ヒト細胞におけるHSV-1感染後のRIPK3およびMLKLのZBP1依存性リン酸化の免疫蛍光染色のためのチラミドシグナル増幅
Summary
免疫蛍光染色中のチラミドシグナル増幅により、HSV-1感染後のZBP1誘発ネクロトーシス中のリン酸化RIPK3およびMLKLの高感度検出が可能になります。
Abstract
キナーゼ受容体相互作用セリン/スレオニンプロテインキナーゼ3(RIPK3)およびその基質混合系統キナーゼドメイン様(MLKL)は、重要な抗ウイルス機能を備えた炎症性細胞死型であるネクロプトーシスの重要な調節因子です。RIPK3の自己リン酸化は、ネクロトーシスMLKLの細孔形成実行タンパク質のリン酸化および活性化を誘導する。細胞膜でのリン酸化MLKLのトラフィッキングとオリゴマー化は、ネクロトーシス細胞死の特徴である細胞溶解をもたらします。核酸センサーZBP1は、RNAおよびDNAウイルスに感染した後、左巻きZ型二本鎖RNA(Z-RNA)に結合することによって活性化されます。ZBP1活性化は、感染した宿主細胞のネクロプトーシスを含む調節された細胞死を誘導することにより、ウイルス感染を制限します。免疫蛍光顕微鏡法は、ZBP1を介したネクロトーシスの下流にあるさまざまなシグナル伝達ステップを細胞ごとに視覚化することができます。しかしながら、ヒトRIPK3およびMLKLに対する現在市販のホスホ特異的抗体を用いた標準的な蛍光顕微鏡の感度は、これらのマーカーの再現可能なイメージングを妨げる。ここでは、単純ヘルペスウイルス1(HSV-1)に感染したヒトHT-29細胞におけるセリン(S)リン酸化RIPK3(S227)およびMLKL(S358)の最適化された染色手順について説明します。免疫蛍光染色プロトコルにチラミドシグナル増幅(TSA)ステップを含めることで、S227リン酸化RIPK3の特異的検出が可能になります。さらに、TSAはS358リン酸化MLKLの検出感度を大幅に向上させます。一緒に、この方法は、ZBP1誘発ネクロプトーシスの誘導中のこれら2つの重要なシグナル伝達イベントの視覚化を可能にします。
Introduction
受容体相互作用セリン/スレオニンプロテインキナーゼ3(RIPK3)および混合系統キナーゼドメイン様(MLKL)は、ネクロトーシス細胞死の中心的な調節因子です1,2。ネクロトーシスは、抗ウイルス免疫と自己炎症に関与する調節された細胞死の溶解性および炎症性形態です。ウイルス感染細胞のネクロトーシスは、ウイルス複製を直ちにシャットダウンします。ネクロトーシス誘導後の細胞溶解は、抗ウイルス免疫を刺激する損傷関連の分子パターンも放出します3,4。ネクロトーシスは、RIPホモタイプ相互作用モチーフ(RHIM)を介した3つの上流活性化分子のうちの1つとのRIPK3の活性化によって開始されます:RIPK1(TNF受容体1[TNFR1]の関与時)、TIRドメイン含有アダプター誘導インターフェロンβ(TRIF;Toll様受容体3および4の関与時)、または抗ウイルス核酸センサーZ-DNA結合タンパク質1(ZBP1)1,2。.ネクロトーシスシグナル伝達は、RIPK3の自己リン酸化から始まる一連のリン酸化イベントを通じて進行します。キナーゼドメイン内のセリン(S)227でのヒトRIPK3の自己リン酸化は、MLKLとの相互作用を可能にすることによるネクロトーシスの前提条件であり、ヒトRIPK3活性化およびネクロトーシス細胞死の生化学的マーカーとして一般的に使用されています1,5。活性化されると、RIPK3はスレオニン(T)357およびS3581でMLKLの活性化ループをリン酸化します。これにより、MLKL立体構造が変化し、N末端4ヘリックスバンドルドメインが露出します。その後、MLKLはオリゴマー化して細胞膜に輸送し、脂質二重層に露出した4つのらせん束を挿入することで細孔を形成し、最終的に細胞死につながります2,6。
