Waiting
Elaborazione accesso...

Trial ends in Request Full Access Tell Your Colleague About Jove
JoVE Journal Bioengineering
Click here for the English version

Bioengineering

En metode for å studere sammenhengen mellom lokal kollagenstruktur og mekaniske egenskaper til aterosklerotisk plakkfibervev

Published: November 11, 2022 doi: 10.3791/64334
Automatic Translation
1, 1, 1,2, 1,3, 4, 1,3, 1,2, 1,3
1Department of Biomedical Engineering, Erasmus Medical Center, 2Department of Biomedical Engineering, Eindhoven University of Technology, 3Department of Biomechanical Engineering, Delft University of Technology, 4Erasmus Optical Imaging Center, Erasmus Medical Center

Summary

Vi har utviklet en mekano-avbildningsrørledning for å studere de heterogene strukturelle og mekaniske aterosklerotiske plakkegenskapene. Denne rørledningen muliggjør korrelasjon av den lokale dominerende vinkelen og spredningen av kollagenfiberorientering, bruddoppførselen og belastningsfingeravtrykkene til det fibrøse plakkvevet.

Abstract

Brudd på aterosklerotiske plakk i koronar- og karoten arterier er den primære årsaken til dødelige kardiovaskulære hendelser. Imidlertid er bruddmekanikken til det heterogene, svært kollagenøse plakkvevet, og hvordan dette er relatert til vevets fibrøse struktur, ikke kjent ennå. Eksisterende rørledninger for å studere plakkmekanikk er begrenset til å oppnå bare brutto mekaniske egenskaper av plakkvevet, basert på antagelsen om strukturell homogenitet av vevet. Imidlertid er fibrøst plakkvev strukturelt heterogent, uten tvil hovedsakelig på grunn av lokal variasjon i kollagenfiberarkitekturen.

Mekano-avbildningsrørledningen beskrevet her er utviklet for å studere de heterogene strukturelle og mekaniske plakkegenskapene. I denne rørledningen karakteriseres vevets lokale kollagenarkitektur ved hjelp av multifotonmikroskopi (MPM) med andre harmoniske generasjon (SHG), og vevets feiloppførsel karakteriseres under uniaxiale strekkprøvingsbetingelser ved bruk av digital bildekorrelasjon (DIC) analyse. Denne eksperimentelle rørledningen muliggjør korrelasjon av den lokale dominerende vinkelen og spredningen av kollagenfiberorientering, bruddoppførselen og belastningsfingeravtrykkene til det fibrøse plakkvevet. Den oppnådde kunnskapen er nøkkelen til bedre å forstå, forutsi og forhindre aterosklerotiske plakkbruddhendelser.

Introduction

Iskemisk hjerneslag, ofte utløst av aterosklerotisk plakkruptur i halspulsårer, er en av de viktigste årsakene til dødelighet og sykelighet over hele verden1. Imidlertid inkluderer de nåværende kirurgiske behandlingsplanleggingsstrategiene for å forhindre ateroskleroserelatert hjerneslag ikke risikovurdering av plakkruptur2. Dette skyldes hovedsakelig at de tidligere foreslåtte risikobiomarkørene, som plakkhettetykkelse3 og lipidkjernestørrelse4, har vist seg å ha suboptimal prediktiv verdi for fremtidige kliniske hendelser 5,6. En bedre forståelse av plakkmekanikk og bruddmekanismer er nødvendig for å optimalisere risikovurdering av plakkbrudd og identifisere nye risikomarkører for aterosklerotiske plakk.

Plakkbrudd er en lokal mekanisk hendelse der det svært fibrøse plakkvevet ikke tåler den mekaniske belastningen som utøves på det av blodtrykket og mister sin strukturelle integritet7. Til tross for dette er mekanikken til plakkbruddhendelsen og dens kobling til den underliggende mikrostrukturen dårlig forstått8. De få eksperimentelle studiene som karakteriserte plakkvevssvikt har 9,10,11,12,13 rapporterte brutto mekaniske rupturegenskaper (dvs. ultimate strekksviktbelastning og styrke), avledet med antagelsen om strukturell homogenitet av vevet. Imidlertid er det fibrøse plakkvevet strukturelt heterogent, uten tvil hovedsakelig på grunn av lokal variasjon i kollagenfiberarkitekturen14. Videre ble koblingen mellom plakkvevets mekaniske sviktegenskaper og kollagenarkitekturen bare undersøkt i en nylig studie av Johnston et al. Forfatterne viste en interplakkforskjell i den dominerende fiberorienteringen og rapporterte høyere ultimate spenninger og lavere ultimate belastninger for fibrøse plakkhetteprøver med en overveiende omkretsfiberorientering15. Studien var imidlertid også begrenset til brutto mekaniske og strukturelle egenskaper.

For å belyse viktig informasjon om den lokale kollagenarkitekturen og lokale mekaniske egenskaper til det fibrøse plakkvevet, har vi i den nåværende studien utviklet en mekano-avbildningsrørledning. Denne ex vivo-rørledningen muliggjør kvantifisering av den lokale kollagenfiberretningen og dispersjonen, samt lokal bruddstamme. Rørledningen involverer MPM-avbildning med SHG for å avbilde kollagenfibre i plakkvevet, samt DIC- og uniaxial strekkprøving for å kvantifisere vevets bruddegenskaper.

Multifotonmikroskopi-andreharmonisk generasjon (MPM-SHG) har blitt en populær teknikk for å studere kollagen i biologisk vev16. Teknikken har mange fordeler sammenlignet med andre kollagenavbildningsteknikker, for eksempel histologi17, diffusjonstensoravbildning (DTI)14 og småvinklet lysspredning (SALS)15. For det første er MPM-SHG-avbildning ikke-destruktiv, noe som gjør den ideell å kombinere med mekanisk testing18. For det andre er SHG-signalet spesifikt for kollagen, og derfor er det ikke nødvendig med farging av vevet. På grunn av de lange eksitasjonsbølgelengdene (nær-infrarød) er penetrasjonsdybden større enn med andre mikroskopiteknikker16. Den høye oppløsningen (μm-nivået) oppnådd med SHG-avbildning tillater også visualisering av individuelle fibre. Dette gir mange muligheter, for eksempel lokal kvantifisering av antall kollagenfibre, kollagenfiberorientering og distribusjon19.

Digital bildekorrelasjon (DIC) kombinert med mekanisk testing er en mye brukt metode for å oppnå lokale mekaniske egenskaper til biologisk vev20. Med DIC spores forskyvningen av flekker påført på vevsoverflaten ved å sammenligne høyhastighetskamerabilder tatt under mekanisk testing20. Denne bildepostprosesseringsmetoden brukes til å estimere fullfeltoverflatestammene til prøven20 og kan også brukes til å studere bruddoppførselen til vevet21.

Protocol

Alle metodene beskrevet i denne artikkelen ble godkjent av Ethical Research Committee ved Erasmus Medical Center i Rotterdam; Informert samtykke ble innhentet fra pasienter før plakkprøvetaking. Et arbeidsflytdiagram over protokollen er gitt i figur 1.

