Summary
I dette arbeidet brukes en in vitro rekonstitueringstilnærming for å studere poroelastisiteten til actomyoingeler under kontrollerte forhold. Dynamikken til actomyosingelen og det innebygde løsningsmidlet kvantifiseres, hvorved nettverksporoelastisiteten demonstreres. Vi diskuterer også eksperimentelle utfordringer, vanlige fallgruver og relevans for cellecytoskjelettmekanikk.
Abstract
Celler kan aktivt forandre sine former og bli bevegelige, en egenskap som avhenger av deres evne til aktivt å omorganisere sin indre struktur. Denne funksjonen tilskrives de mekaniske og dynamiske egenskapene til cellecytoskjelettet, spesielt actomyosincytoskelettet, som er en aktiv gel av polare aktinfilamenter, myosinmotorer og tilbehørsproteiner som utviser inneboende sammentrekningsegenskaper. Den vanligvis aksepterte oppfatningen er at cytoskjelettet oppfører seg som et viskoelastisk materiale. Denne modellen kan imidlertid ikke alltid forklare de eksperimentelle resultatene, som er mer konsistente med et bilde som beskriver cytoskjelettet som et poroelastisk aktivt materiale - et elastisk nettverk innebygd med cytosol. Kontraktilitetsgradienter generert av myosinmotorene driver strømmen av cytosol over gelporene, noe som antyder at mekanikken til cytoskjelettet og cytosolen er tett koblet. Et hovedtrekk ved poroelastisitet er diffusiv avslapning av spenninger i nettverket, karakterisert ved en effektiv diffusjonskonstant som avhenger av gelelastisk modul, porøsitet og cytosol (løsningsmiddel) viskositet. Siden celler har mange måter å regulere strukturen og materialegenskapene på, er vår nåværende forståelse av hvordan cytoskjelettmekanikk og cytosolstrømningsdynamikk er koblet sammen, fortsatt dårlig forstått. Her brukes en in vitro rekonstitueringstilnærming for å karakterisere materialegenskapene til poroelastiske actomyosingeler som et modellsystem for cellecytoskjelettet. Gelkontraksjon drives av myosinmotorisk kontraktilitet, noe som fører til fremveksten av en strøm av det penetrerende løsningsmidlet. Papiret beskriver hvordan du skal forberede disse gelene og kjøre eksperimenter. Vi diskuterer også hvordan man måler og analyserer løsemiddelstrømmen og gelkontraksjonen både på lokal og global skala. De ulike skaleringsrelasjonene som brukes til datakvantifisering er gitt. Til slutt diskuteres eksperimentelle utfordringer og vanlige fallgruver, inkludert deres relevans for cellecytoskjelettmekanikk.
Introduction
Levende celler har unike mekaniske egenskaper. Foruten evnen til passivt å reagere på påførte krefter, er de også i stand til aktivt å generere krefter som svar på ytre stimuli1. Disse egenskapene, som er essensielle for en rekke cellulære prosesser, spesielt under cellemotilitet, tilskrives primært de mekaniske og dynamiske egenskapene til cellecytoskelettet, spesielt actomyosincytoskelettet, som er en aktiv gel av polare aktinfilamenter, myosinmolekylære motorer og tilbehørsproteiner. Disse actomyosinnettverkene utviser inneboende selvorganiserings- og sammentrekningsegenskaper drevet av myosinmotorproteinene, som kryssbinder aktinfilamentene og aktivt genererer mekaniske spenninger i nettverket drevet av ATP-hydrolyse2.
Tallrike eksperimentelle og teoretiske studier har blitt utført for å studere materialegenskapene til cytoskelettet3. Den allment aksepterte oppfatningen er at cytoskjelettet oppfører seg som et viskoelastisk materiale4. Dette betyr at cytoskelettet på korte tidsskalaer oppfører seg som et elastisk materiale, og på lange tidsskalaer oppfører det seg som et viskøst væske på grunn av tverrbindende proteiner og myosinmotorisk løsrivelse (og reattachment), noe som gjør at nettverket dynamisk kan snu. Den viskoelastiske modellen kan imidlertid i mange situasjoner ikke beskrive de eksperimentelle resultatene, som er mer konsistente med et bilde som beskriver cytoskjelettet og mer generelt cellecytoplasma som beskrives som et poroelastisk virkestoff 5,6. To hovedtrekk karakteriserer disse typer materialer. (i) Den første hovedfunksjonen er genereringen av en strøm av penetrerende cytosol ("løsningsmidlet") over gelporene ved kontraktilitetsgradienter drevet av myosinmotorene, som ligger til grunn for prosesser som celleblebbing7, motilitet8 og celleformsvingninger9. Fremveksten av slike cytosoliske strømmer kan være lokal, for blebbing eller global, som i cellemotilitet. I sistnevnte tilfelle driver de kontraktile påførte spenningene ved cellens bakside strømmen av cytosolisk væske mot cellefronten, noe som etterfyller proteinbassenget som trengs for lamellipodimontering8. (ii) Den andre hovedfunksjonen er at avslapningen av spenninger er diffusiv og er preget av en effektiv diffusjonskonstant, , som avhenger av gelelastisiteten, gelporøsiteten og løsningsmiddelviskositeten5. Den poroelastiske diffusjonskonstanten bestemmer hvor raskt systemet reagerer på en påført spenning. Høyere diffusjonskonstanter tilsvarer raskere stressomfordeling. Dette bestemmer i sin tur hvor lang tid det tar for det intracellulære cytosoliske væsken å bli omfordelt i cellen etter påført mekanisk stress, det være seg eksternt eller internt, slik som de aktive kontraktile spenningene generert av myosinmotorer. Disse eksemplene viser dermed at mekanikken til cytoskjelettet og cytosolen er tett koblet og ikke kan behandles separat3.
Siden celler kan regulere sine mekaniske egenskaper på en rekke måter, er samspillet mellom nettverksmekanikk og væskestrømningsdynamikk fortsatt dårlig forstått. En kraftig alternativ tilnærming er å bruke in vitro rekonstituerte systemer som muliggjør full kontroll over de forskjellige mikroskopiske bestanddelene og systemparametrene, noe som gjør disse modellsystemene optimale for fysisk analyse10,11. Denne tilnærmingen har blitt brukt til å studere virkningen av proteinsammensetning og systemgeometri på aktinbasert motilitet 12,13,14,15,16,17,18, 2D-mønstre av aktomyosinnettverk 19,20,21,22, og samspillet mellom nettverkskontraktilitet og væskestrømningsdynamikk av poroelastiske actomyosingeler, som er fokus for denne artikkelen23.
I dette manuskriptet diskuteres fremstilling av kontraktile elastiske aktomyosinnettverk med kontrollerbare dimensjoner og materialegenskaper basert på arbeidet til Ideses et al.23. Dynamikken til kontraheringsgelen og det drenerte løsningsmidlet analyseres og kvantifiseres, hvorved det er demonstrert at disse actomyosingelene kan beskrives som et poroelastisk aktivt materiale. Å studere effekten av løsningsmiddelviskositet på stressdiffusivitet bekrefter ytterligere den poroelastiske naturen til disse nettverkene. De ulike skaleringsrelasjonene som brukes til datakvantifisering er gitt. Til slutt diskuteres også de eksperimentelle utfordringene, de vanlige fallgruvene og relevansen av eksperimentelle resultater for cellecytoskjelettet.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Protocol
1. Glassoverflatebehandling og passivering:
MERK: Denne delen inneholder tre hovedtrinn (se figur 1): (i) rengjøring og hydrofilisering, (ii) silanisering og (iii) overflatepassivering.
- Rengjøring og hydrofilisering
- Bruk Piranha-løsning for rengjøring av glassoverflate.
