Waiting
Elaborazione accesso...

Trial ends in Request Full Access Tell Your Colleague About Jove
JoVE Journal Bioengineering
Click here for the English version

Bioengineering

ميكانيكا شبكات الأكتوميوسين المرنة (البورية) الانقباضية كنظام نموذجي للهيكل الخلوي الخلوي

Published: March 10, 2023 doi: 10.3791/64377
Automatic Translation
1, 1, 1, 1,2
1Department of Chemical Engineering, Ben Gurion University of the Negev, 2Department of Chemical Engineering, Ilse Kats Institute for Nanoscale Science and Technology, Ben Gurion University of the Negev

Summary

في هذا العمل ، تم استخدام نهج إعادة التكوين في المختبر لدراسة المرونة المسامية لجل الأكتوميوسين في ظل ظروف خاضعة للرقابة. يتم تحديد ديناميكيات هلام actomyosin والمذيب المضمن ، والتي من خلالها يتم إثبات مرونة الشبكة المسامية. نناقش أيضا التحديات التجريبية والمزالق الشائعة وأهميتها لميكانيكا الهيكل الخلوي الخلوي.

Abstract

يمكن للخلايا تغيير أشكالها بنشاط وتصبح متحركة ، وهي خاصية تعتمد على قدرتها على إعادة تنظيم بنيتها الداخلية بنشاط. تعزى هذه الميزة إلى الخصائص الميكانيكية والديناميكية للهيكل الخلوي الخلوي ، ولا سيما الهيكل الخلوي actomyosin ، وهو هلام نشط من خيوط الأكتين القطبية ، ومحركات الميوسين ، والبروتينات الملحقة التي تظهر خصائص الانكماش الجوهري. الرأي المقبول عادة هو أن الهيكل الخلوي يتصرف كمادة لزجة مرنة. ومع ذلك ، لا يمكن لهذا النموذج دائما تفسير النتائج التجريبية ، والتي تكون أكثر اتساقا مع صورة تصف الهيكل الخلوي بأنه مادة نشطة مرنة مسامية - شبكة مرنة مدمجة مع العصارة الخلوية. تدفع تدرجات الانقباض الناتجة عن محركات الميوسين تدفق السيتوسول عبر مسام الجل ، مما يشير إلى أن ميكانيكا الهيكل الخلوي والسيتوسول مرتبطة بإحكام. تتمثل إحدى السمات الرئيسية لمرونة المسام في الاسترخاء المنتشر للضغوط في الشبكة ، والتي تتميز بثابت انتشار فعال يعتمد على معامل مرونة الهلام ، والمسامية ، ولزوجة السيتوسول (المذيبات). نظرا لأن الخلايا لديها العديد من الطرق لتنظيم بنيتها وخواص المواد ، فإن فهمنا الحالي لكيفية اقتران ميكانيكا الهيكل الخلوي وديناميكيات تدفق السيتوسول لا يزال غير مفهوم بشكل جيد. هنا ، يتم استخدام نهج إعادة التكوين في المختبر لتوصيف الخصائص المادية لجل actomyosin poroelastic كنظام نموذجي للهيكل الخلوي الخلوي. الانكماش الهلامي مدفوع بانقباض محرك الميوسين ، مما يؤدي إلى ظهور تدفق المذيب المخترق. تصف الورقة كيفية تحضير هذه المواد الهلامية وإجراء التجارب. نناقش أيضا كيفية قياس وتحليل تدفق المذيبات وتقلص الهلام على المستويين المحلي والعالمي. يتم إعطاء علاقات القياس المختلفة المستخدمة لقياس كمية البيانات. أخيرا ، تتم مناقشة التحديات التجريبية والمزالق الشائعة ، بما في ذلك صلتها بميكانيكا الهيكل الخلوي الخلوي.

Introduction

الخلايا الحية لها خصائص ميكانيكية فريدة. إلى جانب القدرة على الاستجابة السلبية للقوى المطبقة ، فهي أيضا قادرة على توليد القوى بنشاط استجابة للمنبهات الخارجية1. تعزى هذه الخصائص ، الضرورية لمجموعة متنوعة من العمليات الخلوية ، لا سيما أثناء حركة الخلية ، في المقام الأول إلى الخصائص الميكانيكية والديناميكية للهيكل الخلوي للخلية ، وخاصة الهيكل الخلوي actomyosin ، وهو هلام نشط من خيوط الأكتين القطبية ، والمحركات الجزيئية للميوسين ، والبروتينات الملحقة. تظهر شبكات الأكتوميوسين هذه خصائص ذاتية التنظيم والانكماش الجوهرية مدفوعة ببروتينات الميوسين الحركية ، والتي تربط خيوط الأكتين وتولد بنشاط ضغوطا ميكانيكية في الشبكة التي يغذيها التحلل المائي ATP2.

أجريت العديد من الدراسات التجريبية والنظرية لدراسة الخصائص المادية للهيكل الخلوي3. الرأي المقبول عموما هو أن الهيكل الخلوي يتصرف كمادة لزجةمرنة 4. هذا يعني أنه على نطاقات زمنية قصيرة ، يتصرف الهيكل الخلوي كمادة مرنة ، وعلى فترات زمنية طويلة ، يتصرف كسائل لزج بسبب البروتينات المتشابكة وانفصال محرك الميوسين (وإعادة الارتباط) ، مما يسمح للشبكة بالدوران ديناميكيا. ومع ذلك ، في كثير من الحالات ، لا يمكن للنموذج اللزج المرن وصف النتائج التجريبية ، والتي تكون أكثر اتساقا مع الصورة التي تصف الهيكل الخلوي ، وبشكل عام ، سيتوبلازم الخلية الذي يوصف بأنه مادة فعالة مساميةمرنة 5,6. ميزتان رئيسيتان تميزان هذه الأنواع من المواد. (ط) السمة الرئيسية الأولى هي توليد تدفق السيتوسول المخترق ("المذيب") عبر مسام الهلام عن طريق تدرجات انقباضية مدفوعة بمحركات الميوسين ، والتي تكمن وراء عمليات مثل تفجير الخلية7 ، والحركة8 ، وتذبذبات شكل الخلية9. يمكن أن يكون ظهور مثل هذه التدفقات الخلوية محليا ، أو للنفخ ، أو عالميا ، كما هو الحال في حركة الخلية. في الحالة الأخيرة ، تدفع الضغوط المطبقة بالانقباض في مؤخرة الخلية تدفق السائل الخلوي نحو مقدمة الخلية ، والتي تغذي تجمع البروتين اللازم لتجميع الصفيحة8. (ii) الميزة الرئيسية الثانية هي أن استرخاء الإجهادات منتشر ويتميز بثابت انتشار فعال ، والذي يعتمد على معامل مرونة الهلام ، ومسامية الهلام ، ولزوجة المذيب5. يحدد ثابت الانتشار المسامي المرن مدى سرعة استجابة النظام للإجهاد المطبق. تتوافق ثوابت الانتشار الأعلى مع إعادة توزيع الإجهاد بشكل أسرع. وهذا بدوره يحدد المدة التي يستغرقها السائل الخلوي داخل الخلايا لإعادة توزيعه داخل الخلية بعد الضغط الميكانيكي المطبق، سواء كان خارجيا أو داخليا، مثل الضغوط الانقباضية النشطة الناتجة عن محركات الميوسين. وبالتالي ، توضح هذه الأمثلة أن ميكانيكا الهيكل الخلوي والسيتوسول مقترنة بإحكام ولا يمكن معالجتها بشكل منفصل3.

نظرا لأن الخلايا يمكنها تنظيم خواصها الميكانيكية بعدة طرق ، فإن التفاعل بين ميكانيكا الشبكة وديناميكيات تدفق السوائل لا يزال غير مفهوم بشكل جيد. يتمثل النهج البديل القوي في استخدام الأنظمة المعاد تشكيلها في المختبر والتي تسمح بالتحكم الكامل في المكونات المجهرية المختلفة ومعلمات النظام ، مما يجعل هذه الأنظمة النموذجية مثالية للتحليل المادي10,11. تم استخدام هذا النهج بنجاح لدراسة تأثير تركيب البروتين وهندسة النظام على الحركة القائمة على الأكتين 12،13،14،15،16،17،18 ، والنمط ثنائي الأبعاد لشبكات الأكتوميوسين 19،20،21،22، والتفاعل بين انقباض الشبكة وديناميات تدفق السوائل لجل الأكتوميوسين المرن ، وهو محور هذه الورقة23.

في هذه المخطوطة ، تمت مناقشة إعداد شبكات الأكتوميوسين المرنة المقلصة ذات الأبعاد التي يمكن التحكم فيها وخصائص المواد بناء على عمل Ideses et al.23. يتم تحليل ديناميكيات الجل المتعاقد والمذيب المصفى وقياسها ، والتي من خلالها يتم إثبات أن هذه المواد الهلامية actomyosin يمكن وصفها بأنها مادة فعالة poroelastic. تؤكد دراسة تأثير لزوجة المذيبات على انتشار الإجهاد الطبيعة المسامية لهذه الشبكات. يتم توفير علاقات القياس المختلفة المستخدمة لقياس كمية البيانات. أخيرا ، تتم مناقشة التحديات التجريبية والمزالق الشائعة وأهمية النتائج التجريبية للهيكل الخلوي الخلوي.

Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.

Protocol

1. معالجة سطح الزجاج والتخميل:

ملاحظة: يتضمن هذا القسم ثلاث خطوات رئيسية (انظر الشكل 1): (i) التنظيف والتجفيف المائي ، (ii) silanization ، و (iii) التخميل السطحي.

  1. التنظيف والتجفيد المائي
    1. استخدم محلول سمكة البيرانا لتنظيف الأسطح الزجاجية.
      ملاحظة: محلول سمكة البيرانا عبارة عن خليط من 30٪ H 2 O 2 و 70٪ H2SO4 (جدول المواد). هدفها الرئيسي هو إزالة الملوثات العضوية من أسطح الغطاء وفضح مجموعات OH على السطح الزجاجي. بهذه الطريقة ، يصبح السطح الزجاجي محبا للماء.
    2. ضع 10-12 # 1.5 (22 مم × 22 مم) أغطية زجاجية (جدول المواد) في حامل بولي تترافلورو إيثيلين محلي الصنع (مساحة القاعدة: 5.5 سم × 5.5 سم). انقل حامل البولي تترافلورو إيثيلين إلى دورق سعة 400 مل (جدول المواد) ، واحتضانه ب 300 مل من محلول سمكة البيرانا لمدة 2 ساعة. قم بهذه الخطوة على الجليد وفي غطاء كيميائي.
      ملاحظة: يبلغ طول عمود البولي تترافلورو إيثيلين الملولب بقاعدة الحامل 12 سم ، وهو أطول من الدورق (11 سم) ، مما يسمح بالنقل / السحب الآمن للحامل من / إلى محلول سمكة البيرانا. نظرا لأن محلول سمكة البيرانا لا يزال شديد التفاعل وساخنا جدا ، فمن الضروري إيقاف التفاعل. أسهل طريقة لإيقاف التفاعل هي صب محلول سمكة البيرانا في ماء (صنبور) لتحقيق تخفيف 50x (على الأقل). يمكن بعد ذلك التخلص من المحلول بأمان. لا تحتفظ أبدا بمحلول سمكة البيرانا المستخدم في زجاجة زجاجية مغلقة - فقد ينتهي ذلك بانفجار زجاجة.
    3. انقل حامل البولي تترافلورو إيثيلين إلى دورق نظيف مملوء بالماء المقطر المزدوج الطازج (DDW) لغسل سمكة البيرانا الزائدة من أغطية الغطاء.
    4. انقل الدورق إلى حمام صوتنة (جدول المواد) ، وقم بصوتنة عند 80 هرتز بكامل طاقتها لمدة 10 دقائق عند 25 درجة مئوية. كرر هذه الخطوة مرتين أخريين مع DDW جديد. استخدم DDW جديدا في كل مرة.
  2. التثليق
    1. انقل الحامل إلى دورق نظيف (400 مل) مملوء ب 300 مل من الميثانول النقي (جدول المواد) ثم إلى حمام صوتنة (جدول المواد). Sonicate عند 80 هرتز بكامل طاقتها لمدة 30 دقيقة عند 25 درجة مئوية.
    2. بعد الصوتنة ، انقل الحامل إلى محلول silane محضر باستخدام 15 مل من DDW ، و 3.1 مل من حمض الأسيتيك (جدول المواد) ، و 340 مل من الميثانول ، و 7.6 مل من السيلان ((3-Mercaptopropyl) تريميثوكسيسيلان) (جدول المواد). أغلق الدورق بالبارافيلم ، واحتفظ به في الثلاجة على حرارة 4 درجات مئوية طوال الليل.
      ملاحظة: يجب أن يتم تحضير محلول السيلان والتعامل معه في غطاء كيميائي. بعد خطوة silanization ، ضع محلول silane المستخدم (النفايات) في زجاجة زجاجية مخصصة داخل الغطاء الكيميائي.
    3. في اليوم التالي، انقل الحامل إلى كأس زجاجية نظيفة مملوءة ب 300 mL من الميثانول النقي لمدة 15 ثانية. بعد ذلك ، انقل الحامل إلى دورق نظيف ، وليس قبل تجفيف الجزء السفلي من حامل polytetrafluoroethylene لإزالة الميثانول الزائد. انقلي الدورق إلى الفرن (جدول المواد) لتجفيف أغطية الزجاج لمدة 5 دقائق على حرارة 120 درجة مئوية.
  3. التخميل السطحي باستخدام بوليمر خامل
    1. تحقيق التخميل السطحي عن طريق احتضان أغطية الزجاج ببوليمر خامل (جدول المواد). لكل تجربة ، خذ اثنين من أغطية الغطاء وضعهما في طبق بتري مغطى بطبقة بارافيلم تم تنظيفها في البداية بالإيثانول (EtOH) (DDW / EtOH: 30/70 vol / vol) (جدول المواد).
    2. احتضان كل غطاء مع 1 مل من 4 ملغ · مل − 1 5 كيلو دالتون الوزن الجزيئي ميثوكسي بولي إيثيلين جلايكول ماليميد (mPEG-mal ، Mw = 5 كيلو دالتون) (جدول المواد) في 1x محلول ملحي مخزن للفوسفات (PBS) (جدول المواد) لمدة 1 ساعة عند 22 درجة مئوية.
      ملاحظة: يؤدي وضع أغطية الغطاء على طبقة بارافيلم كارهة للماء إلى حصر محلول بوليمر PEG المحب للماء على سطح الغطاء الزجاجي. وقت الحضانة أمر بالغ الأهمية لتحقيق التخميل الأمثل. استخدم أوقات الحضانة التي تتراوح بين 45 دقيقة و 2 ساعة. فوق وقت الحضانة هذا ، يمكن أن يتدهور سطح الغطاء الزجاجي ، مما يؤدي إلى التصاق البروتين وفقدان الشفافية.
    3. في نهاية عملية الحضانة ، شطف كل غطاء مع 5 مل من DDW ، وجفف مع تدفق N2 (الغاز). لا تجفف أغطية الأغطية تحت الفراغ. نظرا لأنه يجب أن تبقى أغطية الغطاء مبللة بعد التخميل ، ضع على الفور 1 مل من 10 mM Tris على الأسطح pegylated. استخدم أغطية الغطاء في غضون 2 ساعة.
      ملاحظة: يجب تنفيذ الخطوات المختلفة في غرفة التدفق الصفحي لمنع تلوث سطح الزجاج.

2. تنقية البروتين

  1. تنقية G-actin من مسحوق الأسيتون العضلي الهيكلي للأرنب باستخدام طريقة ترشيح الجل24.
    1. تنقية الأكتين يستغرق 1 أسبوع. احتفظ ب G-actin المنقى في G-buffer (5 mM Tris pH 7.8 ، 0.01٪ NaN3 ، 0.1 mM CaCl 2 ،0.2 mM ATP ، و 1 mM DTT) ، وقم بتخزينه على الجليد. استخدام الحل في غضون 2 أسابيع.
      ملاحظة: استبدل الثلج كل يومين.
    2. قم بتسمية الأكتين بصبغة فلورية معدلة بالماليميد16 (جدول المواد). تنقية GST-fascin على أساس طريقة Ono et al.25. قم بتجميد كلا البروتينين في السائل N2 ، وخزنه في -80 درجة مئوية.
  2. استخدم بروتوكولا قياسيا لتنقية الميوسين II من العضلات الهيكلية للأرنب26. يشتمل مخزن الميوسين II المنقى (dimers) على 10 mM Tris pH 7.4 و 0.5 M KCl و 35٪ w / v السكروز. قم بتجميد الميوسين في السائل N2 ، واحفظه في -80 درجة مئوية.
    ملاحظة: يحافظ التركيز العالي ل KCl على محركات الميوسين في شكل ثنائي ، بينما تضمن النسبة العالية من السكروز عدم إعاقة نشاط المحركات عند التجميد. استخدم ماصة مخصصة لمعالجة السوائل اللزجة عند العمل مع محاليل مخزون الميوسين II (جدول المواد).
    1. قم بتسمية dimers myosin II بصبغة فلورية (جدول المواد) في أزواج من بقايا السيستين المهندسة19,27. استخدم قوانص الدجاج RLC الطافرة A لهذا الغرض26. قم بتجميد الميوسين II المسمى في السائل N2 ، وقم بتخزينه في درجة حرارة -80 درجة مئوية.
      ملاحظة: يضمن إجراء وضع العلامات هذا أن الميوسين المسمى نشط كبروتين الميوسين II الأصلي.
  3. استخدم مقياس الطيف الضوئي للأشعة المرئية وفوق البنفسجية (جدول المواد) لقياس امتصاص محاليل بروتين المخزون ، واستنتاج تركيزات البروتين باستخدام قانون بير لامبرت باستخدام معاملات الانقراض التالية: G-actin (ε290 = 26,460 M−1 · cm−1) ، GST-fascin (ε 280 = 99,330 M−1 · cm−1) ، الميوسين II dimer (ε280 = 268,800 M−1 · cm−1) ، و RLC الطافر A (ε280 = 3,960 M−1 · سم − 1) 19.