1. Vevsinnsamling, mikrocomputertomografi (μCT) avbildning og testprøvepreparering

  1. Vevsinnsamling og lagring
    1. Samle ferske humane carotis aterosklerotiske plakkprøver fra samtykkende pasienter som gjennomgikk endarterektomi kirurgi.
      MERK: Plakkprøvene hentet fra denne operasjonen består av det syke intimalaget av halspulsåren, inkludert opphopning av fett (lipidpoolen) og forkalkninger22.
    2. Fjern blodrester ved hjelp av fosfatbufret saltvann (1x PBS) og tørk prøven med en gasbind.
    3. Plasser prøven i et 15 ml rør ved hjelp av pinsett. Snap-frys vevet ved å plassere røret i flytende nitrogen i 10 minutter.
    4. Etter snap-frysing, oppbevar prøven i en -80 ° C fryser til dagen for μCT-avbildning.
      MERK: Snap-frysing minimerer krystalldannelse, noe som fører til mikrostrukturelle skader i vevet. En tidligere studie på aortavev fra svin har vist at snap-frysing og lagring ved -80 °C ikke hadde noen signifikant påvirkning på vevets mekaniske egenskaper23.
  2. μCT-avbildning
    1. På dagen for μCT-avbildning, ta plakkprøven ut av 15 ml røret. Hvis vevet fester seg til røret, fyll røret med PBS ved romtemperatur. La vevet ligge i PBS til prøven kan tas ut av røret.
    2. Tørk plakkprøven grundig med silkepapir.
    3. Slå på μCT-systemet ved å trykke på den grønne knappen. Trykk oppvarming i CT-programvaren nederst på skjermen og vent 15 min.
    4. Plasser manuelt et røntgenfilter på Cu 0,06 mm + Al 0,5 mm i μCT-systemet.
    5. Velg mappen der bildene skal lagres.
    6. Velg parametrene i venstre panel. Bruk rullegardinlistene til å velge en skannetid på 4 minutter, en oppløsning på 172 μm, en spenning på 90 kV, en strømstyrke på 88 mA, et synsfelt på 86 mm og en rotasjon på 360°.
    7. Åpne døren til enheten. Trekk plattformen ut manuelt.
    8. Sett parafilm på plattformen og plasser prøven på plattformen (mot den ytterste delen av plattformen).
    9. Plasser plattformen manuelt i enheten og lukk døren.
    10. Aktiver live-modus (øyeikon ). Flytt plattformen med pilene i enheten for å sentrere prøven i FOV.
    11. Start bildebehandling (ikonet nederst i midten). Når avbildningen er ferdig, trykker du på dørikonet nederst (under avbruddsknappen ).
    12. Etter μCT-skanningen, snap-frys plakkprøven igjen som beskrevet i trinn 1.1.3. Oppbevares ved -80 °C frem til dagen for multifotonmikroskopiavbildning og mekanisk testing.
    13. Åpne de anskaffede DICOM-filene til μCT-bildebehandlingen i 3D Slicer-programvaren med åpen kildekode24.
    14. Gå til Segmentredigering . Velg opprett en ny segmentering | volumet som skal analyseres som et mastervolum.
    15. Klikk på Legg til for å legge til et segment. Trykk på navnet og fargen for å endre disse parametrene.
    16. For å definere segmentene, klikk på effekter | terskel nederst i vinduet. Bruk dette terskelverktøyet til å skille mellom forkalkede (>450 HU) og ikke-forkalkede (<450 HU) vevsregioner. Når terskelen er valgt, trykker du på Bruk i den nederste delen.
    17. Trykk Vis 3D (like til høyre for Legg til) for å visualisere segmenteringen i 3D-visningen. Hvis det er områder av segmenteringen som ikke er ønsket, fjern dem med sakseffekten .
    18. Endre opasiteten til segmenter i segmenteringsmodulen ved å klikke på navnet på ønsket segmentering.
      MERK: Hvis mulig, kan μCT-avbildning og gjennomgang av μCT-bildene utføres samme dag som resten av protokollen. I så fall hopper du over trinn 1.2.12. Vær imidlertid oppmerksom på at de påfølgende trinnene i denne protokollen også er tidkrevende og bør utføres samme dag. Etter litt øvelse, og med de beskrevne innstillingene og vevet, bør μCT-avbildning ta ~ 45 min, gjennomgang av μCT-bildene ~ 15 min, testprøvepreparering av en enkelt testprøve ~ 1 h, mikroskopi ~ 4 h og uniaxial strekkprøving ~ 2 timer.
  3. Forberedelse av testprøve
    1. På dagen for kollagenavbildning og mekanisk testing, tine plakket ved nedsenking i PBS ved romtemperatur i ca. 10 minutter.
    2. Åpne 3D-konstruksjonen av plaketten som ble opprettet i trinn 1.2.13–1.2.18 i 3D-slicerprogramvaren.
    3. Bruk de naturlige landemerkene i plakkvevet til å identifisere hvilke deler av 3D-rekonstruksjonen som tilsvarer den virkelige plakkprøven. Identifiser hvilket område av 3D-rekonstruksjonen som ikke inneholder forkalkninger, og identifiser dette området visuelt på den virkelige plaketten.
    4. Klipp plakkene åpne langs arteriens lengdeakse ved hjelp av kirurgisk saks og pinsett. Hvis et kutt allerede er tilstede fra operasjonen, start fra dette kuttet for optimal bruk av vevet. Hvis prøven ikke har en rørformet form og det er vanskelig å definere lengderetningen, utelukker du prøven fra testing.
    5. Klipp ut rektangulære testprøver fra plakkprøvene. Sørg for at testprøvene er så store som mulig, samtidig som du unngår vevsområder som inneholder rifter eller forkalkninger. Vær forsiktig under denne skjæringen, da en liten rift eller sprekk i kanten av testprøven kan føre til sprekkutbredelse fra den eksisterende sprekken under strekkprøving.
    6. Kontroller at testprøvene har et bredde-til-lengde-forhold (WL) på <1 i målerlengden når de er montert i strekktesteren. Hvis prøvene oppfyller dette kravet, er de egnet for passende strekkprøver når det gjelder grensebetingelser25.
      MERK: Utvalget i prøvedimensjonene kan være stort. Prøvene som forfatterne testet hadde en målerlengde som varierte mellom 3, 4 og 12, 9 mm og en bredde som varierte mellom 1, 6 og 6, 4 mm.