MERK: Piranha-oppløsning er en blanding av 30%H2O2og 70%H2SO4(materialfortegnelse). Hovedmålet er å fjerne organiske forurensninger fra dekkflater og eksponere OH-gruppene på glassoverflaten. På denne måten blir glassoverflaten hydrofil. - Plasser 10-12 #1,5 (22 mm x 22 mm) glassdeksler (materialfortegnelse) i en hjemmelaget polytetrafluoretylenholder (basisareal: 5,5 cm x 5,5 cm). Overfør polytetrafluoretylenholderen til et 400 ml beger (materialfortegnelse), og inkuber den med 300 ml Piranha-løsning i 2 timer. Gjør dette trinnet på is og i en kjemisk hette.
MERK: Polytetrafluoretylenpolen som er skrudd fast i holderbasen, er 12 cm lang, lengre enn begeret (11 cm), noe som muliggjør sikker overføring/uttrekking av holderen til/fra Piranha-løsningen. Siden Piranha-løsningen fortsatt kan være svært reaktiv og veldig varm, er det viktig å stoppe reaksjonen. Den enkleste måten å stoppe reaksjonen på er å helle Piranha-løsningen i (trykk) vann for å oppnå en 50x fortynning (minst). Oppløsningen kan deretter kasseres trygt. Oppbevar aldri den brukte Piranha-løsningen i en lukket glassflaske - dette kan ende i en flaskeeksplosjon. - Overfør polytetrafluoretylenholderen til et rent beger fylt med ferskt dobbeltdestillert vann (DDW) for å vaske overflødig Piranha fra dekslene.
- Overfør begeret til et sonikeringsbad (materialfortegnelse), og sonicate ved 80 Hz ved full effekt i 10 minutter ved 25 ° C. Gjenta dette trinnet to ganger til med fersk DDW. Bruk fersk DDW hver gang.
- Bruk Piranha-løsning for rengjøring av glassoverflate.
- Silanisering
- Overfør holderen til et rent beger (400 ml) fylt med 300 ml ren metanol (materialfortegnelse) og deretter inn i et sonikeringsbad (materialfortegnelse). Sonikere ved 80 Hz ved full effekt i 30 minutter ved 25 °C.
- Etter sonikering, overfør holderen til en silanoppløsning fremstilt ved bruk av 15 ml DDW, 3,1 ml eddiksyre (materialtabell), 340 ml metanol og 7,6 ml silan ((3-merkaptopropyl) trimetoksysilan) (materialtabell). Forsegl begeret med parafilm, og oppbevar det i kjøleskapet ved 4 °C over natten.
MERK: Fremstilling og håndtering av silanoppløsningen må utføres i en kjemisk hette. Etter silaniseringstrinnet, legg den brukte silanløsningen (avfall) i en dedikert glassflaske i den kjemiske hetten. - Neste dag, overfør holderen til et rent beger fylt med 300 ml ren metanol i 15 s. Overfør deretter holderen til et rent beger, ikke før du tørker bunnen av polytetrafluoretylenholderen for å fjerne overflødig metanol. Sett begeret over i ovnen (materialfortegnelsen) for å tørke glassdekslene i 5 minutter ved 120 °C.
- Overflatepassivering med en inert polymer
- Oppnå overflatepassivering ved å inkubere glassdekslene med en inert polymer (Table of Materials). For hvert eksperiment, ta to coverslips og legg dem i en petriskål belagt med et parafilmlag som først ble rengjort med etanol (EtOH) (DDW / EtOH: 30/70 vol / vol) (materialfortegnelse).
- Inkuber hver dekkseddel med 1 ml av en 4 mg·ml−1 5 kDa molekylvekt metoksypolyetylenglykolmaleimid (mPEG-mal, Mw = 5 kDa) (materialfortegnelse) i 1x fosfatbufret saltvann (PBS) (materialfortegnelse) i 1 time ved 22 °C.
MERK: Plassering av dekslene på et hydrofobt parafilmlag begrenser den hydrofile PEG-polymerløsningen til glassdekselets overflate. Inkubasjonstiden er kritisk for å oppnå optimal passivering. Bruk inkubasjonstider mellom 45 min og 2 timer. Over denne inkubasjonstiden kan glassdekselets overflate forringes, noe som fører til proteinadhesjon og tap av gjennomsiktighet. - På slutten av inkubasjonsprosessen, skyll hvert deksel med 5 ml DDW og tørk med en strøm på N2 (gass). Ikke tørk dekslene under vakuum. Siden dekslene må holdes våte etter passivering, sett umiddelbart 1 ml 10 mM Tris på de pegylerte overflatene. Bruk dekslene innen 2 timer.
MERK: De ulike trinnene må utføres i et laminært strømningskammer for å forhindre forurensning av glassoverflaten.
2. Proteinrensing
- Rens G-aktin fra kaninskjelettmuskelacetonpulver ved hjelp av gelfiltreringsmetoden24.
- Aktinrensing tar 1 uke. Oppbevar det rensede G-aktinet i G-buffer (5 mM Tris pH 7,8, 0,01 % NaN3, 0,1 mM CaCl 2,0,2 mM ATP og 1 mM DTT), og oppbevar det på is. Bruk løsningen innen 2 uker.
MERK: Bytt ut isen annenhver dag. - Merk aktinet med et maleimidmodifisert fluorescerende fargestoff16 (materialfortegnelse). Rens GST-fascinen basert på metoden til Ono et al.25. Flash-frys begge proteinene i væske N2, og oppbevares ved -80 °C.
- Aktinrensing tar 1 uke. Oppbevar det rensede G-aktinet i G-buffer (5 mM Tris pH 7,8, 0,01 % NaN3, 0,1 mM CaCl 2,0,2 mM ATP og 1 mM DTT), og oppbevar det på is. Bruk løsningen innen 2 uker.
- Bruk en standardprotokoll for å rense myosin II fra kaninskjelettmuskulatur26. Den rensede myosin II (dimerer) stambufferen inkluderer 10 mM Tris pH 7,4, 0,5 M KCl og 35 % w/v sukrose. Flash-frys myosinet i væske N2, og oppbevares ved -80 °C.
MERK: Den høye konsentrasjonen av KCl holder myosinmotorene i en dimerisk form, mens den høye prosentandelen av sukrose sikrer at motorens aktivitet ikke hindres ved frysing. Bruk en dedikert pipette for viskøs væskehåndtering når du arbeider med myosin II stamløsninger (Table of Materials).- Merk myosin II-dimerene med et fluorescerende fargestoff (materialfortegnelse) ved par konstruerte cysteinrester19,27. Bruk en kylling gizzard RLC mutant A til det formålet26. Flash-frys den merkede myosin II i væske N2, og oppbevares ved -80 °C.
MERK: Denne merkingsprosedyren sikrer at den merkede myosinen er aktiv som det opprinnelige myosin II-proteinet.
- Merk myosin II-dimerene med et fluorescerende fargestoff (materialfortegnelse) ved par konstruerte cysteinrester19,27. Bruk en kylling gizzard RLC mutant A til det formålet26. Flash-frys den merkede myosin II i væske N2, og oppbevares ved -80 °C.
- Bruk et UV-Vis-spektrofotometer (materialfortegnelse) for å måle absorbansen av stamproteinløsningene, og utlede proteinkonsentrasjonene med øl-lambert-loven ved å bruke følgende ekstinksjonskoeffisienter: G-aktin (ε290 = 26 460 M−1·cm−1), GST-fascin (ε 280 = 99 330 M−1·cm−1), myosin II-dimer (ε280 = 268 800 M−1·cm−1), og RLC mutant A (ε280 = 3,960 M−1·cm−1)19.
3. Forberedelse av prøver
MERK: Polymeriser aktinmonomerene i nærvær av store aggregater av myosin II-motorer og den sterke passive tverrbinderfascinen for å produsere makroskopisk kontraktile elastiske actomyosinnettverk19,23. Tilsetning av fluorescerende perler til løsningen gjør det mulig å spore løsningsmiddelstrømmen under gelkontraksjon.
