklarna, för att utlösa ett medfött immunsvar eller neurotoxicitet under 5 dagar efter befruktning (dpf) zebrafisklarver. Detta svar framgår av neuronal cellförlust, lokomotoriskt beteendeunderskott, ökad nitritoxidfrisättning, aktivering av inflammatoriskt genuttryck och rekrytering av neutrofiler i zebrafiskhjärnan vid 24 timmar efter injektion.

Protocol

AB zebrafisk av vild typ och transgena zebrafisklinjer elavl3: mCherry, ETvmat2: GFP och mpo: EGFP erhölls från Institute of Chinese Medical Sciences (ICMS). Etiskt godkännande (UMARE-030-2017) för djurförsöken beviljades av Animal Research Ethics Committee, University of Macau, och protokollet följer riktlinjerna för institutionell djurvård. 1. Zebrafiskembryo och larvhållning Generera zebrafiskembryon (200-300 embryon per parning) genom naturlig parvis pa…

Representative Results

Arbetsflödet som beskrivs här presenterar en ny, snabb och effektiv metod för att inducera LPS-medierad neuroinflammation och neurotoxicitet hos zebrafisklarver. I detta beskrivna protokoll injicerades 5 dpf zebrafiskar med LPS (figur 1) i hjärnans ventriklar med hjälp av en mikroinjektor (figur 2A-C). Framgångsrik injektion i hjärnans ventrikelställe verifierades med 1% Evans blå fläck (figur 2D</…

Discussion

En ökande mängd epidemiologiska och experimentella data implicerar kroniska bakteriella och virusinfektioner som möjliga riskfaktorer för neurodegenerativa sjukdomar³⁶. Infektionen utlöser aktivering av inflammatoriska processer och värdimmunsvar³⁷. Även om svaret fungerar som en försvarsmekanism, är överaktiverad inflammation skadlig för neurogenes, och den inflammatoriska miljön tillåter inte överlevnad av nyfödda neuroner³⁸. Som ett…

Materials

Agarose	Sigma-Aldrich	A6361
Agarose, low gelling temperature	Sigma-Aldrich	A9414
Drummond Nanoject III Programmable Nanoliter Injector	Drummond Scientific	3-000-207
Fluorescence stereo microscopes	Leica	M205 FA
GraphPad Prism software	GraphPad Software	Ver. 7.04
Lipopolysaccharides from Escherichia coli O111:B4	Sigma-Aldrich	L3024
Manual micromanipulator	World Precision Instruments	M3301
Mineral oil	Sigma-Aldrich	M5904
Mx3005P qPCR system	Agilent Technologies	Mx3005P
Nanovue plus spectrophotometer	Biochrom	80-2140-46
Nitrite concentration assay kit	Beyotime Biotechnology	S0021M
Phosphate-buffered saline	Sigma-Aldrich	P4417
Programmable Horizontal Pipette Puller	World Precision Instruments	PMP-102
PTU (N-Phenylthiourea)	Sigma-Aldrich	P7629
Random primers	Takara	3802
SuperScript II Reverse Transcriptase	Invitrogen	18064014
SYBR Premix Ex Taq II kit	Accurate Biology	AG11701
The 3rd Gen Tgrinder	Tiangen	OSE-Y30
Thin wall glass capillaries (4”) with filament, OD 1.5 mm	World Precision Instruments	TW150F-4
Tricaine (3-amino benzoic acid ethyl ester)	Sigma-Aldrich	A-5040
TRNzol Universal reagent	Tiangen	DP424
Zebrafish tracking box	ViewPoint Behavior Technology