2. Multifoton mikroskopi avbildning

  1. Forberedelser
    1. Før dagen for kollagenavbildning og mekanisk testing, del 40 g silikonelastomerbase over to 50 ml rør og tilsett 2 g herdemiddel til hvert rør (forhold på 1:10) ved hjelp av en Pasteur-pipet. Bland de to komponentene med pipetet.
    2. Sentrifuger rørene i 1 min ved 700 × g for å fjerne så mange luftbobler som mulig.
    3. Fyll en petriskål (10 cm diameter) med et tynt lag (ca. 0,5-1 cm) silisium og rug den enten i ovnen ved 65 °C i 3 timer eller legg den i romtemperatur i 48 timer.
    4. Ta en plakkprøve og fest begge endene til silisiumet ved å feste nåler i vevet (figur 2A). Forsikre deg om at den luminale siden av prøven vender oppover. Sett nålene i området av prøven som skal være i klemmene på strekkprøvingsenheten under den mekaniske testingen.
    5. Ta på vernebriller. Bruk en sidekutter for å forkorte nålene slik at de stikker ut mindre enn noen få millimeter over prøveoverflaten, for å forhindre at de skader mikroskopmålet. Fyll petriskålen med PBS til prøven er nedsenket.
  2. Oppsett av mikroskopi
    1. Pass på at et riktig mål er montert på multifotonmikroskopet. Bruk et objektiv optimalisert for å overføre infrarødt lys, med en forstørrelse på 20x.
    2. Start opp mikroskopsystemet. Åpne mikroskopets operativsystemprogramvare.
    3. Når du blir bedt om å initialisere bildetabellen, må du sørge for at mikroskoparden, kondensatorarmen skyves tilbake og at målet er i laveste posisjon.
    4. Aktiver multifotonlaseren.
    5. Sett petriskålen med testprøven under målet, som i figur 3. Pass på at du ikke plasserer målet over prøven ennå, da laserinnstillingene fortsatt må optimaliseres. Ellers kan laserlysets mulige høye effekt føre til skade på vevet.
    6. Pass på at målet er litt nedsenket i PBS. Bruk en pipette for å legge til ekstra PBS om nødvendig.
    7. Sett lysbølgelengden til 880 nm.
      MERK: Denne bølgelengden er valgt fordi SHG-utslippsfilteret i det brukte to-foton systemet har en senterbølgelengde på ca. 440 nm. For andre mikroskoper kan en annen bølgelengde være mer aktuelt.
  3. Flisskanning og valg av bildeplasseringer
    1. Slå av multifotonlaseren og aktiver mikroskopets lysfeltmodus . Slå deretter på live skannemodus .
    2. Plasser trinnet slik at målet er plassert over prøven, og bring prøveoverflaten i fokus. Slå av live skannemodus.
    3. Under oppkjøpsfanen , i det andre panelet, endrer du zoomfaktoren til 1 ved å skyve den tiltenkte linjen.
      MERK: Denne zoomfaktoren, sammen med forstørrelsesfaktoren til objektivet (20x), bestemmer størrelsen på det tatte bildet (739 μm x 739 μm).
    4. Under oppkjøpsfanen , i det andre panelet, endrer du skannehastigheten til 400 Hz, linjegjennomsnittet til 1 og oppløsningen til 128 x 128 piksler per bilde (pikselstørrelse på ~ 5.8 μm x 5.8 μm) ved hjelp av rullegardinlistene.
    5. Under anskaffelsesfanen , i det første panelet, klikker du på rastermønstersymbolet og venter på at et flisskanningspanel vises.
    6. Slå på live scan-modus . Flytt målsettingen til et hjørne av prøven ved hjelp av knottene på smartpanelet, og klikk symbolet Merk plassering i panelet for flisskanning. Gjenta dette for hvert hjørne av prøven. Hvis det utføres riktig, vises et rutenett med alle valgte fliser for avbildning i oransje.
    7. Slå av funksjonen for automatisk søm .
    8. Klikk Start nederst til høyre på skjermen for å opprette en flisskanning av hele prøveoverflaten for å få en oversikt over prøvegeometrien.
      MERK: Basert på de beskrevne innstillingene, vevet og mikroskopsystemet, tar det ~10 minutter å anskaffe en flisskanning av hele prøveoverflaten.
    9. Etter flisskanningen, observer x- og y-koordinatene til øvre venstre hjørne av hver flis i flisskanningspanelet, vist automatisk av programvaren til mikroskopisystemet. Legg merke til disse koordinatene i et regneark.
    10. I mikroskopprogramvaren, i flisskanningspanelet, observer antall fliser i x- og y- retningene i boksen som heter scanfield. Legg merke til størrelsen på flisskanningen i regnearket. Beregn koordinatene til de andre flisene ved å legge til / trekke fra størrelsen på flisen (739 μm).
      MERK: Disse koordinatene er nødvendige for å identifisere den nøyaktige plasseringen av flisene som skal skannes med SHG-bildebehandling. Hvis den totale bildetiden ikke er et problem, kan alle fliser avbildes uten å hoppe over noen fliser.
    11. Fra flisskanningen velger du flisene som skal avbildes med SHG-bildebehandling. For dette valget bør du unngå fliser som skal være i klemmene, og la det være én flis mellom hver valgte flis i både lengde- og omkretsretningen, som vist i figur 2B.
  4. Visualisere kollagen: SHG-avbildning
    1. Slå av lysene i rommet og dekk mikroskopstadiet med blackout stoff også at ikke lys fra rommet når detektoren.
      MERK: Minimering av lys som når detektorene vil redusere støyen under bildeopptak.
    2. Slå på multifotonlaseren (MP).
    3. Velg den ikke-skannede deteksjonsdetektoren (NDD) som er utstyrt med et 430-450 nm båndpassfilter.
    4. Identifiser plasseringen av flisene som skal avbildes, ved hjelp av informasjonen som ble hentet inn i trinn 2.3.10. Fyll ut koordinatene i de angitte boksene, og klikk Enter, slik at målsettingen flyttes til høyre flis. Slå på live scan-modus.
      MERK: Med andre mikroskoper eller nyere versjoner av operativsystemet kan du flytte til steder i flisskanningen automatisk. I dette tilfellet er det ikke nødvendig å notere x- og y-koordinatene til hver flis (trinn 2.3.10) og fylle ut koordinatene i operativsystemet (trinn 2.4.4).
    5. Øk MP-lasereffekten ved å bruke glidebryteren i det øvre panelet under strålebaneinnstillinger for å få høyest mulig lasereffekt uten betydelig bleking. Deretter justerer du detektorforsterkningen for å få lyse bilder, men uten mettede piksler, ved å bruke knappen på smartpanelet eller ved å klikke på navnet på detektoren under strålebaneinnstillinger | ekstra kanaler. Typiske verdier for detektorforsterkningen er mellom 500 og 800 V.
    6. Bruk z-posisjonsknappen på smartpanelet til å justere fokusplanet.
    7. Gå til toppen av prøven og angi posisjonene til toppen av z-stacken ved å klikke på pilspissen i z-stack-panelet (under acquisition-fanen | 3. panel).
    8. Deretter fokuserer du på prøven til SHG-signalet ikke lenger oppdages - dette er slutten på stabelen. Igjen, klikk på pilspissen i z-stack-panelet for å angi denne posisjonen. Når du er ferdig, slår du av live scan-modus.
      MERK: Vevet kan ikke være helt flatt. Derfor kan prøveoverflaten av forskjellige regioner i vevet ha litt forskjellige posisjoner i z-retningen.
    9. Under oppkjøpsfanen , i det andre panelet, hold skannehastigheten på 400 Hz, sett linjegjennomsnittet til 2 og oppløsningen til 512 x 512 piksler per bilde (pikselstørrelse på ~ 1.4 μm x 1.4 μm) ved hjelp av rullegardinlistene. Slå på den toveis X-skanneknappen.
    10. Klikk på z-trinn størrelse i z-stack panelet og fyll en z-trinn størrelse på 3 μm i boksen. Klikk på start nederst til høyre på skjermen for å opprette en z-stack. Når du er ferdig, må du huske å lagre koordinatene til flisen i filnavnet eller gi hver flis sitt eget nummer (som i figur 2B).
      MERK: Basert på de beskrevne innstillingene, vevet og mikroskopsystemet, tar anskaffelsen av en z-stabel av en enkelt flis ~ 10-15 min. Forberedelsestrinnene (trinn 2.4.4-2.4.10) er inkludert i dette tidsestimatet.