- Protein ("actomyosin") løsning
- Bortsett fra G-aktin, hold proteinene ved -80 ° C i små alikoter, og tine dem ved 37 ° C før bruk. Actomyosinoppløsningens totale volum er 40 μL.
- Klargjør oppløsningen ved å blande 10 mM Tris pH 7,4, 2 mM MgCl2, 25 mM KCl, 1 mM ATP, et ATP-regenereringssystem (0,5 mg·ml−1 kreatinkinase og 5 mM kreatinfosfat), 200 μM EGTA (chelater Ca2+ ioner), en antiblekeoppløsning (0,1 mg·ml−1 glukoseoksidase, 0,018 mg·ml−1 katalase og 5 mg·ml−1 glukose), 5 μM G-aktin, 280 nM GST-fascin og 1,67 nM myosin II. Prosentandelen merket G-aktin er 5% (molarprosent).
MERK: Bruk en lav prosentandel av merket G-aktin for å unngå metning av det fluorescerende signalet ved de avanserte stadiene av gelkontraksjon.
- Klargjøring av myosin II motoraggregater
- Tilsett myosinmotorene til proteinløsningen i form av aggregater. For å danne store myosinaggregater (150 myosindimerer/aggregat), fortynn myosinstamløsningen med 10 mM Tris pH 7,4 for å nå en endelig konsentrasjon på 25 mM KCl.
- Oppbevar den fortynnede myosinoppløsningen i 10 minutter ved romtemperatur (RT), og overfør den deretter til is til bruk. Motorene er fullt aktive i opptil 2 timer.
- Måling av løsemiddelstrømmen
- For å spore løsningsmiddelstrømmen over gelporene, tilsett fluorescerende perler til actomyosinoppløsningen. Reduser samspillet mellom perlene og actomyosinnettverket ved å passivisere perlene. Praktisk talt, inkuber 1 μL perler (materialfortegnelse) med 5 μM G-aktin i 20 minutter ved RT, og fjern deretter overflødig G-aktin ved sentrifugering (materialfortegnelse) (betingelser: 6000 x g i 5 minutter ved 4 ° C).
- Gjenta dette trinnet med 10 mg·ml−1 bovint serumalbumin (BSA) (materialfortegnelse) for å blokkere (muligens) den gjenværende ubelagte overflaten. Bruk kulene ved en endelig fortynning på 1:10 000 vol/vol i forsøkene.
MERK: Det er viktig å tilpasse perlenes diameter til gelporestørrelsen slik at forholdet mellom perle og porestørrelse er <1 i alle stadier.
- Effekt av løsningsviskositet
- Kontroller viskositeten til løsningen ved å tilsette glyserol (materialfortegnelse) til actomyosinoppløsningen. Tilsetning av glyserol i en vektprosent fra 0% til 34% induserer en tilsvarende økning i løsningsviskositeten fra η ω til 2,76 η ω, hvor η ωer viskositeten til vann ved 20 ° C28.
MERK: Det er viktig å bruke en dedikert pipette for viskøs væskehåndtering når du arbeider med glyserol (materialfortegnelse).
- Kontroller viskositeten til løsningen ved å tilsette glyserol (materialfortegnelse) til actomyosinoppløsningen. Tilsetning av glyserol i en vektprosent fra 0% til 34% induserer en tilsvarende økning i løsningsviskositeten fra η ω til 2,76 η ω, hvor η ωer viskositeten til vann ved 20 ° C28.
4. Kjøre et eksperiment
- Hjemmelaget håndtering av prøvetaker
- Ta et av de PEG-passiverte dekselene, plasser et smurt parafilmavstandsstykke på toppen av det, og plasser det i prøveholderen.
MERK: Man kan erstatte parafilmavstandsstykket med hvilken som helst avstandsstykke.
- Ta et av de PEG-passiverte dekselene, plasser et smurt parafilmavstandsstykke på toppen av det, og plasser det i prøveholderen.
- Klargjøring av aktomyosinoppløsningen
- Forbered aktomyosinoppløsningen på is i et mikrosentrifugerør ved å inkorporere de forskjellige mikroskopiske bestanddelene, tilsette myosin II-motoraggregatene og tilsette EGTA sist. Bland løsningen godt. Tilsetningen av EGTA initierer aktomyosinnettverkspolymerisering, som angir starttidspunktet for forsøket.
- Sett 1,1 μL av den løsningen på den holdermonterte dekselet, og plasser den andre dekselet på toppen. Skru holderen for å forsegle prøven. Denne prosessen klemmer dråpen litt, som vedtar en platelignende form. Dråpediametrene varierer mellom 2.800-3.000 μm.
- Plasser prøveholderen på mikroskopet, og start oppkjøpet. Forbered mikroskopet på forhånd for å redusere den første oppkjøpstiden. Det tar vanligvis 1-2 minutter etter blanding for å starte prøveavbildningen.
5. Mikroskopi teknikker
- Avbilde prøvene ved hjelp av et invertert fluorescerende mikroskop (Table of Materials) styrt av dedikert programvare (Table of Materials).
- Bruk lave forstørrelser på 2,5x / 0,075 Plan-NEOFLUAR objektiv (materialfortegnelse) for å visualisere hele gelområdet og følge makroskopisk sammentrekning med tiden.
- Bruk et 10x/0.3 Ph1 UPlanFL-mål (materialfortegnelse) for å karakterisere nettverkets porøsitet og struktur og å følge nettverkets selvorganisering og sammentrekning med tiden.
MERK: Dette målet er også nyttig for å lokalisere myosin II-motoraggregatene i nettverket og følge bevegelsen av fluorescerende perler over gelporene. Høyere forstørrelser kan brukes på bekostning av et redusert synsfelt, noe som er enda mer signifikant i tofargebildemodus (materialfortegnelse).
- Eksiter prøvene ved 488 nm (aktin/fluorescerende perler) og 561 nm (myosinmotoraggregater/fluorescerende perler). Hent bildene med 100 ms per ramme med dedikert programvare (materialfortegnelse) i strømmemodus med et elektronmultipliserende ladekoblet enhet (EMCCD)-kamera (materialfortegnelse).
MERK: Intensiteten til lysstoffrøret (materialfortegnelsen) bør holdes på lavest mulig verdi for å unngå signalmetning under sammentrekning av nettverket. - Samtidig tofarget avbildning
- Bruk denne modusen til to formål: (i) å oppdage lokaliseringen av myosinmotoraggregatene i aktinnettverket, og (i) karakterisere den ytre løsningsmiddelstrømmen i og utenfor under nettverkskontraksjon.
- Eksiter aktin- og myosin II-motorene ved henholdsvis 488 nm og 561 nm, og ta bildene samtidig på et EMCCD-kamera (materialfortegnelse) ved hjelp av et dobbeltutslippsapparat (materialfortegnelse). Bruk det samme bildesystemet til samtidig å avbilde aktingelen (488 nm) og de fluorescerende kulene (561 nm).
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Representative Results
To glassdeksel brukes per eksperiment. Glassdekslene rengjøres og passiveres med PEG-polymerer. Passivering er avgjørende for å forhindre at de solubiliserte proteinene fester seg til glassflatene i de tidlige eksperimentelle stadiene og for å minimere samspillet mellom det kontraherende nettverket og glassveggene. Unnlatelse av å oppnå god passivering kan føre til ineffektiv sammentrekning, og i ekstreme tilfeller kan det til og med hemme aktinnettverksdannelse.
Figur 1 beskriver de tre hovedtrinnene i overflatebehandlingsprosedyren. Disse trinnene inkluderer følgende: (i) overflaterengjøring og hydrofilisering ved hjelp av en Piranha-løsning, som fjerner organisk forurensning fra dekkflatene og eksponerer OH-gruppene på glassoverflaten; (ii) overflatesilanisering med (3-merkaptopropyl)trimetoksysilan, som tar sikte på å kovalent binde silanen til glassoverflaten, hvor hvert silanmolekyl ender opp med en SH-gruppe; (iii) passivering med PEG-polymerer (mPEG-mal, 5 kDa) - i dette trinnet interagerer maleimidgruppen av PEG-polymeren kovalent med SH-gruppen på (3-merkaptopropyl)trimetoksysilan, noe som resulterer i dannelsen av et PEG-monolag på glassoverflaten.