3. إعداد عينة

ملاحظة: بلمرة مونومرات الأكتين في وجود مجاميع كبيرة من محركات الميوسين II و fascin المتشابك السلبي القوي لإنتاج شبكات أكتوميوسين مرنة مقلصة مجهريا19,23. تسمح إضافة حبات الفلورسنت إلى المحلول بتتبع تدفق المذيبات أثناء تقلص الهلام.

  1. محلول البروتين ("أكتوميوسين")
    1. باستثناء G-actin ، احتفظ بالبروتينات عند -80 درجة مئوية في قسومات صغيرة ، وقم بإذابتها عند 37 درجة مئوية قبل الاستخدام. الحجم الكلي لمحلول الأكتوميوسين هو 40 ميكرولتر.
    2. تحضير المحلول عن طريق خلط 10 mM Tris pH 7.4 ، 2 mM MgCl2 ، 25 mM KCl ، 1 mM ATP ، نظام تجديد ATP (0.5 mg · mL −1 الكرياتين كيناز و 5 mM فوسفات الكرياتين) ، 200 μM EGTA (مخلبات Ca2+ أيونات) ، محلول مضاد للتبييض (0.1 مجم · مل −1 أوكسيديز الجلوكوز ، 0.018 مجم · مل −1 كاتلاز ، و 5 مجم · مل −1 جلوكوز) ، 5 ميكرومتر G-actin ، 280 نانومتر GST-fascin ، و 1.67 نانومتر ميوسين II. النسبة المئوية لل G-actin المسمى هي 5٪ (النسبة المولية).
      ملاحظة: استخدم نسبة منخفضة من G-actin المسمى لتجنب تشبع إشارة الفلورسنت في المراحل المتقدمة من تقلص الهلام.
  2. تحضير الركام الحركي للميوسين II
    1. أضف محركات الميوسين إلى محلول البروتين في صورة مجاميع. لتكوين مجاميع الميوسين الكبيرة (150 ميوسين دايمرات / ركم) ، قم بتخفيف محلول مخزون الميوسين ب 10 mM Tris pH 7.4 للوصول إلى تركيز نهائي قدره 25 mM KCl.
    2. احتفظ بمحلول الميوسين المخفف لمدة 10 دقائق في درجة حرارة الغرفة (RT) ، ثم انقله إلى الثلج حتى الاستخدام. المحركات نشطة بالكامل لمدة تصل إلى 2 ساعة.
  3. قياس تدفق المذيبات
    1. لتتبع تدفق المذيب عبر مسام الجل ، أضف حبات الفلورسنت إلى محلول الأكتوميوسين. تقليل التفاعل بين الخرز وشبكة الأكتوميوسين عن طريق تخميل الخرزات. عمليا ، احتضان 1 ميكرولتر من الخرز (جدول المواد) مع 5 ميكرومتر G-actin لمدة 20 دقيقة في RT ، ثم قم بإزالة G-actin الزائد عن طريق الطرد المركزي (جدول المواد) (الشروط: 6000 × جم لمدة 5 دقائق عند 4 درجات مئوية).
    2. كرر هذه الخطوة مع 10 ملغ · مل − 1 ألبومين مصل البقر (BSA) (جدول المواد) لمنع (ربما) السطح غير المطلي المتبقي. استخدم الخرزات بتخفيف نهائي قدره 1: 10,000 مجلد / مجلد في التجارب.
      ملاحظة: من المهم تكييف قطر الخرز مع حجم مسام الجل بحيث تكون نسبة حجم الخرزة / المسام <1 في جميع المراحل.
  4. تأثير لزوجة المحلول
    1. تحكم في لزوجة المحلول بإضافة الجلسرين (جدول المواد) إلى محلول الأكتوميوسين. تؤدي إضافة الجلسرين بنسبة وزن تتراوح من 0٪ إلى 34٪ إلى زيادة مقابلة في لزوجة المحلول من η ω إلى 2.76 η ω ، حيث η ω هي لزوجة الماء عند 20 درجة مئوية28.
      ملاحظة: من الضروري استخدام ماصة مخصصة لمعالجة السوائل اللزجة عند العمل مع الجلسرين (جدول المواد).

4. تشغيل تجربة

  1. التعامل مع حامل عينة محلية الصنع
    1. خذ إحدى قسائم الغطاء المخملة ب PEG ، وضع فاصل بارافيلم مدهون فوقها ، وضعها في حامل العينة.
      ملاحظة: يمكن للمرء استبدال فاصل parafilm مع أي فاصل.
  2. تحضير محلول أكتوميوسين
    1. تحضير محلول الأكتوميوسين على الجليد في أنبوب طرد مركزي دقيق عن طريق دمج المكونات المجهرية المختلفة ، وإضافة مجاميع محرك الميوسين II ، وإضافة EGTA أخيرا. خلط الحل جيدا. تؤدي إضافة EGTA إلى بدء بلمرة شبكة الأكتوميوسين ، والتي تحدد وقت بدء التجربة.
  3. ضع 1.1 ميكرولتر من هذا المحلول على شريحة الغطاء المثبتة على الحامل ، وضع غطاء الغطاء الثاني في الأعلى. المسمار حامل لختم العينة. تضغط هذه العملية قليلا على القطرة ، والتي تعتمد شكلا يشبه القرص. تتراوح أقطار السقوط بين 2800-3000 ميكرومتر.
  4. ضع حامل العينة على المجهر ، وابدأ عملية الاستحواذ. تحضير المجهر مقدما لتقليل وقت الاستحواذ الأولي. عادة ما يستغرق 1-2 دقيقة بعد الخلط لبدء تصوير العينة.

5. تقنيات الفحص المجهري

  1. قم بتصوير العينات باستخدام مجهر فلوري مقلوب (جدول المواد) يتم التحكم فيه بواسطة برنامج مخصص (جدول المواد).
    1. استخدم تكبيرات منخفضة تبلغ 2.5x / 0.075 Plan-NEOFLUAR (جدول المواد) لتصور منطقة الهلام بأكملها ومتابعة تقلصها العياني مع مرور الوقت.
    2. استخدم هدف 10x / 0.3 Ph1 UPlanFL (جدول المواد) لتوصيف مسامية الشبكة وهيكلها ومتابعة التنظيم الذاتي للشبكة وانكماشها مع مرور الوقت.
      ملاحظة: هذا الهدف مفيد أيضا لتوطين الركام الحركي للميوسين II داخل الشبكة ومتابعة حركة حبات الفلورسنت عبر مسام الهلام. يمكن استخدام التكبيرات الأعلى على حساب مجال رؤية منخفض ، وهو أكثر أهمية في وضع التصوير ثنائي اللون (جدول المواد).
  2. قم بإثارة العينات عند 488 نانومتر (حبات الأكتين / الفلورسنت) و 561 نانومتر (مجاميع محرك الميوسين / حبات الفلورسنت). احصل على الصور بسرعة 100 مللي ثانية لكل إطار باستخدام برنامج مخصص (جدول المواد) في وضع البث باستخدام كاميرا جهاز مضاعفة الشحنة الإلكترونية (EMCCD) (جدول المواد).
    ملاحظة: يجب الحفاظ على شدة مصباح الفلورسنت (جدول المواد) عند أدنى قيمة ممكنة لتجنب تشبع الإشارة أثناء تقلص الشبكة.
  3. تصوير متزامن بلونين
    1. استخدم هذا الوضع لغرضين: (i) الكشف عن توطين مجاميع محرك الميوسين داخل شبكة الأكتين ، و (i) توصيف تدفق المذيب الخارجي داخل وخارج أثناء تقلص الشبكة.
    2. قم بإثارة محركات الأكتين والميوسين II عند 488 نانومتر و 561 نانومتر ، على التوالي ، وسجل الصور في وقت واحد على كاميرا EMCCD (جدول المواد) باستخدام جهاز ثنائي الانبعاثات (جدول المواد). استخدم نفس نظام التصوير لتصوير جل الأكتين (488 نانومتر) وحبات الفلورسنت (561 نانومتر) في وقت واحد.

Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.

Representative Results

يتم استخدام اثنين من أغطية الزجاج لكل تجربة. يتم تنظيف أغطية الزجاج وتخميلها باستخدام بوليمرات PEG. التخميل ضروري لمنع البروتينات القابلة للذوبان من الالتصاق بالأسطح الزجاجية في المراحل التجريبية المبكرة ولتقليل تفاعل شبكة التعاقد مع الجدران الزجاجية. يمكن أن يؤدي الفشل في تحقيق التخميل الجيد إلى انكماش غير فعال ، وفي الحالات القصوى ، يمكن أن يمنع تكوين شبكة الأكتين.