3. Mekanisk testing

  1. Klargjøring av uniaxial strekkprøvingsoppsett
    1. Gjør oppsettet for horisontal strekkprøving (figur 4) klart til bruk ved å følge instruksjonene for strekktesteren (f.eks. slå på programvare, feste klemmer, feste lastcelle).
    2. For å minimere glidningen av testprøven, fest tosidig skumtape (figur 4A, B-2) til innsiden av klemmene til strekktesteren og sandpapir på innsiden av skumbåndet. Etter hvert vil sandpapiret være i kontakt med testprøven.
    3. Sett varmebadet (figur 4A, B-3) på plass. Fyll varmebadet med PBS opp til nivået på klemmens bunnflate, slik at det ikke når sandpapiret ennå.
    4. Slå på strømkilden til varmebadet og sett temperaturen på rundt 37 °C.
    5. Monter høyhastighetskameraet over strekkprøvingssystemet (figur 4A-4), for eksempel ved hjelp av et laboratoriestativ, og monter et objektiv med en brennvidde på 50 mm på kameraet gjennom en forlengelsesring.
    6. Forsikre deg om at klemmene er i fokus, og at synsfeltet er stort nok til å registrere prøven under hele strekkprosedyren (FOV-bredde: ± prøvebredden; FOV lengde: ± 2x prøvelengden).
    7. Monter belysningssystemet (figur 4A-5) over strekkprøvingssystemet, for eksempel ved hjelp av et laboratoriestativ. Slå på belysningssystemet og juster lysintensiteten og plasseringen slik at det ikke er noen refleksjoner på PBS-overflaten som skal observeres på kamerabildet.
    8. Juster eksponeringstiden og forsterkningen til kameraet for å få klare bilder.
    9. Sett bildeopptaksprogramvaren til å fange med 30 bilder / s med en oppløsning på 5,2 MP.
      MERK: Denne høye bildefrekvensen er nødvendig for å utføre den påfølgende DIC-analysen og studere bruddoppførselen.
    10. Still inn forskyvningshastigheten til en av klemmene slik at den globale tekniske belastningshastigheten under mekanisk testing ligner vevets fysiologiske belastningshastighet
      (5 %/s for plakkvev26).
  2. Generering av flekkmønster
    MERK: Denne speckle mønsterprotokollen er basert på tidligere arbeid av Walsh et al.27.
    1. Tørk prøven ved å tørke den lett med silkepapir.
    2. Sett det svarte vevsfargestoffet i den tiltenkte bøtte på airbrush.
    3. Koble airbrush til kompressoren. Slå på airbrush-kompressoren og sett trykket til 25 PSI.
    4. Prøv å lage et optimalt flekkmønster på papir før du sprayer på vevet. Spray noen ganger til et svart/hvitt forhold på 50:5028 er oppfylt. Beveg nålen på airbrush frem og tilbake for å justere ruheten på flekkmønsteret til størrelsen på en flekk er lik størrelsen på 3-5 piksler på høyhastighetskameraet 29.
      MERK: Flekkmønsteret vil bli brukt til to forskjellige formål. For det første måles forskyvningen av disse flekkene ved å sammenligne høyhastighetskamerabilder tatt under mekanisk testing (DIC, trinn 4.2). For det andre brukes dette flekkmønsteret til å identifisere bruddstedet på bildet av prøvens udeformerte tilstand (trinn 4.3.1).
    5. Hold airbrushen ca. 30 cm unna testprøven og spray på luminaloverflaten.
    6. La fargestoffet binde seg til prøven i 1 min ved romtemperatur før prøven senkes i PBS.
  3. Uniaxial strekkprøving
    1. Plasser prøven i klemmene til strekktesteren, med omkretsretningen av prøvene justert med strekkstrekkeretningen og luminalsiden av prøven vendt oppover. Forsikre deg om at den opprinnelige målerlengden er satt slik at WL-forholdet mellom strimlene er <1.
    2. Stram skruene på grepene ved å påføre et dreiemoment på 20 cNm ved hjelp av en momentskrutrekker. Gjør dette gradvis ved å påføre et lite dreiemoment på hver skrue før du bruker det endelige dreiemomentet.
    3. Inspiser visuelt om prøven inneholder rifter som kan påvirke testene.
    4. Innfør mer PBS i varmebadet til prøven er nedsenket, og vent til temperaturen på PBS har nådd 37 °C igjen.
    5. Skaff deg et kalibreringsbilde med høyhastighetskameraet, der testprøven og en linjal er inkludert som referanse. Kontroller at linjalen er i samme avstand fra kameramålet som den lyse overflaten på prøven.
    6. Ta vare på lastcellen og begynn å registrere de globale kraft- og forskyvningsmålingene fra lastcellen og aktuatoren til strekktesteren.
    7. Rett prøven ved å bruke en prestrekk på 0,05 N for å bli kvitt slakk i prøven. Utfør 10 sykluser med forkondisjonering opp til 10 % belastning basert på måling av målerlengde av aktuatoren etter påføring av prestretch.
    8. Start uniaxial strekkprøving til prøven mislykkes fullstendig, mens du tar opp en video av prøvedeformasjonen med høyhastighetskameraet. Etter vevssvikt, stopp registreringen av de globale kraft- og forskyvningsmålingene.
      MERK: Noen kommersielle strekktestere kan utføre trinn 3.3.6-3.3.9 automatisk. Den gjeldende protokollen beskriver de manuelle trinnene som skal tas hvis dette automatiske alternativet ikke er inkludert i strekktesteren som brukes.
    9. Fjern testprøven fra strekkprøveenheten og kast den på riktig måte.
    10. Når du tester neste prøve, bytter du ut sandpapir og skumbånd på klemmene.

4. Dataanalyse

  1. Kollagen organisasjonsanalyse
    1. Åpne z-stakkene som hentes under MPM med SHG i ImageJ, og opprett MIP-er (maksimal intensitetsprojeksjoner) for hver z-stakk.
    2. Analyser hver MIP med åpen kildekode MATLAB-basert FOA (Fiber Orientation Analysis) verktøy30 for å måle orienteringsvinkelen til de individuelle kollagenfibrene som er tilstede i flisene. Bruk følgende parametere: Vekter: [3 4 5] eller [2 4 6], avhengig av fartøyets diameter, og fartøyets terskel: 0,999, 0,9995 eller 0,9999, avhengig av intensiteten til SHG-signalet.
      MERK: Flere detaljer om hvordan du bruker dette verktøyet finner du i programvarens håndbok31.
    3. Bruk et annet MATLAB-basert verktøy med åpen kildekode, FibLab32, for å tilpasse en gaussisk fordeling til vinkelfordelingshistogrammet.
      MERK: Flere detaljer om hvordan du bruker dette verktøyet finner du i programvarens håndbok32.
    4. Fra det gaussiske distribusjonsplottet oppnådd ved hjelp av FibLab, trekk ut følgende strukturelle parametere fra arbeidsområdet til MATLAB: den dominerende fibervinkelen (μ p), som er fordelingsmåten, standardavviket (σp) av fibervinkelfordelingen og den anisotrope fraksjonen (Pani = 1 - Piso).
      MERK: Den isotrope fraksjonen er arealet under grunnlinjen i den gaussiske fordelingen, mens den anisotrope fraksjonen inneholder arealet av toppen på toppen av grunnlinjen33. Både σp og Pani gir informasjon om spredningen av fibrenes orientering i flisområdet.
    5. For visuell inspeksjon tegner du inn μp ved hjelp av orienterte linjer og σp og Panived hjelp av fargekart.
  2. Digital bildeanalyse og bruddanalyse
    1. Utfør visuell inspeksjon på kamerabildene for å identifisere rammen der bruddinitiering oppstår. På denne rammen identifiserer du bruddstedet visuelt.
    2. Utfør visuell inspeksjon på kamerabildene for å identifisere eventuelle sprekker eller rifter på bruddstedet ved starten av mekanisk testing. Hvis en slik tåre er tilstede, ekskluder prøven fra analysen.
    3. Utfør DIC-analysen med den åpen kildekode, MATLAB-baserte programvaren Ncorr (v1.2)34. Følg trinnene i Ncorr manual35.
      1. Bruk kamerabildene som er tatt under strekkprøven med høyhastighetskameraet for DIC. Merk det siste bildet før den endelige strekkingen til feil (etter forhåndskondisjonering) som referansebilde. For de gjeldende bildene velger du alle bildene fra starten av den siste strekkingen til den siste rammen før rammen der bruddet startet.
      2. Velg prøveflaten som interesseområde (ROI). Ekskluder områdene som er nær (ca. 1 mm) klemmene, da belastningene i disse områdene vil bli sterkt påvirket av grepene.
      3. Utfør DIC-analyse ved hjelp av følgende parametere: Delmengde radius: 30 piksler; Delmengde avstand: tre piksler; Iterasjon cutoff: 50; Normen for forskjellen vektor cutoff: 10-5; Stamme radius: 5; Automatisk forplantning, trinn #: 5.
      4. Fra DIC-analysen med Ncorr, oppnå Green-Lagrange (eller Eulerian stamme) fordelinger av avkastningen. Bruk disse tøyningsfordelingene til å beregne den gjennomsnittlige Green-Lagrange-belastningen av hele plakkprøveoverflaten ved det siste bildet før brudd. Beregn Green-Lagrange-belastningen på bruddstedet.
  3. Korrelerer strukturelle og mekaniske data på bruddstedet
    1. Bruk de naturlige landemerkene i testprøven og de anvendte flekkene i testprøven, identifiser bruddplasseringen (identifisert i trinn 4.2.1) på referansebildet (trinn 4.2.3.1).
    2. Bruk de naturlige landemerkene i testeksemplet, og lag et overlegg av referansebildet og flisskanningen (trinn 2.3) for å identifisere bruddplasseringen på flisskanningen. Identifiser MPM-SHG-flisen der bruddet skjedde. Hvis bruddet ikke er i en flis som er skannet med MPM-SHG, identifiserer du flisen nærmest bruddplasseringen. Få de strukturelle parametrene som ble funnet ved flisen der brudd oppstod.