ZBP1は、Z立体構造中の二本鎖RNA(Z-RNA)を含む左巻きのZ型核酸を認識する抗ウイルス核酸センサーです。Z-RNA結合は、ZBP1のN末端に位置する2つのZαドメインを介して起こる。RNAおよびDNAウイルス感染中に蓄積するZ-RNAは、ZBP1 7,8に直接関与すると考えられている。活性化されたZBP1は、その中央RHIMを介してRIPK3をリクルートし、ネクロトーシスを含む調節された細胞死を誘導します9,10。ウイルスは、ZBP1誘導宿主細胞ネクロトーシスに対抗するために、数多くのエスケープメカニズムを採用しています11。例えば、単純ヘルペスウイルス1(HSV-1)リボヌクレオチドレダクターゼサブユニット1は、ICP6として知られ、UL39によってコードされ、そのN末端にRIMを有し、ヒト細胞におけるZBP1媒介RIPK3活性化を妨害する12,13,14,15。ZBP1はウイルス複製を制限するだけでなく、マウス研究はZBP1活性化が炎症性疾患を引き起こし、癌免疫を刺激することを示しています16、17、18、19、20、21。したがって、ヒト細胞におけるZBP1誘発ネクロトーシス中に発生するシグナル伝達イベントを検出するプロトコルは、これらのプロセスにおけるZBP1の役割を評価するために価値があります。
チラミドシグナル増幅(TSA)は、触媒レポーターデポジション(CARD)とも呼ばれ、抗体ベースのイムノアッセイにおける検出限界とS/N比を改善するために開発されました。TSAの際には、任意の一次抗体を使用して目的の抗原を検出することができます。西洋ワサビペルオキシダーゼ(HRP)は、二次抗体と結合し、過酸化水素の存在下でビオチン化チラミドラジカルの局所的な蓄積を触媒します。これらの活性化されたビオチン-チラミドラジカルは、近位チロシン残基と反応して共有結合を形成します。潜在的なチラミド-ビオチン基質には、抗原自体、一次抗体と二次抗体、および隣接タンパク質が含まれます。したがって、TSAはアッセイの感度を有意に向上させるが、その空間分解能の一部は失われる。最終ステップでは、蛍光標識ストレプトアビジンを使用してビオチン分子を検出します。HRP反応は、目的の抗原上または抗原の近くに多くのチラミド-ビオチン分子を沈着させます。これにより、ストレプトアビジン-蛍光色素結合部位の数が大幅に増加し、アッセイの感度が大幅に増幅されます(図1)。あるいは、チラミドを蛍光色素に直接結合させることができるため、ストレプトアビジン共役蛍光色素が不要になります。タンパク質免疫組織化学とDNA/RNAin situハイブリダイゼーションは、TSAがシグナル強度を改善するために採用された最初の方法の1つでした22,23。最近では、TSAは細胞内フローサイトメトリー24および質量分析25と組み合わされています。
ここでは、免疫蛍光顕微鏡を用いて、HSV-1感染によるZBP1の活性化時にセリン227リン酸化ヒトRIPK3(p-RIPK3[S227])およびリン酸化ヒトMLKL(p-MLKL [S358])を検出するためのプロトコルを提示する。ヒトZBP1を安定発現するように形質導入したネクロプトーシス感受性HT-29ヒト大腸腺癌細胞株を使用します。これらの細胞は、ウイルスRHIM(VQCG)内の4つのコアアミノ酸がアラニン(AAAA)に置換された変異ICP6タンパク質(HSV-1 ICP6mutRHIM)を発現するHSV-1株に感染し、それによってICP6がZBP1を介したネクロトーシスをブロックできないようにしました13,14,15。免疫染色26において、現在市販されているp-RIPK3およびp-MLKLに対する抗体のシグナル対ノイズ比が低いという問題を克服するために、チラミドシグナル増幅(TSA)ステップ(図1)を実行し、その結果、ヒトp-RIPK3の検出がロバストになり(S227)、ヒトp-MLKL(S358)の検出感度が桁違いに向上します。
Protocol
Representative Results
Discussion
この免疫蛍光染色プロトコルでは、RIPK3およびMLKL26のリン酸化など、検出が困難なヒトネクロトーシスシグナル伝達経路のシグナル伝達イベントの感度を高めるためのチラミドシグナル増幅(TSA)の使用について説明しています。TSAステップを含めることで、p-RIPK3(S227)およびp-MLKL(S358)の検出閾値が大幅に向上し、p-MLKL(S358)ひずみの感度が向上します。TSAは、模擬処理されたサ?…
Divulgazioni
The authors have nothing to disclose.