For Piranha-behandling og silanisering plasseres 10-12 glassdeksler #1,5 (22 mm x 22 mm) i en polytetrafluoretylenholder (figur 2A), og holderen overføres til et 400 ml beger. For passiveringstrinnet overføres to glassdeksler til en parafilmbelagt petriskål (figur 2B). Ved å plassere dekslene på et hydrofobt parafilmlag sikrer du at den hydrofile PEG-polymerløsningen forblir begrenset til glassoverflaten gjennom inkubasjonstiden. Hver dekkseddel inkuberes med 1 ml 4 mg·mL−1 5 kDa mPEG-mal i 1x PBS i 1 time ved 22 °C (figur 2B). For denne PEG-polymermolekylvekten og konsentrasjonen fører glasspassivering til dannelsen av et PEG-monolag, hvor hver PEG-polymer er i en sopplignende konformasjon29. På slutten av inkubasjonsprosessen skylles hver deksel med 5 ml DDW og tørkes med en strøm på N2 (gass). Hvis dekslene ikke brukes umiddelbart, skal 1 ml 10 mM Tris settes på de pegylerte overflatene for å holde dekkflatene våte. Dekselene tørkes med en strøm av N2 (gass) like før du starter et eksperiment. Det er bedre å bruke dekslene innen 2 timer.
Makroskopisk kontraktile elastiske actomyosinnettverk dannes ved å blande 5 μM G-aktin med 16,7 nM myosin, som tilsettes i form av store aggregater (~150 myosindimerer/aggregater), og 280 nM av den sterke tverrbindingsfascinen. Løsningen inkluderer 1 mM ATP, som holdes konstant ved hjelp av et ATP-regenererende system og en anti-blekingsløsning (se detaljer i protokollseksjonen). For å analysere strømmen av det penetrerende løsningsmidlet, tilsettes fluorescerende perler til actomyosinoppløsningen.
Forsøkene kjøres i en hjemmelaget prøveholder, som passer til dimensjonene til et standard mikroskopstadium (figur 3). Et smurt parafilmavstandsstykke med tykkelse h (~150 μm) plasseres på ett av to PEG-passiverte deksler, og dette dekselet plasseres i prøveholderen (figur 3A). Deretter fremstilles actomyosinoppløsningen på is i et mikrosentrifugerør ved å inkorporere de forskjellige mikroskopiske bestanddelene, og tilsetter sist G-aktin, myosinaggregater og deretter EGTA, som utløser aktinpolymerisasjon. Løsningen må blandes godt - dette angir starttidspunktet for forsøkene (t = 0). Umiddelbart plasseres 1,1 μL av denne løsningen på dekselet (figur 3B), det andre PEG-passiverte dekselet plasseres på toppen av det (figur 3C), og holderen skrus for å begrense dråpen mellom dem (figur 3D). For denne dråpevolum- og avstandsstykketypen er dråpediameteren ca. 3000 μm, men forskere bør ikke stole på disse estimerte verdiene. Faktisk dråpetykkelse og diameter skal alltid måles direkte fra mikroskopibildene. For tykkelsen bør et konfokalmikroskop brukes.
Prøveholderen plasseres på mikroskopet, og oppkjøpet startes. Mikroskopet bør utarbeides på forhånd for å redusere tiden for å starte oppkjøpet til et minimum. Det tar vanligvis 1-2 min å starte prøveavbildningen. Prøvene er eksitert ved 488 nm og / eller 561 nm og avbildet ved hjelp av et invertert fluorescerende mikroskop kontrollert av en dedikert programvare. Bildene skal anskaffes med en hastighet på 100 ms per ramme (eller mindre) i streamingmodus med et EMCCD-kamera. For samtidig å avbilde aktinnettverket og myosinmotoraggregatene, eller fluorescerende perler i løsningen, bør et dobbeltutslippssystem brukes. Intensiteten til fluorescerende lampe bør holdes så lav som mulig for å unngå signalmetning i de avanserte stadiene av nettverkskontraksjon.
Et 2.5x / 0.075 Plan-NEOFLUAR objektiv brukes til å karakterisere gelens laterale sammentrekningsdynamikk og væskestrømningsretningen og hastigheten på lengdeskalaen til gelen. Dette er bilder med lav oppløsning som er nyttige for å følge endringene i gelradius med tiden, hvorfra gelradialen (lateral) sammentrekningshastigheten kan utledes. For å løse strukturen og porøsiteten til nettverket, plasseringen av myosinmotoraggregatene i nettverket og bevegelsen av individuelle fluorescerende perler over gelporene, bør høyere forstørrelsesmål brukes (f.eks. et 10x/0.3 Ph1 UPlanFL-mål). Høyere forstørrelser kan også brukes, men på bekostning av et redusert synsfelt, noe som er mer signifikant hvis bildemodusen med to farger brukes. (2D) fluorescensmikroskopidataene bør suppleres med konfokal avbildning av kontraheringsgelen i 3D for å karakterisere sammentrekningsdynamikken i både lateral og vertikal retning. Konfokalmikroskopi brukes til å måle avstanden mellom de to dekslene - denne avstanden definerer den opprinnelige geltykkelsen. I tillegg bør tykkelsen på gelen måles ved slutten av forsøket når en mekanisk stabil tilstand oppnås.
Flere kriterier må oppfylles for å vise at aktomyosinnettverkene oppfører seg som et poroelastisk materiale: (i) nettverket ikke ommodelleres, noe som vil antyde at det oppfører seg som et elastisk materiale (figur 4), (ii) vannet (løsningsmiddel) som strømmer over gelporene drives av myosinkontraktilitet (figur 5), og (iii) den elastiske spenningsavslapningen er preget av en effektiv diffusjonskonstant, D ~ κ / γ, som avhenger av gelens effektive elastiske modul, κ, og den effektive friksjonskonstanten, γ, som står for friksjonen mellom det bevegelige løsningsmidlet og gelporene (figur 6). Nedenfor diskuterer vi hvert kriterium separat og viser hvordan de oppfylles i dagens system.
Mål (i)
For det første bør gelstrukturen og porøsiteten analyseres, og det bør bestemmes om nettverket er dynamisk ombygging. En skjematisk fremstilling av actomyosinnettverket er vist i figur 4A. Nettverksdannelse starter med spontan nukleering og polymerisering av aktinfilamenter, som deretter bunter (figur 4B). Nettverket organiserer seg deretter aktivt i et makroskopisk isotropisk sammenkoblet nettverk av aktinbunter, som dynamisk grover med tiden og til slutt kontrakter. Nettverksselvorganisering og sammentrekning drives av myosinaggregatene, som hovedsakelig lokaliseres ved skjæringspunktene til filamentbuntene (figur 4C). Myosinaggregatene forblir festet til nettverket gjennom gelkontraksjon, hvorfra det kan konkluderes med at disse actomyosingelene oppfører seg som elastiske aktive materialer (figur 4C). Videre, i disse actomyosingelene, styres sammentrekning av filamentglidning, som utledet ved å sammenligne filamentbuntenes ende-til-ende-avstander, l ende-til-ende og konturlengder, lforts (figur 4D,E). Dette står i kontrast til sammentrekningen av løse aktinbunter kryssbundet av α-aktinin, som domineres av aktinfilamentknekking29.