Representative Results

Vevsinnsamling og forberedelse av testprøve
Vevssamlingen gir plakkfibrøse vevsprøver som kan dissekeres i individuelle testprøver for strukturell avbildning og uniaxial strekkprøving. Ideelt sett inneholder en samlet fibrøs vevsprøve områder med liten eller ingen tårer (figur 5A) og makroforkalkninger (figur 5B). Et overskudd av disse riftene og forkalkningene (figur 5C) kan føre til plakkprøver som ikke oppfyller det tidligere nevnte kravet til prøvedimensjon i WL 1.

Multifotonmikroskopiavbildning
SHG-avbildning og bildebehandling gir MIP-er fra hver bildeflis (figur 6A,B). Videre etterbehandling ved hjelp av fiberdeteksjon (figur 6C) gir fiberorienteringshistogrammer (figur 6D) hvorfra kollagenstrukturelle parametere kan ekstraheres (figur 6E). I tillegg kan fargekart som viser de lokale strukturelle kollagenparametrene over hele plakkprøven fås for visuell analyse (figur 6F, G). For den representative testprøven i figur 6 er det funnet en stor intrasample variasjon i de strukturelle kollagenparametrene (gjennomsnittlig ± SD på μ p = -34° ± 32°; σp = 21° ± 4°; Pani = 0,49 ± 0,14, hvis omkretsretningen er definert som 0°). Denne intrautvalgsvariasjonen understreker viktigheten av å oppnå lokale strukturelle parametere i stedet for å anta homogenitet.

Mekanisk testing
Ruptur oppførsel
Høyhastighetskameraet gir bilder av deformasjons- og rupturoppførselen til plakkprøvene under mekanisk testing (figur 7). Fra disse bildene kan plasseringen av bruddinitiering og bruddutbredelsesbanen identifiseres. Resultatene for identifisering av brudd er suboptimale hvis det er bobler eller refleksjoner i kamerabildene, eller hvis bruddet forplanter seg for fort til å fanges opp av den valgte bildefrekvensen.

Lokale belastningsmønstre
Digital bildekorrelasjonsanalyse på kameraopptakene som ble tatt under uniaxial strekkprøving gir de lokale vevsdeformasjonskartene, for eksempel Green-Lagrange-belastningskartene vist i figur 8. Disse kartene viser de tre belastningskomponentene (εxx, εxy og εyy) ved rammen før bruddstart. Fra disse belastningskartene kan de gjennomsnittlige stammene i et område av interesse og lokal belastning på et sted, for eksempel bruddsted, trekkes ut.

For det representative utvalget i figur 8 viser de lokale stammedataene stor intrautvalgsvariasjon. For den representative testprøven i figur 8 er det funnet en stor intrasample variasjon i de lokale stammene (områdene av de observerte stammene er som følger: εxx = -0,30-0,17; εxy = -0,13-0,20; εyy = 0-0,40). Dette understreker viktigheten av å skaffe lokale data i stedet for brutto, gjennomsnittsverdier oppnådd med antagelsen om vevshomogenitet.

Korrelerer mekanisk og strukturell vevsinformasjon
De ovennevnte resultatene tillater tilknytning av vevets lokale deformasjon og bruddoppførsel til kollagenarkitekturen. Når bruddstedet er identifisert på kameraopptakene (figur 9A), kan det tilordnes tilbake til referansekamerabildet (figur 9B) og til mikroskopiflisskanningen (figur 9C). Dette gir MPM-SHG-flisen der bruddet skjedde, og de strukturelle parametrene som finnes ved denne flisen (figur 9D). De strukturelle parametrene funnet i flisen der brudd oppstod i et representativt utvalg, vist i figur 9, er μ p = 28°, σp = 19° og Pani = 0,6. Den samme prosedyren kan også brukes på de ikke-ruptured vevsstedene. Det er viktig å merke seg at kartlegging av bruddsted på referansebildet fra bruddrammen kan være utfordrende ved dårlig flekkmønster og uklare naturlige landemerker. I tillegg, hvis de naturlige landemerkene til vevet ikke er tydelige nok, kan det være vanskelig å registrere flisskanningsoverlegget og høyhastighetskamerabildene.

Figure 1
Figur 1: Arbeidsflytdiagram over den presenterte eksperimentelle protokollen. Klikk her for å se en større versjon av denne figuren.

Figure 2
Figur 2: Valg av fliser for SHG-avbildning fra flisskanningen . (A) Testprøve festet i silisium. (B) Flisskanning av testprøven oppnådd ved brightfield-mikroskopi. Flisene som er valgt for SHG-avbildning, er merket med blå firkanter. (C) Maksimal intensitetsprojeksjon av MPM med SHG. Skala bar = 140 μm (C). Forkortelser: SHG = andre harmoniske generasjon; MPM = multifotonmikroskopi. Klikk her for å se en større versjon av denne figuren.

Figure 3
Figur 3: Plakkprøve plassert under formålet med multifotonmikroskopet. Plasseringen av plakkprøven er sikret med en fosfatbufret saltvannsfylt petriskål. Klikk her for å se en større versjon av denne figuren.

Figure 4
Figur 4: Spesialdesignet uniaxial strekktester med sine forskjellige komponenter angitt . (A) Total oversikt over systemet. Legg merke til at sandpapirinnsatsene i klemmene er synlige da bare bunnklemmene er festet. (B) Zoomet inn bilde av klemmene til strekktesteren med testprøven klar for testing. Forkortelser: PVC = polyvinylklorid; LED = lysemitterende diode. Klikk her for å se en større versjon av denne figuren.

Figure 5
Figur 5: Vevsinnsamling og prøveprepareringsresultater fra representative prøver. (A) Fersk og intakt plakkprøve, hentet fra samtykkende pasienter som gjennomgikk endarterektomikirurgi carotis. (B) 3D-rekonstruksjon fra en μCT-skanning. Forkalket vev er vist i lyseblått og ikke-forkalket i rødt. En optimal prøve uten forkalket vev kunne fås fra området mellom de blå linjene. (C) 3D-rekonstruksjon fra μCT-skanningen som viser et suboptimalt plakk med overskudd av forkalket vev. Skala bar = 3 mm. Forkortelse: μCT = mikrocomputertomografi. Klikk her for å se en større versjon av denne figuren.

Figure 6
Figur 6: MPM-SHG-resultater fra et representativt utvalg. (A) Oversikt over flisskanning; De valgte flisene for avbildning vises i blått. (B) MIPs fra forskjellige fliser. (C) Fiberdeteksjon av FOA-verktøyet fra en valgt flis (# 1). (D) Histogram for fiberretning fra en valgt flis. (E) Fiberorienteringshistogram + Gaussisk passform, hvorfra kollagenstrukturelle parametere kan ekstraheres fra en valgt flis. (F) Representasjon av μ p (retning svart linje) og σp (bakgrunnsfarge) over hele plakkprøven. (G) Representasjon av μp (retning svart linje) og Pani (bakgrunnsfarge) over hele plakkprøven. Skalastenger = 140 μm (B,C). Forkortelser: MPM-SHG = multifotonmikroskopi-sekund-harmonisk generasjon; MIPs = maksimal intensitetsprojeksjoner; FOA = fiberorienteringsanalyse; μp = dominerende fibervinkel; Pani = anisotrop fraksjon; σp = standardavvik for fibervinkelfordelingen; Piso = isotrop fraksjon. Klikk her for å se en større versjon av denne figuren.