يصف الشكل 1 الخطوات الرئيسية الثلاث لإجراء المعالجة السطحية. وتشمل هذه الخطوات ما يلي: (ط) تنظيف الأسطح والتجفيد بالماء باستخدام محلول سمكة البيرانا، الذي يزيل التلوث العضوي من أسطح الغطاء المنزلق ويكشف مجموعات OH على السطح الزجاجي؛ (ب) تنظيف الأسطح وتجفيفها بالماء باستخدام محلول سمكة البيرانا، الذي يزيل التلوث العضوي من أسطح الغطاء المنزلق ويكشف مجموعات OH على السطح الزجاجي؛ (ب) تنظيف الأسطح وتجفيفها بالماء باستخدام محلول سمكة البيرانا، الذي يزيل التلوث العضوي من أسطح الغطاء المنزلق ويكشف مجموعات OH على السطح الزجاجي؛ (ب) تنظيف الأسطح وتجفيفها بالماء باستخدام (ii) صمت السطح باستخدام (3-Mercaptopropyl) trimethoxysilane ، والذي يهدف إلى ربط السيلان تساهميا بالسطح الزجاجي ، حيث ينتهي كل جزيء silane بمجموعة SH ؛ (iii) التخميل مع بوليمرات PEG (MPEG-MAL ، 5 kDa) - في هذه الخطوة ، تتفاعل مجموعة maleimide لبوليمر PEG تساهميا مع مجموعة SH على (3-Mercaptopropyl) trimethoxysilane ، مما يؤدي إلى تكوين طبقة أحادية PEG على السطح الزجاجي.

لمعالجة سمكة البيرانا و silanization ، يتم وضع 10-12 غطاء زجاجي # 1.5 (22 مم × 22 مم) في حامل بولي تترافلورو إيثيلين (الشكل 2 أ) ، ويتم نقل هذا الحامل إلى دورق سعة 400 مل. بالنسبة لخطوة التخميل ، يتم نقل غطاءين زجاجيين إلى طبق بتري مطلي بالبارافيلم (الشكل 2 ب). يضمن وضع أغطية الغطاء على طبقة بارافيلم كارهة للماء أن يظل محلول بوليمر PEG المحب للماء محصورا على السطح الزجاجي طوال فترة الحضانة. يتم تحضين كل غطاء ب 1 مل من 4 مجم · مل − 1 5 كيلو دالتون mPEG-mal في 1x PBS لمدة 1 ساعة عند 22 درجة مئوية (الشكل 2 ب). بالنسبة لهذا الوزن والتركيز الجزيئي لبوليمر PEG ، يؤدي تخميل الزجاج إلى تكوين طبقة أحادية PEG ، حيث يكون كل بوليمر PEG في شكل يشبه الفطر29. في نهاية عملية الحضانة ، يتم شطف كل غطاء ب 5 مل من DDW وتجفيفه بتدفق N2 (غاز). إذا لم يتم استخدام أغطية الغطاء على الفور ، فيجب وضع 1 مل من 10 مللي متر Tris على الأسطح المثبتة للحفاظ على رطوبة أسطح الغطاء. يتم تجفيف أغطية الغطاء بتدفق N2 (غاز) قبل بدء التجربة مباشرة. من الأفضل استخدام أغطية الغطاء في غضون 2 ساعة.

تتشكل شبكات الأكتوميوسين المرنة المقلصة مجهريا عن طريق خلط 5 ميكرومتر G-actin مع 16.7 نانومتر ميوسين ، والذي يضاف في شكل مجاميع كبيرة (~ 150 ميوسين دايمرات / مجاميع) ، و 280 نانومتر من اللفافة المتشابكة القوية. يشتمل المحلول على 1 mM ATP ، والذي يتم الاحتفاظ به ثابتا باستخدام نظام تجديد ATP ومحلول مضاد للتبييض (انظر التفاصيل في قسم البروتوكول). لتحليل تدفق المذيب المخترق ، تضاف حبات الفلورسنت إلى محلول الأكتوميوسين.

يتم إجراء التجارب في حامل عينة محلي الصنع ، والذي يناسب أبعاد مرحلة المجهر القياسية (الشكل 3). يتم وضع فاصل بارافيلم مدهون بسمك h (~ 150 ميكرومتر) على واحدة من اثنين من أغطية PEG ، ويتم وضع غطاء الغطاء هذا في حامل العينة (الشكل 3 أ). بعد ذلك ، يتم تحضير محلول الأكتوميوسين على الجليد في أنبوب طرد مركزي دقيق عن طريق دمج المكونات المجهرية المختلفة ، وإضافة آخر G-actin ، ومجاميع الميوسين ، ثم EGTA ، الذي يؤدي إلى بلمرة الأكتين. يجب خلط المحلول جيدا - وهذا يحدد وقت بدء التجارب (t = 0). على الفور ، يتم وضع 1.1 ميكرولتر من هذا المحلول على غطاء الغطاء (الشكل 3B) ، ويتم وضع غطاء PEG الثاني فوقه (الشكل 3C) ، ويتم تثبيت الحامل لحصر السقوط بينهما (الشكل 3D). بالنسبة لحجم السقوط ونوع المباعد ، يبلغ قطر السقوط حوالي 3000 ميكرومتر ، لكن يجب ألا يعتمد الباحثون على هذه القيم المقدرة. يجب دائما قياس سمك السقوط الفعلي وقطره مباشرة من الصور المجهرية. للسمك ، يجب استخدام مجهر متحد البؤر.

يتم وضع حامل العينة على المجهر ، ويبدأ الاستحواذ. يجب إعداد المجهر مسبقا لتقليل الوقت اللازم لبدء الاستحواذ إلى الحد الأدنى. عادة ما يستغرق 1-2 دقيقة لبدء تصوير العينة. يتم إثارة العينات عند 488 نانومتر و / أو 561 نانومتر ويتم تصويرها باستخدام مجهر فلوري مقلوب يتم التحكم فيه بواسطة برنامج مخصص. يجب الحصول على الصور بمعدل 100 مللي ثانية لكل إطار (أو أقل) في وضع البث باستخدام كاميرا EMCCD. لتصوير شبكة الأكتين ومجاميع محرك الميوسين في وقت واحد ، أو حبات الفلورسنت في المحلول ، يجب استخدام نظام انبعاث مزدوج. يجب أن تبقى شدة مصباح الفلورسنت منخفضة قدر الإمكان لتجنب تشبع الإشارة في المراحل المتقدمة من تقلص الشبكة.

تم استخدام هدف 2.5x / 0.075 Plan-NEOFLUAR لتوصيف ديناميكيات الانكماش الجانبي للهلام واتجاه تدفق السوائل وسرعته على مقياس طول الهلام. هذه صور منخفضة الدقة مفيدة لمتابعة التغيرات في نصف قطر الهلام مع مرور الوقت ، والتي يمكن من خلالها استنتاج سرعة الانكماش الشعاعي (الجانبي) الهلامية. لحل بنية ومسامية الشبكة ، وموقع مجاميع محرك الميوسين داخل الشبكة وحركة حبات الفلورسنت الفردية عبر مسام الهلام ، يجب استخدام أهداف تكبير أعلى (على سبيل المثال ، هدف 10x / 0.3 Ph1 UPlanFL). يمكن أيضا استخدام التكبير العالي ولكن على حساب مجال رؤية منخفض ، وهو أمر أكثر أهمية إذا تم استخدام وضع التصوير ثنائي اللون. يجب استكمال بيانات الفحص المجهري الفلوري (2D) بتصوير متحد البؤر للهلام المتعاقد في 3D لتوصيف ديناميكيات الانكماش في كل من الاتجاهين الجانبي والرأسي. يستخدم الفحص المجهري متحد البؤر لقياس التباعد بين سفلي الغطاء - تحدد هذه المسافة سمك الهلام الأولي. بالإضافة إلى ذلك ، يجب قياس سمك الجل في نهاية التجربة عند تحقيق حالة مستقرة ميكانيكيا.

يجب استيفاء عدة معايير لإظهار أن شبكات الأكتوميوسين تتصرف كمادة مسامية مرنة: (i) لا يتم إعادة تشكيل الشبكة ، مما يستنتج أنها تتصرف كمادة مرنة (الشكل 4) ، (ii) تدفق الماء (المذيب) عبر مسام الهلام مدفوع بانقباض الميوسين (الشكل 5) ، و (iii) يتميز استرخاء الإجهاد المرن بثابت انتشار فعال ، D ~ κ / γ ، والذي يعتمد على معامل المرونة الفعال للهلام ، κ ، وثابت الاحتكاك الفعال ، γ ، والذي يمثل الاحتكاك بين المذيب المتحرك ومسام الهلام (الشكل 6). أدناه ، نناقش كل معيار على حدة ونوضح كيفية الوفاء بها في النظام الحالي.

الهدف (ط)

أولا ، يجب تحليل بنية الهلام والمسامية ، ويجب تحديد ما إذا كانت الشبكة تعيد تشكيلها ديناميكيا. يوضح الشكل 4 أ تمثيلا تخطيطيا لشبكة الأكتوميوسين. يبدأ تكوين الشبكة بالتنوي التلقائي وبلمرة خيوط الأكتين ، والتي تتجمع لاحقا (الشكل 4 ب). ثم تنظم الشبكة نفسها بنشاط في شبكة مترابطة متداخلة الخواص من حزم الأكتين ، والتي تخشن ديناميكيا مع مرور الوقت وتتقلص في النهاية. يتم تحفيز التنظيم الذاتي للشبكة والانكماش بواسطة مجاميع الميوسين ، والتي تتمركز في الغالب عند نقاط تقاطع حزم الفتيل (الشكل 4C). تظل مجاميع الميوسين مرتبطة بالشبكة من خلال تقلص الهلام ، والذي يمكن من خلاله استنتاج أن هذه المواد الهلامية actomyosin تتصرف كمواد فعالة مرنة (الشكل 4C). علاوة على ذلك ، في هذه المواد الهلامية actomyosin ، يتم التحكم في الانكماش عن طريق انزلاق الفتيل ، كما تم استنتاجه من خلال مقارنة المسافات من طرف إلى طرف لحزم الفتيل ، l من طرف إلى طرف ، وأطوال الكنتور ، lcont (الشكل 4D ، E). يتناقض هذا مع تقلص حزم الأكتين السائبة المتشابكة بواسطة α-actinin ، والتي يهيمن عليها خيوط الأكتينالملتوية 29.