Porøsiteten til gelen er preget av størrelsen på gelporene gjennom hvilke løsningsmiddelstrømmen beveger seg. For rensede aktinnettverk gir maskevidden, som definerer avstanden mellom tverrbindingene i gelen (her myosinaggregatene), et godt estimat også av gelporestørrelsen. Maskevidden kan ekstraheres direkte fra (2D) fluorescensbildene og evalueres fra det geometriske gjennomsnittet av avstandene mellom par av motstående aktinbunter i en gelpore (figur 4B). Siden nettverket er isotropt opp til kontraksjonsstart, er de gjennomsnittlige maskestørrelsene i vertikal (dvs. over tykkelsen) og laterale (langs radiusen) retningene de samme, ξ 0, = ξ 0,ll
= ξ0 (= 67 μm ). Siden aktinbuntene forblir rette under sammentrekning, krymper nett- og porestørrelsene i forhold til endringene i geltykkelse og diameter. For det nåværende eksperimentelle systemet starter den in-plan (radiale) sammentrekningen etter at den vertikale sammentrekningen praktisk talt avsluttes (ikke vist), slik at radial sammentrekning fortsetter med en konstant geltykkelse mindre enn den opprinnelige tykkelsen med en faktor på ~ 0,3. Følgelig, mens maskestørrelsen i sammentrekningsplanet, ξ ll (t) = r (t) / R, avtar under radial kontraksjon, hvor r (t) er radiusen til gelen på tidspunkt t, er gjennomsnittlig maskestørrelse i vinkelrett retning konstant, ξ
= 20μm23. Disse verdiene av maske-/porestørrelsene brukes til å evaluere gelelastisk modul, κ og friksjonskoeffisient γ, som beskrevet nedenfor (Aim [iii], figur 6).
Mål (ii)
Dette målet innebærer å demonstrere at en utadgående løsningsmiddelstrøm genereres av myosinkontraktilitet. For å spore løsningsmiddelstrømmen tilsettes fluorescerende perler til actomyosinoppløsningen. Perlene passiveres for å redusere samspillet mellom de bevegelige kulene og actomyosinnettverket. Totalt inkuberes 1 μL perler (materialfortegnelse) med 5 μm G-aktin i 20 minutter ved romtemperatur, og overflødig G-aktin fjernes ved sentrifugering (materialfortegnelse, se protokollseksjonen for detaljer). Dette trinnet gjentas med 10 mg·mL-1 BSA (Table of Materials). Perlene tilsettes proteinløsningen ved en endelig fortynning på 1:10 000 v/v. Siden målet er å la kulene bevege seg fritt over gelporene, er det viktig å tilpasse kulenes diameter til gelporestørrelsen, slik at størrelsesforholdet alltid er <<1. Som sådan brukes 2,300 nm diameter perler til å analysere de første og mellomliggende stadiene av sammentrekning (figur 5A, B) når gjennomsnittlig porestørrelse er større enn 15 μm, og 200 nm diameter perler brukes når porestørrelsen er mindre (figur 5D-G). Perlenes massesenterposisjon ekstraheres for hver gang, t, (x(t),y(t))perle, ved hjelp av en standard partikkelsporingsalgoritme (materialfortegnelse), hvorfra banen (figur 5B) og lokal perlehastighet 
kan utledes. Perlene, og dermed det gjennomtrengende løsningsmidlet, beveger seg i gjennomsnitt i den ytre radielle retningen (figur 5A,B), mens gelen trekker seg innover, som vist fra partikkelbildevelocimetri (PIV) analyse (se de grønne pilene i figur 6A). Denne radielle bevegelsen kan utdypes ytterligere ved å trekke ut de lokale perlenes radielle hastighet, νr, som evalueres ved å projisere den lokale perlehastigheten på den radiale retningen definert av enhetsvektoren, som forbinder gelsenteret (x 0, 
y0) og perlesenterets masseposisjon på tidspunkt t: 
hvor
Dataene viser at når perlene beveger seg utover fra gelsenteret, øker hastighetene deres i utgangspunktet, og de bremser deretter når de nærmer seg gelgrensen (figur 5C). Spesielt kan perlehastigheten være 20 ganger større enn gelens radiale kontraksjonshastighet (blå kurve i figur 5C). De fylte sirklene markerer tiden perlene forlater gelen. Perlene fortsetter å bevege seg etter å ha gått ut av gelgrensen i noen tid. Denne bevegelsen kan ikke skyldes treghetseffekter, siden Reynold-tallet er <10-4. Den radiale perlehastigheten avtar med tiden samtidig med reduksjonen i gelkontraksjon; Spesielt når gelradialkontraksjonshastigheten er betydelig redusert, svinger hastigheten til perlene betydelig.
For å teste om disse svingningene skyldes den porøse strukturen til actomyosin, sporer nettverket bevegelsen av kulene ved en høyere romlig oppløsning, noe som er mulig når sammentrekningen av gelen har bremset betydelig (figur 5D-F). Perlenes bane er faktisk kronglete (figur 5D, E), med betydelige svingninger i perlenes lokale hastighet, som gjenspeiler den porøse strukturen til gelen - det vil si at den lokale hastigheten er raskest nær poresenteret og tregest i nærheten av en aktinbunt (figur 5F).
Til slutt viser beregning av gelhastighet-løsningsmiddelhastighetskorrelasjonsfunksjonen at væskestrømmen lokalt er rettet motsatt av den kontraherende gelen. Ved å bruke lokale lyspunkter i gelen som fiducialmarkører, kan deres massesenterposisjon for hvert tidspunkt, t, (x(t),y(t))gel, beregnes, og den lokale gelhastigheten kan utledes: 
. Deretter, for hver perle og et nærliggende punkt i gelen, beregnes den lokale dråpehastighet-gelhastighetsparkorrelasjonen for å trekke ut vinkelen, θ, mellom de to vektorene: 
, hvor 
og er de lokale hastighetene (størrelsen) til henholdsvis perlen og 
gelen. Dataene viser at uavhengig av dråpens posisjon i gelporen, lokalt, styres væskestrømmen i motsatt retning i forhold til gelen (figur 5G). Samlet sett viser resultatene at en utadgående væskestrøm genereres av myosinkontraktilitet, som forventet for et poroelastisk virkestoff 3,7,23,30.
Mål (iii)
Dette målet innebærer å demonstrere at stressavslapping er preget av en effektiv poroelastisk diffusjonskonstant, D, som avhenger av nettverkets elastiske modul, porøsitet og løsningsmiddelviskositet. Først kvantifiseres den laterale (in-plane) hastigheten til den kontraherende gelen (figur 6A). For det første blir fluorescensbildene binarisert, og det gelprojiserte området ved hvert tidspunkt t, A (t), ekstraheres. Deretter beregnes gelradiusen 
(figur 6B). Fra dette er den radiale kontraksjonshastigheten ved tidspunkt t,,
avledet som beskriver gelkanthastigheten (figur 6C). Kanthastigheten viser en typisk tidsmessig evolusjonsprofil preget av en innledende lineær fase, hvor kanthastigheten øker med konstant hastighet, , til en maksimal hastighet, νmax, 
nås på tidspunktet tmaks. Hastigheten avtar deretter eksponentielt med en karakteristisk relaksasjonstid, τ, til en mekanisk stabil tilstand er nådd (figur 6C). Rmaxer gelradiusen i begynnelsen av den avslapningsfasen.
For et poroelastisk materiale, avslapningstiden 
, hvor 
er en effektiv poroelastisk diffusjonskonstant, κ er en effektiv elastisk gelmodul, og γ er en effektiv friksjonskonstant som står for bevegelsen av den vandige løsningen gjennom aktingelvorene. Den elastiske modulen har energienheter per volumenhet og er omvendt proporsjonal med volumet av en enhetscelle i gelen, bestemt av avstanden mellom tverrbindinger eller maskestørrelsen, slik at 
. Friksjonskoeffisienten, γ, avhenger av porefasetten vinkelrett på løsningsmiddelstrømmen. For in-plane gel-sammentrekning er den relevante porefasetten , og følgelig friksjonskoeffisienten 
, hvor η er 
løsningsmiddelviskositeten31,32. Samlet sett får vi følgende relasjon: 
, der den relevante porestørrelsen 
i planet evalueres ved tmaks. Til sammen får 
vi , som konkluderer med at avslapningstiden skal skaleres lineært med løsningsmiddelviskositet23.