Figure 7
Figur 7: Rupturinitiering og forplantning i en plakkvevsprøve under strekkprøven.1) Prestretched state, intakt vev. 2) Ruptur initiering-første ramme der brudd observeres. Startstedet for bruddet er markert med en rød firkant. 3 ) og 4) Rupture forplantning. 5) Fullstendig ruptur av plakkprøven. Skalastenger = 1 mm. Klikk her for å se en større versjon av denne figuren.

Figure 8
Figur 8: Green-Lagrange-tøyningsmønstre av et representativt utvalg (εxx, εxy og εyy) ved rammen før ruptur, oppnådd med DIC-analyse. Gjennomsnitt og standardavvik over hele plakket angis, sammen med belastningen på bruddstedet. Forkortelser: DIC = digital bildekorrelasjon; εxx = langsgående belastning; εxy = skjær; εyy = strekkbelastning. Klikk her for å se en større versjon av denne figuren.

Figure 9
Figur 9: Overleggsbilde av bruddplasseringen (rød firkant) på bilder. (A) Høyhastighets kamerabilde, der brudd identifiseres (bruddramme). (B) Høyhastighets kamerabilde, der bare prestretch er brukt (referanseramme). (C) Flisskanningsbildet oppnådd via mikroskopi. (D) Et fargekodet kart som viser lokale kollagenstrukturelle parametere ved forskjellige fliser. De μp (retning svart linje) og Pani (bakgrunnsfarge) over hele plakkprøven presenteres. Forkortelser: μp = dominerende fibervinkel; Pani = anisotrop fraksjon. Klikk her for å se en større versjon av denne figuren.

Discussion

Den nåværende studien fokuserte på å utvikle en mekano-imaging rørledning for å studere sammenhengen mellom lokal kollagenorientering og dispersjon, lokale mekaniske egenskaper og bruddoppførsel av fibrøst aterosklerotisk plakkvev. Protokollen beskrevet her er nyskapende av flere grunner. For det første er dette første gang digital bildekorrelasjon har blitt brukt til å måle lokal deformasjon av fibrøst plakkvev under mekanisk belastning. For det andre gir denne protokollen den nødvendige informasjonen for å analysere sammenhengen mellom det lokale deformasjonsmønsteret og den lokale kollagenarkitekturen i det fibrøse plakkvevet. Betydningen av den lokale vurderingen understrekes av både tøyningsdataene og kollagendataene som presenteres i resultatdelen, som viser vevets heterogene natur. Derfor anbefales bruk av teknikker som muliggjør lokal vurdering, slik som de som brukes i denne protokollen, for fremtidige studier av fibrøse plakkegenskaper.

Forberedelse av testprøver er blant de kritiske trinnene i denne protokollen. Caroteplakk er hovedsakelig kollagenøst vev; Imidlertid kan de inneholde forkalkninger som anses å påvirke den generelle plakkmekaniske oppførselen36,37. Siden studien fokuserer på den fibrøse vevskomponenten i plakket, unngås forkalkninger i testprøvene ved å bruke μCT-avbildning38. Hvis μCT ikke er tilgjengelig, kan andre bildebehandlingsteknikker som MR eller OCT39 vurderes for å oppdage de forkalkede områdene i plakket. Innhenting av fibrøse vevsprøver som er fri for forkalkninger og er av stor nok størrelse som kan brukes til mekanisk testing, kan være en utfordrende oppgave for plakk som er tungt forkalket eller inneholder dispergerte forkalkninger. En annen utfordrende oppgave i protokollen er å generere et optimalt flekkmønster for digital bildekorrelasjon. Optimal DIC krever et svart/hvitt-forhold på 50:5028 og flekker størrelsen på tre til fem piksler29 for å sikre riktig kvalitet. Unnlatelse av å oppfylle disse kravene kan føre til unøyaktige lokale belastningsmålinger. Til slutt kan det være utfordrende å kartlegge bruddplasseringen til SHG-bildene hvis de naturlige landemerkene til et vev ikke er klare. For slike prøver vil påføring av flere fiducialmarkører på vevet før avbildning være nyttig.

MPM-SHG-teknikken som brukes i den nåværende protokollen er overlegen mange andre kollagenavbildningsteknikker, da det er en høyoppløselig og ikke-destruktiv teknikk med relativt stor penetrasjonsdybde. Likevel utgjør penetrasjonsdybden (<400 μm) til MPM-SHG en begrensning, da den ikke tillater avbildning av hele tykkelsen på testprøvene, som varierte mellom 0,5 og 2 mm. I en nylig studie med diffusjonstensor magnetisk resonansavbildning (DT-MR) har vi vist at den dominerende fiberorienteringen i de dypere delene av plakkvevet kan være forskjellig fra den i de mer overfladiske, luminale delene av vevet14. Derfor er videre studier berettiget til å undersøke den lokale kollagenarkitekturen i de dypere delene av tykke fibrøse plakkvevsprøver og dens forhold til den lokale vevsmekanikken. Til dette formål kan polarisert romlig frekvensdomeneavbildning (pSFDI) benyttes. Denne nylig utviklede optiske bildebehandlingsteknikken ble rapportert å ha potensial til å måle fiberorientering så dypt som 0,8 mm i mitralventilbrosjyrer12. pSFDI tilbyr også en rask anskaffelse, som også kan lette visualisering av hele prøveområdet i stedet for bare et utvalg fliser, slik tilfellet er i den nåværende protokollen. En annen begrensning ved gjeldende protokoll er at bare overflatedeformasjon kunne identifiseres. I fremtidige studier kan speilassistert multi-view DIC40 eller digital volumkorrelasjon (DVC)41 inkluderes i denne protokollen for å få ytterligere informasjon om volumetriske stammer i undergrunnen.

Den nåværende eksperimentelle protokollen kan utvides eller modifiseres ytterligere på flere måter for å få ytterligere informasjon om plakkbruddmekanikk og dens forhold til den underliggende mikrostrukturen. For det første inkluderer den nåværende protokollen uniaxial strekkprøving i omkretsretningen. Denne typen mekanisk testing ble valgt siden plakket hovedsakelig opplever strekkstrekk i omkretsretningen in vivo. For mer omfattende mekanisk karakterisering kan denne protokollen utvides ytterligere til å omfatte inflasjonstesting, biaksial testing eller uniaxial strekkprøving i lengderetningen. For det andre fokuserer den nåværende protokollen bare på å skaffe lokale stammer gjennom DIC. Imidlertid kan en mer fullstendig oversikt over plakkets mekaniske oppførsel oppnås ved også å inkludere lokal spenningsanalyse i protokollen, men dette krever karakterisering av lokal stivhet. Selv om det for tiden er utfordrende, kan dette oppnås ved beregningsteknikker som den inverse endelige elementmetoden 42,43 og den virtuelle feltmetoden44. Bortsett fra eksperimentell tilpasning, kan noen ekstra etterbehandlingstrinn også legges til den nåværende protokollen. For det første, i stedet for bare å identifisere bruddstedet, kan sprekkutbredelsesbanen identifiseres via de oppnådde høyhastighetskamerabildene. Denne forplantningsbanen kan korreleres med lokale strukturelle og mekaniske parametere. For det andre ble bruddinitieringsstedet visuelt identifisert i den beskrevne protokollen. En tidligere studie på ikke-biologiske vev har brukt diskontinuiteter i DIC-stammemålinger for å oppdage brudd45. Bruk av slik automatisert brudddeteksjon på plakkvev kan muligens forbedre nøyaktigheten av brudddeteksjonen. Endelig er en stor fordel med MPM-SHG sammenlignet med andre kollagenavbildningsteknikker at den visualiserer individuelle kollagenfibre. Derfor kan dataene oppnådd via denne protokollen også brukes til å undersøke ytterligere lokale kollagenegenskaper, for eksempel kollageninnholdet.