Acknowledgements
VIBバイオイメージングコアのトレーニング、サポート、インストゥルメントパークへのアクセスに感謝します。J.N.は、フランダース研究財団(FWO)の博士号フェローシップによってサポートされています。JMグループの研究は、オデュッセウスII助成金(G0H8618N)、EOS INLADIS(40007512)、フランダース研究財団(FWO)からのジュニア研究助成金(G031022N)、CRIG若手研究者の概念実証助成金、およびゲント大学の支援を受けました。P.V.グループの研究は、EOS MODEL-IDI(30826052)、EOS INFLADIS (40007512)、FWOシニア研究助成金(G.0C76.18N、G.0B71.18N、G.0B96.20N、G.0A9322N)、メトサレム(BOF16/MET_V/007)、iBOF20/IBF/039 ATLANTIS、Foundation Against Cancer(F/2016/865、F/2020/1505)、CRIGおよびGIGGコンソーシアム、およびVIBの支援を受けました。
Materials
| Antibodies | |||
| Anti-rabbit HRP | Agilent Technologies Belgium | K4002 | Envision+ System-HRP Labelled Polymer anti-rabbit |
| Goat anti-mouse DyLight 633 | Thermofisher | 35513 | Secundary antibody |
| HSV-1 ICP0 | Santa Cruz | sc-53070 | Mouse anti-ICP0(HSV-1) antibody |
| IAV-PR8 mouse serum | In house production | xx | Mouse anti-IAV-PR8 polyclonal antibody |
| pMLKL | Abcam | ab187091 | Rabbit anti-MLKL-phospho S358 antibody |
| pRIPK3 | Abcam | ab209384 | Rabbit anti-RIPK3-phospho S227 antibody |
| Fluorophores | |||
| DAPI | Thermofisher | D21490 | To visualise the nucleus of the cells |
| Streptavidin coupled to Alexa Fluor 568 | Thermofisher | S11226 | To visulalise biotin molecules |
| Compounds | |||
| 30% H2O2 | Sigma | H1009 | Oxidising substrate, necessary for HRP activity |
| 4% PFA | SANBIO | AR1068 | To fix/crosslink the cells |
| Biotinyl-tyramide | R&D Systems | 6241 | To amplify signal, HRP substrate |
| BV-6 | Selleckchem | S7597 | BV6 IAP Inhibitor |
| For cell culture: to detach the cells | |||
| 8.0 g/L NaCl | |||
| 0.4 g/L disodium salt of EDTA | |||
| EDTA 0.04% | In house formulation | 1.1 g/L Na2HPO4 | |
| 0.2 g/L NaH2PO4 | |||
| 0.2 g/L KCl | |||
| 0.2 g/L Glucose | |||
| Fetal Bovine serum | TICO | FBS EU XXX | For cell culture, maintaining cell culture; lot number: 90439 |
| GSK'840 | Aobious | AOB0917 | RIPK3 kinase inhibitor |
| L-Glutamine | Sigma-Aldrich | G7513 | For cell culture, maintaining cell culture |
| MAXblock | Active Motif | 15252 | Blocking solution |
| PBS | Gibco | 10444402 | |
| Sodium pyruvate | Sigma-Aldrich | S8636 | For cell culture, maintaining cell culture |
| TNF-α | In house production | – | Signaling molecule, able to trigger cell death in combination with BV6 and zVAD |
| Triton X-100 | Sigma Aldrich | T8787-50ML | To permeabilise the cells |
| Trypan blue | Merck | 11732 | For cell counting, used as live/dead marker at 0,1% |
| Trypsine | Sigma-Aldrich | T4424 | For cell culture: to detach the cells |
| zVAD | Bachem | BACE4026865.0005 | Z-Val-Ala-DL-Asp-fluoromethylketone |
| Material | |||
| µ-Slide 8 well high glass bottom | iBidi | 80807 | To culture the cells |
| Cotton Preping Balls-size medium | Electron Microscopy Sciences | 71001-10 | To clean the objectives |
| Immersol 518 F / 30 °C | ZEISS | 444970-9000-000 | To visualise the sample at high magnifications |
| Lens Cleaner | ZEISS | 000000-0105-200 | To clean the objectives |
| LSM880 Fast Airyscan confocal microscope | To visualise the sample | ||
| Software | |||
| Excel | Office | xx | To process the data |
| Prism 9 | Graphpad | xx | To analyse the data- statistical testing and graph generation |
| Volocity 6.3 | Volocity | xx | To perform quantifications |
| Zen black | ZEISS | xx | To aquire and process images |
| Zen blue | ZEISS | xx | To visualise images |
| Viruses | |||
| HSV-1 (mutRHIM) F strain | produced by Dr. Jiahuai Han | in house replication | HSV-1 as a trigger for necroptosis; RHIM core domain of UL39/ICP6 is mutated (VQCG>AAAA) |
| HSV-1 (WT) F strain | Produced by Dr. Jiahuai Han | in house replication | HSV-1 (WT) as a negative control for necroptosis induction (ICP6 inhibition) |
| IAV PR8 | in house stock | in house replication | IAV as a trigger for necroptosis |
Riferimenti
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