For å teste om dette forholdet overholdes, gjentas forsøkene med forskjellige mengder glyserol. Bruk av glyserol er fordelaktig da det ikke forventes å påvirke aktiviteten til proteiner, spesielt myosinmotorer. Videre er korrelasjoner mellom viskositeten til vann-glyserolløsninger og mengden tilsatt glyserol tilgjengelig i litteraturen28. Disse korrelasjonene viser at en økning i glyserolvektprosent fra 0% til 34% fører til en proporsjonal økning i vannglyseroloppløsningsviskositeten fra η ω til 2,76 η ω, hvor η ω er vannviskositeten ved 20 ° C. I dette glyserolområdet og for samme innledende dråpediameter, 2R = 2 800 μm, øker en økning i viskositeten varigheten av nettverkspolymerisasjonen og selvorganiseringsfasene, selv om den lineære akselerasjonen og den maksimale radiale kontraksjonshastigheten (νmax) er grovt uendret. Dette beviset tyder på at både nettverksreorganisering (porøsitet) og myosinaktivitet er upåvirket av løsningsviskositeten23, og effekten av løsningsmiddelviskositet bør i hovedsak gjenspeiles i tiden det tar for de elastiske spenningene å slappe av. Faktisk viser avslapningstiden en lineær avhengighet av løsningsviskositeten (figur 6D), som konkluderer med at skaleringsforholdet avledet ovenfor overholdes, noe som ytterligere bekrefter systemets poroelastiske natur.
Figur 1: Skjematisk beskrivelse av de tre hovedtrinnene i prosedyren for overflatebehandling av glassdeksel . (i) Rengjøring av glassoverflate (Piranha-behandling) og hydrofilisering, (ii) overflatesilanisering, og (iii) passivering med mPEG-mal. Klikk her for å se en større versjon av denne figuren.
Figur 2: Passivering av glassdeksel. (A) Piranha rengjøring og silanisering utføres i et 400 ml beger ved bruk av en hjemmelaget polytetrafluoretylenholder bestående av 12 lineære spor. (B) Overflatepassivering utføres i en parafilmbelagt petriskål. Hver dekkseddel inkuberes med 1 ml 5 kDa mPEG-mal ved 4mg·mL−1 in 1x PBS (Table of Materials) i 1 time ved 22 °C. Det hydrofobe parafilmlaget sikrer at den hydrofile PEG-polymerløsningen forblir begrenset til glassoverflaten gjennom inkubasjonstiden. Klikk her for å se en større versjon av denne figuren.
Figur 3: Kjøre et eksperiment – den hjemmelagde prøveholderen. Eksperimenter kjøres i en hjemmelaget prøveholder som passer til dimensjonene til et standard mikroskopstadium. (A) En smurt parafilm avstandsstykke med tykkelse h (~ 150 μm) er plassert på en PEG-passivert deksel, og at coverslip er plassert i prøveholderen. (B) Actomyosinoppløsningen fremstilles på is i et Eppendorf-rør, og 1,1 μl av denne oppløsningen plasseres på dekselet; deretter (C) en annen PEG-passivert dekselslip plasseres på toppen av den, og (D) prøveholderen er skrudd for å begrense dråpen, som vedtar en platelignende form. Klikk her for å se en større versjon av denne figuren.
Figur 4: Poroelastisitetsmål (i). Actomyosin-nettverket oppfører seg som et elastisk materiale. (A) Skjematisk fremstilling av et actomyosinnettverk. (B) Actomyosin nettverk dannelse. Fluorescensmikroskopibilder viser at aktinfilamentene spontant kjerner og polymeriserer til et isotropisk sammenkoblet nettverk som grover med tiden og til slutt trekker seg makroskopisk sammen. Porøsiteten til nettverket er preget av nettverksmaskestørrelsen, ξ (dobbel pil). (VG Nett) Actomyosin-nettverkskontraksjon drives av glidning av aktinfilamentbunten. (C) Nettverkskontraksjon starter ved gelperiferien ("P") og forplanter seg innover i gelbulken. De hvite pilene viser kontraksjonsretningen. Gelsenteret er merket med en "C". De fluorescerende bildene viser at myosinmotoraggregatene (561 nm, røde prikker) er innebygd i aktinnettverket (488 nm, grønt) og forblir festet til det gjennom nettverkskontraksjon. (D) Aktinfilamentbuntene forblir rette under nettverkskontraksjon. Forholdet mellom konturlengden, l forts, og ende-til-ende avstand, lende-til-ende, som en funksjon av tid. (E) Fordeling av forholdet mellom konturlengden og ende-til-ende-avstanden ved t = 316 s (solid rød) og t = 327 s (stripet, grå). Innfelt: konturlengde (blå) og ende-til-ende-avstand (hvit) for en typisk bunt. Betingelser: (B, C, E [innfelt]): Bildene er tatt på et invertert fluorescerende mikroskop med et EMCCD-kamera og et 10x/0.3 Ph1 UPlanFL luftmål i vanlig modus (B) og i dobbel bildemodus etter bildeoverlegg (C, E [innfelt]). Skalastenger er (B,C) 100 μm og (E[innfelt]) 50 μm. Dette tallet er gjengitt med tillatelse fra Ideses et al.23. Klikk her for å se en større versjon av denne figuren.
Figur 5: Poroelastisitetsmål (ii). En utadgående løsningsmiddelstrøm genereres av myosinmotorisk kontraktilitet. (A) Avbildning av gelen ved lav forstørrelse ved mellomstadier av sammentrekning: samtidig fluorescensavbildning av et kontraherende aktinnettverk (488 nm, venstre) og 2,300 nm fluorescerende perler tilsatt løsningen (561 nm, høyre) som en funksjon av tid. Sirklene markerer posisjonene til fire perler. Pilene markerer den globale retningen for perlebevegelsen. (B) Banene til ni utvalgte perler er avbildet. Pilene markerer den globale radiale retningen til perlenes bevegelse. Det omkransede krysset angir gelsenteret (x0,y0) (C) Lokal radial perlehastighet νr (åpne sirkler) og (radial) gelkanthastighet (blå prikker) versus tid. De fylte sirklene indikerer tiden en gitt perle forlater gelgrensen. (VG Nett) Oppløsning av nettverksporøsiteten og bevegelsen av løsningsmidlet over gelporene ved avanserte stadier av sammentrekning. (D) Epifluorescensbilder av den kontraherende gelen og 200 nm diameter fluorescerende perler tilsatt oppløsningen. Både aktin og perler er begeistret på 488 nm. De røde sirklene følger posisjonen til en perle med tiden. Den grå linjen indikerer gelgrensen. (E) Perlens bane vist i (D). I feltet som vises, trekker gelen seg i gjennomsnitt mot bunnen. Koordinatene måles i forhold til kameraets opprinnelse. (F) Perlens lokale hastighet reflekterer gelens porøse struktur. Øverst: Lokal dråpehastighet (åpne sirkler), lokal gelhastighet (grå sirkler) og gelkanthastighet (blå sirkler) kontra tid. Nederst: Øyeblikksbilder viser perlens posisjon for merkede tider. Perlen er merket med en rød sirkel. Den stiplede linjen markerer tiden perlen kommer ut av gelen. (G) Fordeling av vinkler mellom lokal gel og lokale dråpehastigheter. Betingelser: Bilder er tatt på et invertert fluorescerende mikroskop med et EMCCD-kamera og (A) et 2.5x / 0.075 Plan-NEOFLUAR objektiv og (D, F) et 10x / 0.3 Ph1 UPlanFL mål. Skalastengene er (A) 400 μm, (D) 100 μm, (F) og 50 μm. Dette tallet er gjengitt med tillatelse fra Ideses et al.23. Klikk her for å se en større versjon av denne figuren.