Denne protokollen kan brukes til å gi en bedre forståelse av de lokale egenskapene til fibrøst plakkvev, komponenten som mekanisk svikter ved plakkbrudd in vivo. Denne informasjonen er nødvendig for å etablere nye strukturelle og funksjonelle bildemarkører som forutsier plakkbrudd hos pasienter. Disse nye markørene er nødvendige, siden de tidligere foreslåtte risikobiomarkørene har vist seg å ha suboptimal prediktiv verdi for fremtidige kliniske hendelser 5,6. I fremtiden kan OCT og ps-OCT muligens identifisere og kvantifisere fibrøst vev i arteriesystemet46,47,48. I tillegg ble stamme ansett som en surrogatmarkør for lokal plakksammensetning49. In vivo belastningsmålinger49 kan derfor potensielt hjelpe til med å identifisere plakkstabilitet hos pasienter. Imidlertid bør man være forsiktig med direkte å oversette de oppnådde resultatene til in vivo plakkruptur. For det første opplever det fibrøse plakkvevet mer kompleks belastning in vivo enn den ensrettede strekkbelastningen som brukes i denne protokollen. For det andre er aterosklerotiske plakk multikomponentstrukturer; In vivo spennings- og tøyningsfordelingene i det fibrøse plakkvevet kan påvirkes av tilstedeværelsen og lokalisasjonen av de andre plakkkomponentene, slik som forkalkninger37.

Denne mekano-imaging rørledningen kan også brukes til å studere andre kollagenøse vev. Global mekanisk testing og strukturell avbildning av kollagen er allerede mye brukt for biologiske vev. Imidlertid er lokal vurdering av pre-svikt og sviktegenskaper, samt kollagenarkitektur, avgjørende for nøyaktig mekanisk karakterisering av heterogene fibrøse vev. Vi forventer at strukturen i denne nye protokollen vil gi ytterligere innsikt i samspillet mellom mikrostruktur og mekanikk i flere biologiske vev.

Disclosures

Forfatterne har ingen interessekonflikter å opplyse.

Acknowledgments

Dette arbeidet ble finansiert av et NWO-Vidi-stipend (18360).

Materials

Name Company Catalog Number Comments
10 mm extension ring Thorlabs Inc. CML10
15 mL tube VWR 525-0150
20x APO water immersion objective Leica 507701
3D Slicer software N/A Version 4.11
50 mL tubes VWR 525-0156
Airbrush pistol AB 430- nozzle diameter 0.3 mm Conrad 4.01614E+12
Blackout, Nylon Fabric with Polyurethane Coating Thorlabs
Black tissue dye Polysciences inc 24113-2
Camera lens, focal length 50 mm Thorlabs Inc. MVL50M1
Camera stand VWR 241-0093, 241-7311
Chameleon Ultra multiphoton laser Coherent
Compressor + air hose JUN-AIR, Conrad B07GB9HC62, 4016138577198
Excel Microsoft Version 2208
Foam tape double-sided, 1.9 x 150 cm Pattex
Heating bath N/A Custom made
High-speed camera + imaging software Pixelink-Navitar Inc. PL-D725
Human carotid atherosclerotic plaques (from carotid endarterectomy surgery) N/A
Image J National Institute of Health N/A
LAS-AF Leica Version 2.3 Imaging software multiphoton microscope
LEICA TCS SP5 II Leica Microscope used for SHG imaging
Lighting system AMZ instruments LED-60TB Used to obtain clear images with the high-speed camera
MATLAB MathWorks Version R2021A
MATLAB-based FibLab software Eindhoven University of Technology N/A
MATLAB-based FOA (Fibre Orientation Analysis) tool Eindhoven University of Technology N/A
MATLAB-based Ncorr software Georgia Institute of Technology Version 1.2
Needles Emerald BDAM302986
Petri dish (10 cm diameter) VWR BRND452000
Parafilm VWR 291-1214
Pasteur Pipettes VWR ELKA127-P511-000
Quantum GX2 Micro computed tomography (μCT) scanner + X-ray filter of Cu 0.06 mm + Al 0.5 mm PerkinElmer CLS149276
Ruler Fine Science Tools 1800030
Sandpaper (P180) Conrad 4.00932E+12
Side cutter Conrad 4.25084E+12
Silicon elastomer base and curing agent (Sylgard 184) VWR 634165S
Tensile tester + software + clamps N/A Made in-house using a cylindrical linear actuator (EACM2E10AZAK, Oriental Motor Ltd.), and a 10 N load cell (LCMFD-10N, Omega Engineering Inc.)
Torque screwdriver Garant, Hoffman group 659906