تتميز مسامية الجل بحجم مسام الهلام التي يتحرك من خلالها تدفق المذيبات. بالنسبة لشبكات الأكتين المنقاة ، يوفر حجم الشبكة ، الذي يحدد المسافة بين الوصلات المتقاطعة في الجل (هنا ، مجاميع الميوسين) ، تقديرا جيدا أيضا لحجم مسام الهلام. يمكن استخراج حجم الشبكة مباشرة من الصور الفلورية (2D) ويتم تقييمه من المتوسط الهندسي للمسافات بين أزواج حزم الأكتين المتعارضة في مسام الهلام (الشكل 4B). نظرا لأن الشبكة متباينة الخواص حتى بداية الانكماش ، فإن متوسط أحجام الشبكات في الاتجاهين الرأسي (أي عبر السماكة) والجانبي (على طول نصف القطر) هو نفسه ، ξ 0 ،Equation 23 = ξ 0 ، ll = ξ0 (= 67 ميكرومتر). نظرا لأن حزم الأكتين تظل مستقيمة أثناء الانكماش ، فإن أحجام الشبكة والمسام تتقلص بما يتناسب مع التغيرات في سمك الهلام وقطره. بالنسبة للنظام التجريبي الحالي ، يبدأ الانكماش داخل المستوى (الشعاعي) بعد انتهاء الانكماش الرأسي عمليا (غير معروض) ، بحيث يستمر الانكماش الشعاعي بسمك هلام ثابت أصغر من السماكة الأولية بعامل ~ 0.3. وبالتالي ، في حين أن حجم الشبكة داخل مستوى الانكماش ، ξ ll (t) = r (t) / R ، يتناقص أثناء الانكماش الشعاعي ، حيث r (t) هو نصف قطر الجل في الوقت t ، فإن متوسط حجم الشبكة في الاتجاه العمودي ثابت ، ξEquation 23 = 20μm23. تستخدم قيم أحجام الشبكة / المسام هذه لتقييم معامل مرونة الهلام ، κ ، ومعامل الاحتكاك ، γ ، كما هو مفصل أدناه (الهدف [iii] ، الشكل 6).

الهدف (ii)

يتضمن هذا الهدف توضيح أن سريان المذيب الخارجي يتولد عن انقباض الميوسين. لتتبع تدفق المذيبات ، تضاف حبات الفلورسنت إلى محلول الأكتوميوسين. يتم تخميل الخرزات لتقليل التفاعل بين الحبيبات المتحركة وشبكة الأكتوميوسين. بشكل عام ، يتم تحضين 1 ميكرولتر من الخرز (جدول المواد) ب 5 ميكرومتر G-actin لمدة 20 دقيقة في درجة حرارة الغرفة ، ويتم إزالة G-actin الزائد عن طريق الطرد المركزي (جدول المواد ، انظر قسم البروتوكول للحصول على التفاصيل). تتكرر هذه الخطوة مع 10 mg·mL-1 BSA (جدول المواد). تضاف الخرزات إلى محلول البروتين عند تخفيف نهائي قدره 1:10,000 فولت / فولت. نظرا لأن الهدف هو السماح للخرزات بالتحرك بحرية عبر مسام الجل ، فمن المهم تكييف أقطار الخرز مع حجم مسام الهلام ، بحيث تكون نسبة حجمها دائما <<1. على هذا النحو ، يتم استخدام حبات قطرها 2300 نانومتر لتحليل المراحل الأولية والمتوسطة من الانكماش (الشكل 5A ، B) عندما يكون متوسط حجم المسام أكبر من 15 ميكرومتر ، ويتم استخدام حبات قطرها 200 نانومتر عندما يكون حجم المسام أصغر (الشكل 5D-G). يتم استخراج موضع مركز كتلة الخرز في كل مرة ، خرزة t ، (x (t) ، y (t)) ، باستخدام خوارزمية تتبع الجسيمات القياسية (جدول المواد) ، والتي يمكن من خلالها استنتاج المسار (الشكل 5B) وسرعة Equation 13الخرزة المحلية ، . تتحرك الخرزات ، وبالتالي المذيب المخترق ، في المتوسط في الاتجاه الشعاعي الخارجي (الشكل 5 أ ، ب) ، بينما ينقبض الهلام إلى الداخل ، كما هو موضح من تحليل قياس سرعة صورة الجسيمات (PIV) (انظر الأسهم الخضراء في الشكل 6 أ). يمكن توضيح هذه الحركة الشعاعية بشكل أكبر عن طريق استخراج السرعة الشعاعية للخرزات المحلية ، νr ، والتي يتم تقييمها عن طريق إسقاط سرعة الخرزة المحلية على الاتجاه الشعاعي المحدد بواسطة متجه الوحدة ، وربط مركز الهلام (x 0 ، Equation 15y0) وموضع مركز كتلة الخرزة في الوقت t: Equation 17 حيثEquation 18

تظهر البيانات أنه مع تحرك الخرز للخارج من مركز الهلام ، تزداد سرعاتها في البداية ، ثم تتباطأ مع اقترابها من حدود الهلام (الشكل 5C). والجدير بالذكر أن سرعة الخرزة يمكن أن تكون أكبر 20 مرة من سرعة الانكماش الشعاعي الهلامي (المنحنى الأزرق في الشكل 5C). تشير الدوائر المملوءة إلى الوقت الذي تغادر فيه الخرزات الجل. تستمر الخرزات في التحرك بعد الخروج من حدود الهلام لبعض الوقت. لا يمكن أن تنتج هذه الحركة عن تأثيرات القصور الذاتي ، لأن رقم رينولد هو <10-4. تتناقص سرعة حبة الخرز الشعاعي مع مرور الوقت المصاحب للانخفاض في تقلص الهلام. والجدير بالذكر أنه عندما تنخفض سرعة الانكماش الشعاعي الهلامي بشكل ملحوظ ، تتقلب سرعة الخرز بشكل كبير.

لاختبار ما إذا كانت هذه التقلبات ناتجة عن البنية المسامية للأكتاميوسين ، تتعقب الشبكة حركة الخرز بدقة مكانية أعلى ، وهو أمر ممكن عندما يتباطأ تقلص الجل بشكل كبير (الشكل 5D-F). مسار الخرز متعرج بالفعل (الشكل 5D ، E) ، مع تقلبات كبيرة في السرعة المحلية للخرز ، مما يعكس البنية المسامية للهلام - أي أن السرعة المحلية هي الأسرع بالقرب من مركز المسام والأبطأ بالقرب من حزمة الأكتين (الشكل 5F).

أخيرا ، يوضح حساب دالة ارتباط سرعة المذيب الهلامية أن تدفق السائل محليا يتم توجيهه عكس الهلام المتعاقد. باستخدام النقاط المضيئة المحلية في الجل كعلامات إيمانية ، يمكن حساب موضع مركز الكتلة لكل نقطة زمنية ، t ، (x (t) ، y (t)) gel ، ويمكن اشتقاق سرعة الهلام المحلية: . Equation 20 بعد ذلك ، لكل حبة ونقطة قريبة في الهلام ، يتم حساب ارتباط زوج سرعة الخرزة المحلية بسرعة الهلام لاستخراج الزاوية ، θ ، بين المتجهين: Equation 22، حيث Equation 23 و Equation 24 هي السرعات المحلية (الحجم) للحبة والهلام ، على التوالي. تظهر البيانات أنه بغض النظر عن موضع الخرزة داخل مسام الجل ، محليا ، يتم توجيه تدفق السائل في الاتجاه المعاكس فيما يتعلق بالهلام (الشكل 5G). بشكل عام ، أظهرت النتائج أن تدفق السوائل الخارجي يتولد عن انقباض الميوسين ، كما هو متوقع للمادة الفعالة المساميةالمرنة 3،7،23،30.

الهدف (ثالثا)

يتضمن هذا الهدف إثبات أن استرخاء الإجهاد يتميز بثابت انتشار مرن فعال ، D ، والذي يعتمد على معامل مرونة الشبكة ، والمسامية ، ولزوجة المذيب. أولا ، يتم تحديد السرعة الجانبية (داخل المستوى) للهلام المتعاقد (الشكل 6 أ). أولا ، يتم تقسيم الصور الفلورية ، ويتم استخراج منطقة الهلام المسقطة في كل نقطة زمنية t ، A (t). بعد ذلك ، يتم حساب نصف قطر الهلام ، Equation 26 (الشكل 6B). من هذا ، يتم اشتقاق سرعة الانكماش الشعاعي عند النقطة الزمنية t ،Equation 27 والتي تصف سرعة حافة الهلام (الشكل 6C). تظهر سرعة الحافة ملف تعريف تطور زمني نموذجي يتميز بمرحلة خطية أولية ، حيث تزداد سرعة الحافة بمعدل ثابت ، حتى يتم الوصول إلى السرعة القصوى ، ν max ، Equation 28في الوقت t max. ثم تضمحل السرعة أضعافا مضاعفة مع وقت استرخاء مميز ، τ ، حتى يتم الوصول إلى حالة مستقرة ميكانيكيا (الشكل 6C). rmaxهو نصف قطر الهلام في بداية مرحلة الاسترخاء هذه. 