Figur 6: Poroelastisitetsmål (iii). Stressavslapping er preget av en effektiv poroelastisk diffusjonskonstant. (A) Toppvisning fluorescensbilder av en kontraherende aktomyosingel ved lav forstørrelse fra blandingstiden opp til steady state. Hastighetsfeltet (grønne piler) er hentet fra PIV-analysen. Bildene er tatt på et invertert fluorescerende mikroskop med et EMCCD-kamera og et 2.5x/0.075 Plan-NEOFLUAR-objektiv. Eksitasjonsbølgelengden er 488 nm (aktin). Skalastangen er 500 μm. (B) Gelradius og (C) radiell kontraksjonshastighet, (dvs. gelkanthastigheten mot tiden). A angir akselerasjonen, Vmax angir maksimal hastighet, 
og τ er en karakteristisk avslapningstid. (D) Actomyosin-nettverkene oppfører seg som et poroelastisk aktivt materiale. 
og løsningsmiddelviskositet, η, versus glyserolvektprosent (vektprosent). Mengdene normaliseres til verdiene ved 0 vekt% glyserol. Gelens innledende radius er R = 1,400 μm. Feilfeltene er standardavvikene til de eksperimentelle verdiene. Dette tallet er gjengitt med tillatelse fra Ideses et al.23. Klikk her for å se en større versjon av denne figuren.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Discussion
Her brukes en in vitro-tilnærming for å karakterisere mekanikken til poroelastiske actomyosingeler som et modellsystem av cellecytoskelettet og mer generelt av cellecytoplasma, som har vist seg å oppføre seg som et poroelastisk materiale 3,5. Reologien til cellecytoskjelettet (cytoplasma) har vært preget av en poroelastisk diffusjonskonstant, som dikterer hvor lang tid det tar for det intracellulære cytosoliske væsken å omfordele seg i cellen etter påført mekanisk stress. Celler har blitt foreslått å bruke denne mekanismen til å regulere deres form5.
Motivert av disse funnene har vi utviklet et rammeverk for å studere poroelastisitet in vitro. Ved hjelp av det foreslåtte modellsystemet gir vi innsikt i hvordan myosinkontraktilitet bidrar til fremveksten av en væskestrøm og hvordan nettverkshastighet og løsningsmiddelhastighet direksjonalitet og hastighet korrelerer i tid og rom. Gjennom dette demonstrerer vi at nettverket og innebygd løsningsmiddel er sammenkoblet og ikke kan betraktes som separate objekter. Vi beskriver det eksperimentelle oppsettet og gir en detaljert protokoll for å forberede gelene og kjøre et eksperiment. Et detaljert rammeverk for datakvantifisering presenteres også. Det foreslåtte rammeverket kan enkelt tilpasses for å studere poroelastisitet i en rekke eksperimentelle oppsett og systemer, uavhengig av spesifisiteten til det eksperimentelle systemet som undersøkes.
Vi validerer poroelastisiteten til aktomyosinnettverkene ved å analysere endringene i tidsskalaen for stressavslapning. Vi velger å demonstrere dette ved å variere viskositeten til mediet ved å tilsette forskjellige mengder glyserol til actomyosinløsningen. Fordelen med å bruke glyserol er at det ikke påvirker porøsiteten og strukturen til nettverkene, og dermed er den eneste effekten på stressavslapping økningen i friksjon mellom den bevegelige løsningen og gelporene23. Endringer i nettverksporøsitet ville ha medført en ytterligere komplikasjon, da både den elastiske modulen og nettverksporestørrelsen påvirker avslapningstiden på en ikke-lineær måte 23,31,32.
Å kjøre vellykkede eksperimenter krever passivering av glassdekslene med en inert polymer. Dette trinnet er avgjørende. Prosedyren som brukes her for glasspassivering kan erstattes med andre prosedyrer dersom kvaliteten på passiveringen er bevart33,34. Defekt overflatepassivering kan gi opphav til massiv proteinadhesjon, noe som kan hemme nettverksmontering. Glasspassivering er også viktig for å forhindre samspillet mellom kontraheringsgelen og glassflatene. Dette vil føre til en ekstra friksjonsperiode, i tillegg til væske-gelfriksjonen som vurderes her, noe som ville være mye vanskeligere å estimere eller kvantifisere. Bortsett fra overflatepassivering, krever vellykkede eksperimenter bruk av fersk aktin. Videre er motorens aktivitet også avgjørende, og tilberedningen av friske partier myosin bør gjentas hver 3-4 måneder.
Samlet sett har denne eksperimentelle tilnærmingen vist seg å være vellykket for å studere poroelastisitet in vitro. En begrensning av den nåværende eksperimentelle prosedyren er hvordan man kan kontrollere de opprinnelige geldimensjonene mer robust. Et alternativ ville være å bruke preformerte kamre med kontrollerbare dimensjoner. Bruken av forhåndsformede kamre vil også tillate ikke bare forskeren å bedre kontrollere systemstørrelsen, men også å enkelt endre geometrien til systemet.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Disclosures
Forfatterne har ingenting å avsløre.
Acknowledgments
Vi takker Dina Aranovich for proteinrensing og merking. G.L. er takknemlig overfor Israels departement for vitenskap, teknologi og rom for Jabotinsky PhD-stipendet. ABG er takknemlig til Israel Science Foundation (stipend 2101/20) og til departementet for vitenskap og teknologi - staten Israel (grant 3-17491) for økonomisk støtte.
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| (3-Mercaptopropyl)trimethoxysilane | Sigma-Aldrich Company | 175617 | Stored under Argon atmosphere at 4 °C |
| Acetic acid | Bio-Lab ltd | 1070521 | |
| Alexa-Fluor 488 | Invitrogene | A10254 | Diluted with DMSO, stored under Argon atmosphere at -20 °C |
| Alexa-Fluor 647 | Invitrogene | A20347 | Diluted with DMSO, stored under Argon atmosphere at -20 °C |
| BSA | Sigma -Aldrich Company | A3059 | Stored at 4 °C |
| Catalase | Sigma -Aldrich Company | C9322 | The stock bottle is kept under dry atmosphere (silica gel) at -20 °C |
| Coverslips | Mezel-glaser | CG2222-1.5 | Kept in milliQ-water after the Piranha treatment and used within 3 weeks |
| Creatine kinase | Roche Life Science Products | 10736988001 | Prepared fresh in glycine buffer, kep on ice, and used within 3 days. The stock bottle is kept under dry atmosphere (silica gel) at 4 °C |
| Creatine phosphate | Roche Life Science Products | 10621714001 | When dissolved should be kept at -20 °C and used within 3 months. The stock bottle is kept under Argon atmosphere and stored at 4 °C |
| DTT | Roche Life Science Products | 10708984001 | When dissolved should be kept at -20 °C and used within 3 months |
| Dual view Simultaneous Imaging System | Photometrics | DV2-CUBE | |
| EGTA | MP Biomedicals | 195174 | |
| EM-CCD Camera | Andor Technology Ltd | DV 887 | |
| EM-CCD Camera | Photometrics | Evolve Delta | |
| Ethanol | Bio-Lab ltd | 525050300 | |
| Flourescence Lamp | Rapp Optoelectronic | ||
| Fluoresbrite YG Microspheres | Polysciences | 17151-10 | 200 nm diameter |
| Glucose | ICN Biomedicals Inc | 194024 | When dissolved should be kept at -20 °C and used within 3 months. |
| Glucose oxidase | Sigma-Aldrich Company | G7141 | Kept in -20 °C and used within 3 months. The stock powder is kept under Argon atmosphere and kept at -20 °C |
| Glycerol | ICN Biomedicals Inc | 800687 | |
| Glycine | MP Biomedicals | 808822 | |
| Hydrogen Peroxide | Sigma-Aldrich Company | 216763 | Stored at 4 °C |
| KCl | EMD Millipore Corp. | 529552 | |
| Methanol | Bio-Lab ltd | 1368052100 | |
| MgCl2 | EMD Millipore Corp. | 442615 | |
| Microscope | Leica Microsystems | DMI3000 | |
| mPEG-mal | Nanocs | PG1-ML-5k | Mw = 5000 Da. Divided to small batches by weight. Stored under Argon atmosphere at -20 °C |
| Nile red microspheres | Spherotech | FP-2056-2 | 2300 nm diameter |
| Objective (10x) | Leica Germany | HC PL AP0 | UPlanFL Numerical Aperture = 0.3 |
| Objective (2.5x) | Leica Germany | 506304 | Plan-NEOFLUAR Numerical Aperture = 0.075 |
| Oven | WTC Binder | ||
| Parafilm | Amcor | PM-996 | |
| PBS Buffer | Sigma-Aldrich Company | P4417 | |
| Shutter Driver | Vincet Associates | VMM D1 | |
| Silica gel | Merck | 1.01907.5000 | |
| Sonicator | Elma | Elmasonic P | |
| Sulfuric acid | Carlo Erba reagents | 410301 | |
| DV2 Dual-Channel Simultaneous-Imaging System | Photometrics | ||
| TRIS | MP Biomedicals | 819620 | |
| UV-VIS Spectrophotometer | Pharmacia | Ultraspec 2100 pro | |
| MICROMAN E | Gilson | FD10001 | 1–10 uL |
| MATLAB R2017b | MathWorks | Data quantification | |
| MetaMorph | Molecular devices | Control software of the optical imaging system; data quantification (particle tracking analysis, network mesh size) |
References
- Alberts, B., et al. Genesis, Modulation, and Regeneration of Skeletal Muscle In Molecular Biology of the Cell. 4th edition. , Garland Science. New York. (2002).