DOWNLOAD MATERIALS LIST

References

  1. Libby, P., et al. Atherosclerosis. Nature Reviews Disease Primers. 5, 1-18 (2019).
  2. Visseren, F., et al. ESC Guidelines on cardiovascular disease prevention in clinical practice. European Heart Journal. 42 (34), 3227-3337 (2021).
  3. Jang, I. K., et al. et al. In vivo characterization of coronary atherosclerotic plaque by use of optical coherence tomography. Circulation. 111 (12), 1551-1555 (2005).
  4. Ohayon, J., et al. Necrotic core thickness and positive arterial remodeling index: emergent biomechanical factors for evaluating the risk of plaque rupture. American Journal of Physiology. Heart and Circulatory Physiology. 295 (2), 717-727 (2008).
  5. SCOT-HEART investigators. Coronary CT angiography and 5-year risk of myocardial infarction. The New England Journal of Medicine. 379, 924-933 (2018).
  6. Williams, M. C., et al. Coronary artery plaque characteristics associated with adverse outcomes in the SCOT-HEART study. Journal of the American College of Cardiology. 73 (3), 291-301 (2019).
  7. Kwak, B. R. Biomechanical factors in atherosclerosis: mechanisms and clinical implications. European Heart Journal. 35 (43), 3013-3020 (2014).
  8. Akyildiz, A. C., Speelman, L., Gijsen, F. J. Mechanical properties of human atherosclerotic intima tissue. Journal of Biomechanics. 47 (4), 773-783 (2014).
  9. Loree, H. M., Grodzinsky, A. J., Park, S. Y., Gibson, L. J., Lee, R. T. Static circumferential tangential modulus of human atherosclerotic tissue. Journal of Biomechanics. 27 (2), 195-204 (1994).
  10. Holzapfel, G. A., Sommer, G., Regitnig, P. Anisotropic mechanical properties of tissue components in human atherosclerotic plaques. Journal of Biomechanical Engineering. 126 (5), 657-665 (2004).
  11. Maher, E., et al. Tensile and compressive properties of fresh human carotid atherosclerotic plaques. Journal of Biomechanics. 42 (16), 2760-2767 (2009).
  12. Teng, Z. A uni-extension study on the ultimate material strength and extreme extensibility of atherosclerotic tissue in human carotid plaques. Journal of Biomechanics. 48 (14), 3859-3867 (2015).
  13. Lendon, C. L., Davies, M. J., Richardson, P. D., Born, G. V. R. Testing of small connective tissue specimens for the determination of the mechanical behaviour of atherosclerotic plaques. Journal of Biomedical Engineering. 15 (1), 27-33 (1993).
  14. Akyildiz, A. C. 3D fiber orientation in atherosclerotic carotid plaques. Journal of Structural Biology. 200, 28-35 (2017).
  15. Johnston, R. D., Gaul, R. T., Lally, C. An investigation into the critical role of fibre orientation in the ultimate tensile strength and stiffness of human carotid plaque caps. Acta Biomaterialia. 124, 291-300 (2021).
  16. Larson, A. M. Multiphoton microscopy. Nature Photonics. 5 (1), (2010).
  17. Pagiatakis, C., Galaz, R., Tardif, J. C., Mongrain, R. A comparison between the principal stress direction and collagen fiber orientation in coronary atherosclerotic plaque fibrous caps. Medical and Biological Engineering and Computing. 53 (6), 545-555 (2015).
  18. Niestrawska, J. A., et al. The role of tissue remodeling in mechanics and pathogenesis of abdominal aortic aneurysms. Acta Biomaterialia. 88, 149-161 (2019).
  19. Woessner, A. E., Jones, J. D., Witt, N. J., Sander, E. A., Quinn, K. P. Three-dimensional quantification of collagen microstructure during tensile mechanical loading of skin. Frontiers in Bioengineering and Biotechnology. 9, 642866 (2021).
  20. Kujawinska, M., et al. Digital image correlation method: A versatile tool for engineering and art structures investigations. Proceedings of SPIE. 8011, (2011).
  21. Luo, Y., Duprey, A., Avril, S., Lu, J. Characteristics of thoracic aortic aneurysm rupture in vitro. Acta Biomaterialia. 42, 286-295 (2016).
  22. Bonati, L. H., et al. European Stroke Organisation guideline on endarterectomy and stenting for carotid artery stenosis. European Stroke Journal. 6 (2), 1-47 (2021).
  23. Hemmasizadeh, A., Darvish, K., Autieri, M. Characterization of changes to the mechanical properties of arteries due to cold storage using nanoindentation tests. Annals of Biomedical Engineering. 40 (7), 1434-1442 (2012).
  24. Fedorov, A., et al. 3D slicer as an image computing platform for the quantitative imaging network. Magnetic Resonance Imaging. 30 (9), 1323-1341 (2012).
  25. Mulvihill, J. J., Walsh, M. T. On the mechanical behaviour of carotid artery plaques: the influence of curve-fitting experimental data on numerical model results. Biomechanics and Modeling in Mechanobiology. 12 (5), 975-985 (2013).
  26. Walsh, M. T., et al. Uniaxial tensile testing approaches for characterisation of atherosclerotic plaques. Journal of Biomechanics. 47 (4), 793-804 (2014).
  27. Walsh, D. R. Mechanical and structural characterisation of the dural venous sinuses. Scientific Reports. 10, 21763 (2020).
  28. Palanca, M., Tozzi, G., Cristofolini, L. The use of digital image correlation in the biomechanical area: a review. International Biomechanics. 3, 1-21 (2016).
  29. Zhou, P., Goodson, K. E. Subpixel displacement and deformation gradient measurement using digital image/speckle correlation. Optical Engineering. 40 (8), 1613-1620 (2001).
  30. Frangi, A. F., Niessen, W. J., Vincken, K. L., Viergever, M. A. Multiscale vessel enhancement filtering. Lecture Notes in Computer Science. 1496, (1998).
  31. Fibertracking Manual. , Available from: https://gitlab.tue.nl/stem/FibLab/-/blob/mater/Fibertracking/manual.pdf (2023).
  32. FibLab Different Angle. , Available from: https://gitlab.tue.nl/stem/FibLab/-/blobl/master/adifferentangle.pdf (2023).
  33. van Haaften, E. Decoupling the effect of shear stress and stretch on tissue growth and remodeling in a vascular graft. Tissue Engineering Part C: Methods. 24 (7), 418-429 (2018).
  34. Blaber, J., Adair, B., Antoniou, A. Ncorr: open-source 2D digital image correlation matlab software. Experimental Mechanics. 55 (6), 1105-1122 (2015).
  35. NCorr Manual. , Available from: http://www.ncorr.com/download/ncorrmanual_v1_2_2.pdf (2017).
  36. Barrett, H. E., Vander Heiden, K., Farrell, E., Gijsen, F., Akyildiz, A. C. Calcifications in atherosclerotic plaques and impact on plaque biomechanics. Journal of Biomechanics. 87, 1-12 (2019).
  37. Gijsen, F. Morphometric and mechanical analyses of calcifications and fibrous plaque tissue in carotid arteries for plaque rupture risk assessment. IEEE transactions on Biomedical Engineering. 68 (4), 1429-1438 (2021).
  38. Zhang, L. Advances in CT techniques in vascular calcification. Frontiers in Cardiovascular Medicine. 29 (8), 716-822 (2021).
  39. Wang, Y., Osborne, M. T., Tung, B., Li, M., Li, Y. Imaging cardiovascular calcification. Journal of the American Heart Association. 7 (13), 1-15 (2018).
  40. Chen, B., Zhao, J., Pan, B. Mirror-assisted multi-view digital image correlation with improved spatial resolution. Experimental Mechanics. 60, 283-293 (2019).
  41. Santamarıa, V. A. A., Garcıa, M. F., Molimard, J., Avril, S. Characterization of chemoelastic effects in arteries using digital volume correlation and optical coherence tomography. Acta Biomaterialia. 102, 127-137 (2019).
  42. Guvenir Torun, S., et al. Multicomponent material property characterization of atherosclerotic human carotid arteries through a Bayesian Optimization based inverse finite element approach. Journal of the Mechanical Behavior of Biomedical Materials. 126, 104996 (2022).
  43. Guvenir Torun, S., et al. Multicomponent mechanical characterization of atherosclerotic human coronary arteries: an experimental and computational hybrid approach. Frontiers in Physiology. 12, 733009 (2021).
  44. vanden Berg, R., Avril, S., Gijsen, F. J. H., Akyildiz, A. C. Material characterization of atherosclerotic plaques with virtual fields method. Proceeding Book of 6th International Conference on Computational and Mathematical Biomedical Engineering - CMBE2019. , (2019).
  45. Helm, J. D. Digital image correlation for specimens with multiple growing cracks. Experimental Mechanics. 48 (6), 753-762 (2008).
  46. Nadkarni, S. K., et al. Measurement of collagen and smooth muscle cell content in atherosclerotic plaques using polarization-sensitive optical coherence tomography. Journal of the American College of Cardiology. 49 (13), 1474-1481 (2007).
  47. Nadkarni, S. K., Bouma, B. E., de Boer, J., Tearney, G. J. Evaluation of collagen in atherosclerotic plaques: the use of two coherent laser-based imaging methods. Lasers in Medical Science. 24 (3), 439-445 (2009).
  48. Villiger, M. Coronary plaque microstructure and composition modify optical polarization: a new endogenous contrast mechanism for optical frequency domain imaging. Journal of the American College of Cardiology: Cardiovascular Imaging. 11 (11), 1666-1676 (2018).
  49. Schaar, M. D., et al. Characterizing vulnerable plaque features with intravascular elastography. Circulation. 108, 2636-2641 (2003).

Tags

Bioteknologi utgave 189
En metode for å studere sammenhengen mellom lokal kollagenstruktur og mekaniske egenskaper til aterosklerotisk plakkfibervev
Play Video
PDF DOI DOWNLOAD MATERIALS LIST

Cite this Article

Crielaard, H., Guvenir Torun, S.,… More

Crielaard, H., Guvenir Torun, S., Wissing, T. B., de Miguel Muñoz, P., Kremers, G. J., Gijsen, F. J. H., Van Der Heiden, K., Akyildiz, A. C. A Method to Study the Correlation Between Local Collagen Structure and Mechanical Properties of Atherosclerotic Plaque Fibrous Tissue. J. Vis. Exp. (189), e64334, doi:10.3791/64334 (2022).

Less
Copy Citation Download Citation Reprints and Permissions
View Video

Get cutting-edge science videos from JoVE sent straight to your inbox every month.

Waiting X
Simple Hit Counter