بالنسبة للمادة المسامية المرنة ، فإن وقت Equation 33الاسترخاء ، حيث Equation 34 هو ثابت انتشار مرن فعال ، κ هو معامل هلام مرن فعال ، و γ هو ثابت احتكاك فعال يمثل حركة المحلول المائي من خلال مسام هلام الأكتين. يحتوي معامل المرونة على وحدات طاقة لكل وحدة حجم ويتناسب عكسيا مع حجم خلية الوحدة في الهلام ، والتي تحددها المسافة بين الروابط المتقاطعة أو حجم الشبكة ، مثل Equation 35. γ ، يعتمد معامل الاحتكاك على وجه المسام العمودي على تدفق المذيبات. بالنسبة لتقلص الهلام داخل الطائرة ، فإن وجه المسام ذي الصلة هو Equation 36، وبالتالي معامل الاحتكاك Equation 37، حيث η هي لزوجة المذيب31,32. بشكل عام ، نحصل على العلاقة التالية: Equation 39، حيث يتم تقييم حجم Equation 40 المسام ذات الصلة في المستوى عند t كحد أقصى. إجمالا ، نحصل على Equation 41، مما يشير إلى أن وقت الاسترخاء يجب أن يتدرج خطيا بلزوجة المذيب23.

لاختبار ما إذا كانت هذه العلاقة تطاع ، تتكرر التجارب بكميات مختلفة من الجلسرين. استخدام الجلسرين مفيد لأنه لا يتوقع أن يؤثر على نشاط البروتينات ، وخاصة محركات الميوسين. علاوة على ذلك ، تتوفر الارتباطات بين لزوجة محاليل الجلسرين المائي وكمية الجلسرين المضافة في الأدبيات28. تظهر هذه الارتباطات أن الزيادة في نسبة وزن الجلسرين من 0٪ إلى 34٪ تؤدي إلى زيادة نسبية في لزوجة محلول الماء والجلسرين من η ω إلى 2.76 η ω، حيث η ωهي لزوجة الماء عند 20 درجة مئوية. في نطاق الجلسرين هذا ولنفس قطر السقوط الأولي ، 2R = 2,800 μm ، تزيد الزيادة في اللزوجة من مدة بلمرة الشبكة ومراحل التنظيم الذاتي ، على الرغم من أن التسارع الخطي وسرعة الانكماش الشعاعي القصوى (νmax) لم تتغير بشكل كبير. تشير هذه الأدلة إلى أن كلا من إعادة تنظيم الشبكة (المسامية) ونشاط الميوسين لا يتأثران بلزوجة المحلول 23 ، ويجب أن ينعكس تأثير لزوجة المذيب بشكل أساسي في الوقت الذي تستغرقه الضغوطالمرنة للاسترخاء. في الواقع ، يظهر وقت الاسترخاء اعتمادا خطيا على لزوجة المحلول (الشكل 6D) ، مما يشير إلى أن علاقة القياس المشتقة أعلاه يتم طاعتها ، مما يؤكد بشكل أكبر الطبيعة المسامية للنظام.

Figure 1
الشكل 1: وصف تخطيطي للخطوات الرئيسية الثلاث لإجراء معالجة سطح الغطاء الزجاجي . (i) تنظيف سطح الزجاج (معالجة سمكة البيرانا) والتجفيف المائي ، (ii) تكسير السطح ، و (iii) التخميل باستخدام mPEG-mal. يرجى النقر هنا لعرض نسخة أكبر من هذا الرقم.

Figure 2
الشكل 2: تخميل الغطاء الزجاجي. (أ) تجرى عمليات تنظيف سمكة البيرانا وتخفيفها في كأس زجاجية سعة 400 mL باستخدام حامل متعدد تترافلورو إيثيلين منزلي الصنع يتكون من 12 أخدودا خطيا. (ب) يجرى التخميل السطحي في طبق بتري مغلف بالبارافيلم. يتم تحضين كل غطاء ب 1 مل من 5 كيلو دالتون mPEG-mal عند 4mg · mL − 1 في 1x PBS (جدول المواد) لمدة 1 ساعة عند 22 درجة مئوية. تؤكد طبقة البارفيلم الكارهة للماء أن محلول بوليمر PEG المحب للماء يظل محصورا على السطح الزجاجي طوال فترة الحضانة. يرجى النقر هنا لعرض نسخة أكبر من هذا الرقم.

Figure 3
الشكل 3: إجراء تجربة - حامل العينة محلي الصنع. يتم إجراء التجارب في حامل عينة محلي الصنع يناسب أبعاد مرحلة المجهر القياسية. (أ) يتم وضع فاصل بارافيلم مدهون بسمك h (~ 150 ميكرومتر) على غطاء مخمل PEG ، ويتم وضع غطاء الغطاء هذا في حامل العينة. (ب) يحضر محلول الأكتوميوسين على الجليد في أنبوب إيبندورف، ويوضع 1.1 ميكرولتر من هذا المحلول على سند الغطاء؛ ثم (ج) يتم وضع غطاء ثان مخمل بالبيج فوقه ، و (د) حامل العينة مشدود لحصر القطرة ، والتي تعتمد شكلا يشبه القرص. يرجى النقر هنا لعرض نسخة أكبر من هذا الرقم.

Figure 4
الشكل 4: هدف مرونة المسام (i). تتصرف شبكة الأكتوميوسين كمادة مرنة. أ: التمثيل التخطيطي لشبكة أكتوميوسين. ب: تكوين شبكة أكتوميوسين. تظهر صور الفحص المجهري الفلوري أن خيوط الأكتين تنوي تلقائيا وتتبلمر في شبكة مترابطة الخواص تخفف مع مرور الوقت وتتقلص في النهاية مجهريا. تتميز مسامية الشبكة بحجم شبكة الشبكة ، ξ (سهم مزدوج). (جيم - ه) يتم تحفيز تقلص شبكة Actomyosin بواسطة انزلاق حزمة خيوط الأكتين. (ج) يبدأ انقباض الشبكة عند محيط الهلام ("P") وينتشر إلى الداخل في الجزء الأكبر من الهلام. توضح الأسهم البيضاء اتجاه الانكماش. يتم تمييز مركز الهلام بحرف "C". تظهر الصور الفلورية أن مجاميع محرك الميوسين (561 نانومتر ، النقاط الحمراء) مضمنة في شبكة الأكتين (488 نانومتر ، أخضر) وتظل مرتبطة بها طوال انكماش الشبكة. (د) تظل حزم خيوط الأكتين مستقيمة أثناء انقباض الشبكة. نسبة طول الكفاف ، l cont ، والمسافة من طرف إلى طرف ، lمن طرف إلى طرف ، كدالة للوقت. (ه) توزيع النسبة بين طول الكفاف والمسافة من طرف إلى طرف عند t = 316 s (أحمر خالص) و t = 327 s (مخطط ، رمادي). أقحم: طول الكفاف (أزرق) والمسافة من طرف إلى طرف (أبيض) لحزمة نموذجية. الشروط: (B ، C ، E [INSET]): يتم الحصول على الصور على مجهر فلوري مقلوب مزود بكاميرا EMCCD وهدف هوائي 10x / 0.3 Ph1 UPlanFL في الوضع العادي (B) وفي وضع التصوير المزدوج بعد تراكب الصورة (C ، E [أقحم]). قضبان المقياس هي (B ، C) 100 ميكرومتر و (E [أقحم]) 50 ميكرومتر. وقد استنسخ هذا الرقم بإذن من Ideses et al.23. يرجى النقر هنا لعرض نسخة أكبر من هذا الرقم.