- Howard, J. Mechanics of Motor Proteins and the Cytoskeleton. , Sinauer Associates. Sunderland, MA. (2001).
- Mogilner, A., Manhart, A. Intracellular fluid mechanics: Coupling cytoplasmic flow with active cytoskeletal gel. Annual Review of Fluid Mechanics. 50 (1), 347-370 (2018).
- Bausch, A. R., Kroy, K. A bottom-up approach to cell mechanics. Nature Physics. 2 (4), 231-238 (2006).
- Moeendarbary, E., et al. The cytoplasm of living cells behaves as a poroelastic material. Nature Materials. 12 (3), 253-261 (2013).
- Charras, G. T., Mitchison, T. J., Mahadevan, L.
- Charras, G. T., Yarrow, J. C., Horton, M. A., Mahadevan, L., Mitchison, T. J. Non-equilibration of hydrostatic pressure in blebbing cells. Nature. 435 (7040), 365-369 (2005).
- Keren, K., Yam, P. T., Kinkhabwala, A., Mogilner, A., Theriot, J. A. Intracellular fluid flow in rapidly moving cells. Nature Cell Biology. 11 (10), 1219-1224 (2009).
- Paluch, E., Piel, M., Prost, J., Bornens, M., Sykes, C. Cortical actomyosin breakage triggers shape oscillations in cells and cell fragments. Biophysical Journal. 89 (1), 724-733 (2005).
- Liu, A. P., Fletcher, D. A. Biology under construction: In vitro reconstitution of cellular function. Nature Reviews Molecular Cell Biology. 10 (9), 644-650 (2009).
- Siton-Mendelson, O., Bernheim-Groswasser, A. Toward the reconstitution of synthetic cell motility. Cell Adhesion & Migration. 10 (5), 461-474 (2016).
- Bernheim-Groswasser, A., Wiesner, S., Golsteyn, R. M., Carlier, M. -F., Sykes, C. The dynamics of actin-based motility depend on surface parameters. Nature. 417 (6886), 308-311 (2002).
- Bieling, P., et al. Force feedback controls motor activity and mechanical properties of self-assembling branched actin networks. Cell. 164 (1-2), 115-127 (2016).
- Carvalho, K., et al. Actin polymerization or myosin contraction: two ways to build up cortical tension for symmetry breaking. Philosophical Transactions of the Royal Society B: Biological Sciences. 368 (1629), 20130005 (2013).
- Dayel, M. J., et al. In silico reconstitution of actin-based symmetry breaking and motility. PLoS Biology. 7 (9), e1000201 (2009).
- Manhart, A., et al. Quantitative regulation of the dynamic steady state of actin networks. eLife. 8, 42413 (2019).
- Siton, O., et al. Cortactin releases the brakes in actin-based motility by enhancing WASP-VCA detachment from Arp2/3 branches. Current Biology. 21 (24), 2092-2097 (2011).
- Pontani, L. -L., et al. Reconstitution of an actin cortex inside a liposome. Biophysical Journal. 96 (1), 192-198 (2009).
- Ideses, Y., Sonn-Segev, A., Roichman, Y., Bernheim-Groswasser, A. Myosin II does it all: Assembly, remodeling, and disassembly of actin networks are governed by myosin II activity. Soft Matter. 9 (29), 7127-7137 (2013).
- Backouche, F., Haviv, L., Groswasser, D., Bernheim-Groswasser, A. Active gels: Dynamics of patterning and self-organization. Physical Biology. 3 (4), 264 (2006).
- Alvarado, J., Sheinman, M., Sharma, A., MacKintosh, F. C., Koenderink, G. H. Molecular motors robustly drive active gels to a critically connected state. Nature Physics. 9 (9), 591-597 (2013).
- Linsmeier, I., et al. Disordered actomyosin networks are sufficient to produce cooperative and telescopic contractility. Nature Communications. 7 (1), 12615 (2016).
- Ideses, Y., et al. Spontaneous buckling of contractile poroelastic actomyosin sheets. Nature Communications. 9 (1), 2461 (2018).
- Spudich, J. A., Watt, S. The regulation of rabbit skeletal muscle contraction: I. Biochemical studies of the interaction of the tropomyosin-troponin complex with actin and the proteolytic fragments of myosin. Journal of Biological Chemistry. 246 (15), 4866-4871 (1971).
- Ono, S., et al. Identification of an actin binding region and a protein kinase C phosphorylation site on human fascin. Journal of Biological Chemistry. 272 (4), 2527-2533 (1997).
- Margossian, S. S., Lowey, S. Preparation of myosin and its subfragments from rabbit skeletal muscle. In Methods in Enzymology. 85, Academic Press. Cambridge, MA. 55-71 (1982).
- Quinlan, M. E., Forkey, J. N., Goldman, Y. E. Orientation of the myosin light chain region by single molecule total internal reflection fluorescence polarization microscopy. Biophysical Journal. 89 (2), 1132-1142 (2005).
- Cheng, N. -S. Formula for the viscosity of a glycerol−water mixture. Industrial & Engineering Chemistry Research. 47 (9), 3285-3288 (2008).
- Marsh, D., Bartucci, R., Sportelli, L. Lipid membranes with grafted polymers: Physicochemical aspects. Biochimica et Biophysica Acta (BBA) - Biomembranes. 1615 (1-2), 33-59 (2003).
- Strychalski, W., Guy, R. D. Intracellular pressure dynamics in blebbing cells. Biophysical Journal. 110 (5), 1168-1179 (2016).
- Head, D. A., Levine, A. J., MacKintosh, F. C. Distinct regimes of elastic response and deformation modes of crosslinked cytoskeletal and semiflexible polymer networks. Physical Review E. 68 (6), 061907 (2003).
- MacKintosh, F. C., Levine, A. J. Nonequilibrium mechanics and dynamics of motor-activated gels. Physical Review Letters. 100 (1), 018104 (2008).
- Melero, C., et al. Light-induced molecular adsorption of proteins using the PRIMO system for micro-patterning to study cell responses to extracellular matrix proteins. Journal of Visualized Experiments. (152), e60092 (2019).
- Bendix, P. M., et al. A quantitative analysis of contractility in active cytoskeletal protein networks. Biophysical Journal. 94 (8), 3126-3136 (2008).