Figure 5
الشكل 5: هدف مرونة المسام (ii). يتولد تدفق المذيب الخارجي عن طريق انقباض محرك الميوسين. (أ) تصوير الجل بتكبير منخفض في المراحل المتوسطة من الانكماش: التصوير الفلوري المتزامن لشبكة أكتين متعاقدة (488 نانومتر ، يسار) و 2300 نانومتر حبات فلورية مضافة إلى المحلول (561 نانومتر ، يمين) كدالة للوقت. تشير الدوائر إلى مواضع أربع خرزات. تشير الأسهم إلى الاتجاه العام لحركة الخرزة. (ب) مسارات تسع حبات مختارة. تشير الأسهم إلى الاتجاه الشعاعي العام لحركة الخرز. يشير الصليب المحاط إلى مركز الهلام (x0، y0) (C) سرعة حبة الحبة الشعاعية المحلية νr (الدوائر المفتوحة) وسرعة حافة الهلام (الشعاعية) (النقاط الزرقاء) مقابل الوقت. تشير الدوائر المملوءة إلى الوقت الذي تخرج فيه حبة معينة من حدود الهلام. (مد-واو) حل مسامية الشبكة وحركة المذيب عبر مسام الهلام في مراحل متقدمة من الانكماش. (د) صور التألق للهلام المتقلص وحبيبات الفلورسنت التي قطرها 200 نانومتر المضافة إلى المحلول. كل من الأكتين والخرز متحمسون عند 488 نانومتر. تتبع الدوائر الحمراء موضع حبة مع مرور الوقت. يشير الخط الرمادي إلى حدود الهلام. ه: مسار الخرزة الموضح في (د). في الحقل الموضح، ينكمش الهلام في المتوسط نحو القاع. يتم قياس الإحداثيات بالنسبة لأصل الكاميرا. (F) تعكس السرعة المحلية للحبة التركيب المسامي للهلام. أعلى: سرعة الخرزة المحلية (الدوائر المفتوحة) ، وسرعة الهلام المحلية (الدوائر الرمادية) ، وسرعة حافة الهلام (الدوائر الزرقاء) مقابل الوقت. أسفل: تظهر اللقطات موضع الخرزة لأوقات محددة. تتميز الخرزة بدائرة حمراء. يشير الخط المتقطع إلى الوقت الذي تخرج فيه الخرزة من الهلام. (ز) توزيع الزوايا بين الهلام المحلي وسرعات الخرزة المحلية. الشروط: يتم الحصول على الصور على مجهر فلوري مقلوب مع كاميرا EMCCD و (A) هدف 2.5x / 0.075 Plan-NEOFLUAR و (D ، F) هدف 10x / 0.3 Ph1 UPlanFL. قضبان المقياس هي (أ) 400 ميكرومتر ، (د) 100 ميكرومتر ، (F) و 50 ميكرومتر. وقد استنسخ هذا الرقم بإذن من Ideses et al.23. يرجى النقر هنا لعرض نسخة أكبر من هذا الرقم.

Figure 6
الشكل 6: هدف مرونة المسام (iii). يتميز استرخاء الإجهاد بثابت انتشار مرن فعال للمساورة. (أ) صور مضان للمنظر العلوي لهلام أكتوميوسين متقلص عند تكبير منخفض من وقت الخلط حتى الحالة المستقرة. يتم استخراج حقل السرعة (الأسهم الخضراء) من تحليل PIV. يتم الحصول على الصور على مجهر فلوري مقلوب مع كاميرا EMCCD وهدف 2.5x / 0.075 Plan-NEOFLUAR. الطول الموجي للإثارة هو 488 نانومتر (أكتين). شريط المقياس هو 500 ميكرومتر. (ب) نصف قطر الهلام و (ج) سرعة الانكماش الشعاعي ، Equation 53 (أي سرعة حافة الهلام مقابل الوقت). يشير A إلى التسارع ، ويشير vmax إلى السرعة القصوى ، و τ هو وقت استرخاء مميز. (د) تتصرف شبكات الأكتوميوسين باعتبارها مادة فعالة مرنة مسامي. Equation 55 ولزوجة المذيبات ، η ، مقابل نسبة وزن الجلسرين (بالوزن٪). يتم تطبيع الكميات إلى قيمها عند 0 ٪ بالوزن٪ الجلسرين. نصف القطر الأولي للهلام هو R = 1400 ميكرومتر. أشرطة الخطأ هي الانحرافات المعيارية للقيم التجريبية. وقد استنسخ هذا الرقم بإذن من Ideses et al.23. يرجى النقر هنا لعرض نسخة أكبر من هذا الرقم.

Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.

Discussion

هنا ، يتم استخدام نهج في المختبر لتوصيف ميكانيكا المواد الهلامية actomyosin poroelastic كنظام نموذجي للهيكل الخلوي الخلوي ، وبشكل أعم ، من السيتوبلازم الخلوي ، الذي ثبت أنه يتصرف كمادة مساميةمرنة 3,5. تتميز ريولوجيا الهيكل الخلوي الخلوي (السيتوبلازم) بثابت انتشار مسامي مرن ، والذي يحدد المدة التي يستغرقها السائل الخلوي داخل الخلايا لإعادة التوزيع داخل الخلية بعد الإجهاد الميكانيكي المطبق. تم اقتراح الخلايا لاستخدام هذه الآلية لتنظيم شكلها5.

بدافع من هذه النتائج ، قمنا بتطوير إطار لدراسة مرونة المسام في المختبر. باستخدام نظام النموذج المقترح ، نقدم رؤى حول كيفية مساهمة انقباض الميوسين في ظهور تدفق السوائل وكيف ترتبط سرعة الشبكة واتجاه سرعة المذيب وسرعتها في الزمان والمكان. من خلال هذا ، نوضح أن الشبكة والمذيب المضمن مترابطان ولا يمكن اعتبارهما كائنات منفصلة. نصف الإعداد التجريبي ونقدم بروتوكولا مفصلا لإعداد المواد الهلامية وإجراء التجربة. كما يتم تقديم إطار مفصل للقياس الكمي للبيانات. يمكن تكييف الإطار المقترح بسهولة لدراسة المرونة المسامية في مجموعة متنوعة من الإعدادات والأنظمة التجريبية ، بغض النظر عن خصوصية النظام التجريبي الذي تم التحقيق فيه.

نحن نتحقق من مرونة شبكات actomyosin من خلال تحليل التغيرات في النطاق الزمني لتخفيف الإجهاد. نختار توضيح ذلك عن طريق تغيير لزوجة الوسط عن طريق إضافة كميات مختلفة من الجليسرول إلى محلول الأكتوميوسين. ميزة استخدام الجلسرين هي أنه لا يؤثر على مسامية وهيكل الشبكات ، وبالتالي ، فإن التأثير الوحيد على استرخاء الإجهاد هو زيادة الاحتكاك بين المحلول المتحرك ومسام الهلام23. كان من الممكن أن تؤدي التغييرات في مسامية الشبكة إلى تعقيد إضافي ، حيث يؤثر كل من معامل المرونة وحجم مسام الشبكة على وقت الاسترخاء بطريقة غير خطية23،31،32.

يتطلب إجراء تجارب ناجحة تخميل أغطية الزجاج ببوليمر خامل. هذه الخطوة حاسمة. يمكن استبدال الإجراء المستخدم هنا لتخميل الزجاج بإجراءات أخرى إذا تم الحفاظ على جودة التخميل33,34. يمكن أن يؤدي التخميل السطحي المعيب إلى التصاق هائل بالبروتين ، والذي يمكن أن يمنع تجميع الشبكة. تخميل الزجاج مهم أيضا لمنع تفاعل الجل المتعاقد مع الأسطح الزجاجية. سيؤدي هذا إلى مصطلح احتكاك إضافي ، بالإضافة إلى احتكاك السائل والهلام الذي تم تناوله هنا ، والذي سيكون من الصعب تقديره أو تحديده كميا. بصرف النظر عن التخميل السطحي ، تتطلب التجارب الناجحة استخدام الأكتين الطازج. علاوة على ذلك ، فإن نشاط المحركات أمر بالغ الأهمية أيضا ، ويجب تكرار تحضير دفعات جديدة من الميوسين كل 3-4 أشهر.

بشكل عام ، ثبت أن هذا النهج التجريبي ناجح في دراسة المرونة المسامية في المختبر. يتمثل أحد قيود الإجراء التجريبي المستخدم حاليا في كيفية التحكم في أبعاد الهلام الأولية بقوة أكبر. يتمثل أحد الخيارات في استخدام غرف مسبقة التشكيل ذات أبعاد يمكن التحكم فيها. كما أن استخدام الغرف مسبقة التشكيل لن يسمح للباحث فقط بالتحكم بشكل أفضل في حجم النظام ولكن أيضا بتغيير هندسة النظام بسهولة.

Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.

Disclosures

ليس لدى المؤلفين ما يكشفون عنه.

Acknowledgments

نود أن نشكر دينا أرانوفيتش على تنقية البروتين ووضع العلامات. G.L. ممتن لوزارة العلوم والتكنولوجيا والفضاء الإسرائيلية لمنحة جابوتنسكي للدكتوراه. تعرب A.B.G. عن امتنانها لمؤسسة العلوم الإسرائيلية (منحة 2101/20) ولوزارة العلوم والتكنولوجيا - دولة إسرائيل (منحة 3-17491) للدعم المالي.

Materials

Name Company Catalog Number Comments
(3-Mercaptopropyl)trimethoxysilane Sigma-Aldrich Company 175617 Stored under Argon atmosphere at 4 °C 
Acetic acid Bio-Lab ltd 1070521
Alexa-Fluor 488 Invitrogene A10254 Diluted with DMSO, stored under Argon atmosphere at -20 °C 
Alexa-Fluor 647 Invitrogene A20347 Diluted with DMSO, stored under Argon atmosphere at -20 °C 
BSA Sigma -Aldrich Company A3059 Stored at 4 °C 
Catalase Sigma -Aldrich Company C9322 The stock bottle is kept under dry atmosphere (silica gel) at -20 °C
Coverslips Mezel-glaser CG2222-1.5 Kept in milliQ-water after the Piranha treatment and used within 3 weeks
Creatine kinase Roche Life Science Products 10736988001 Prepared fresh in glycine buffer, kep on ice, and used within 3 days.  The stock bottle is kept under dry atmosphere (silica gel) at 4 °C
Creatine phosphate Roche Life Science Products 10621714001 When dissolved should be kept at -20 °C and used within 3 months. The stock bottle is kept under Argon atmosphere and stored at 4 °C
DTT Roche Life Science Products 10708984001 When dissolved should be kept at -20 °C and used within 3 months
Dual view Simultaneous Imaging System  Photometrics DV2-CUBE
EGTA MP Biomedicals 195174
EM-CCD Camera Andor Technology Ltd DV 887
EM-CCD Camera Photometrics Evolve Delta
Ethanol Bio-Lab ltd 525050300
Flourescence Lamp Rapp Optoelectronic
Fluoresbrite YG Microspheres Polysciences 17151-10 200 nm diameter
Glucose ICN Biomedicals Inc 194024 When dissolved should be kept at -20 °C and used within 3 months.
Glucose oxidase Sigma-Aldrich Company G7141 Kept in -20 °C and used within 3 months. The stock powder is kept under Argon atmosphere and kept at -20 °C
Glycerol ICN Biomedicals Inc 800687
Glycine MP Biomedicals 808822
Hydrogen Peroxide Sigma-Aldrich Company 216763 Stored at 4 °C 
KCl EMD Millipore Corp. 529552
Methanol Bio-Lab ltd 1368052100
MgCl2 EMD Millipore Corp. 442615
Microscope Leica Microsystems DMI3000
mPEG-mal Nanocs PG1-ML-5k  Mw = 5000 Da. Divided to small batches by weight. Stored under Argon atmosphere at -20 °C
Nile red microspheres Spherotech FP-2056-2  2300 nm diameter
Objective (10x) Leica Germany HC PL AP0 UPlanFL Numerical Aperture = 0.3
Objective (2.5x) Leica Germany 506304  Plan-NEOFLUAR Numerical Aperture = 0.075
Oven WTC Binder
Parafilm Amcor PM-996
PBS Buffer Sigma-Aldrich Company P4417
Shutter Driver Vincet Associates VMM D1
Silica gel Merck 1.01907.5000
Sonicator Elma Elmasonic P
Sulfuric acid Carlo Erba reagents 410301
DV2 Dual-Channel Simultaneous-Imaging System Photometrics
TRIS MP Biomedicals 819620
UV-VIS Spectrophotometer Pharmacia Ultraspec 2100 pro
MICROMAN E Gilson FD10001 1–10 uL
MATLAB R2017b MathWorks Data quantification 
MetaMorph  Molecular devices Control software of the optical imaging system; data quantification (particle tracking analysis, network mesh size)

DOWNLOAD MATERIALS LIST

References

  1. Alberts, B., et al. Genesis, Modulation, and Regeneration of Skeletal Muscle In Molecular Biology of the Cell. 4th edition. , Garland Science. New York. (2002).
  2. Howard, J. Mechanics of Motor Proteins and the Cytoskeleton. , Sinauer Associates. Sunderland, MA. (2001).
  3. Mogilner, A., Manhart, A. Intracellular fluid mechanics: Coupling cytoplasmic flow with active cytoskeletal gel. Annual Review of Fluid Mechanics. 50 (1), 347-370 (2018).
  4. Bausch, A. R., Kroy, K. A bottom-up approach to cell mechanics. Nature Physics. 2 (4), 231-238 (2006).
  5. Moeendarbary, E., et al. The cytoplasm of living cells behaves as a poroelastic material. Nature Materials. 12 (3), 253-261 (2013).
  6. Charras, G. T., Mitchison, T. J., Mahadevan, L. Animal cell hydraulics. Journal of Cell Science. 122 (18), 3233-3241 (2009).
  7. Charras, G. T., Yarrow, J. C., Horton, M. A., Mahadevan, L., Mitchison, T. J. Non-equilibration of hydrostatic pressure in blebbing cells. Nature. 435 (7040), 365-369 (2005).
  8. Keren, K., Yam, P. T., Kinkhabwala, A., Mogilner, A., Theriot, J. A. Intracellular fluid flow in rapidly moving cells. Nature Cell Biology. 11 (10), 1219-1224 (2009).
  9. Paluch, E., Piel, M., Prost, J., Bornens, M., Sykes, C. Cortical actomyosin breakage triggers shape oscillations in cells and cell fragments. Biophysical Journal. 89 (1), 724-733 (2005).
  10. Liu, A. P., Fletcher, D. A. Biology under construction: In vitro reconstitution of cellular function. Nature Reviews Molecular Cell Biology. 10 (9), 644-650 (2009).
  11. Siton-Mendelson, O., Bernheim-Groswasser, A. Toward the reconstitution of synthetic cell motility. Cell Adhesion & Migration. 10 (5), 461-474 (2016).
  12. Bernheim-Groswasser, A., Wiesner, S., Golsteyn, R. M., Carlier, M. -F., Sykes, C. The dynamics of actin-based motility depend on surface parameters. Nature. 417 (6886), 308-311 (2002).
  13. Bieling, P., et al. Force feedback controls motor activity and mechanical properties of self-assembling branched actin networks. Cell. 164 (1-2), 115-127 (2016).
  14. Carvalho, K., et al. Actin polymerization or myosin contraction: two ways to build up cortical tension for symmetry breaking. Philosophical Transactions of the Royal Society B: Biological Sciences. 368 (1629), 20130005 (2013).
  15. Dayel, M. J., et al. In silico reconstitution of actin-based symmetry breaking and motility. PLoS Biology. 7 (9), e1000201 (2009).
  16. Manhart, A., et al. Quantitative regulation of the dynamic steady state of actin networks. eLife. 8, 42413 (2019).
  17. Siton, O., et al. Cortactin releases the brakes in actin-based motility by enhancing WASP-VCA detachment from Arp2/3 branches. Current Biology. 21 (24), 2092-2097 (2011).
  18. Pontani, L. -L., et al. Reconstitution of an actin cortex inside a liposome. Biophysical Journal. 96 (1), 192-198 (2009).
  19. Ideses, Y., Sonn-Segev, A., Roichman, Y., Bernheim-Groswasser, A. Myosin II does it all: Assembly, remodeling, and disassembly of actin networks are governed by myosin II activity. Soft Matter. 9 (29), 7127-7137 (2013).
  20. Backouche, F., Haviv, L., Groswasser, D., Bernheim-Groswasser, A. Active gels: Dynamics of patterning and self-organization. Physical Biology. 3 (4), 264 (2006).
  21. Alvarado, J., Sheinman, M., Sharma, A., MacKintosh, F. C., Koenderink, G. H. Molecular motors robustly drive active gels to a critically connected state. Nature Physics. 9 (9), 591-597 (2013).
  22. Linsmeier, I., et al. Disordered actomyosin networks are sufficient to produce cooperative and telescopic contractility. Nature Communications. 7 (1), 12615 (2016).
  23. Ideses, Y., et al. Spontaneous buckling of contractile poroelastic actomyosin sheets. Nature Communications. 9 (1), 2461 (2018).
  24. Spudich, J. A., Watt, S. The regulation of rabbit skeletal muscle contraction: I. Biochemical studies of the interaction of the tropomyosin-troponin complex with actin and the proteolytic fragments of myosin. Journal of Biological Chemistry. 246 (15), 4866-4871 (1971).
  25. Ono, S., et al. Identification of an actin binding region and a protein kinase C phosphorylation site on human fascin. Journal of Biological Chemistry. 272 (4), 2527-2533 (1997).
  26. Margossian, S. S., Lowey, S. Preparation of myosin and its subfragments from rabbit skeletal muscle. In Methods in Enzymology. 85, Academic Press. Cambridge, MA. 55-71 (1982).
  27. Quinlan, M. E., Forkey, J. N., Goldman, Y. E. Orientation of the myosin light chain region by single molecule total internal reflection fluorescence polarization microscopy. Biophysical Journal. 89 (2), 1132-1142 (2005).
  28. Cheng, N. -S. Formula for the viscosity of a glycerol−water mixture. Industrial & Engineering Chemistry Research. 47 (9), 3285-3288 (2008).
  29. Marsh, D., Bartucci, R., Sportelli, L. Lipid membranes with grafted polymers: Physicochemical aspects. Biochimica et Biophysica Acta (BBA) - Biomembranes. 1615 (1-2), 33-59 (2003).
  30. Strychalski, W., Guy, R. D. Intracellular pressure dynamics in blebbing cells. Biophysical Journal. 110 (5), 1168-1179 (2016).
  31. Head, D. A., Levine, A. J., MacKintosh, F. C. Distinct regimes of elastic response and deformation modes of crosslinked cytoskeletal and semiflexible polymer networks. Physical Review E. 68 (6), 061907 (2003).
  32. MacKintosh, F. C., Levine, A. J. Nonequilibrium mechanics and dynamics of motor-activated gels. Physical Review Letters. 100 (1), 018104 (2008).
  33. Melero, C., et al. Light-induced molecular adsorption of proteins using the PRIMO system for micro-patterning to study cell responses to extracellular matrix proteins. Journal of Visualized Experiments. (152), e60092 (2019).
  34. Bendix, P. M., et al. A quantitative analysis of contractility in active cytoskeletal protein networks. Biophysical Journal. 94 (8), 3126-3136 (2008).

Tags

الهندسة الحيوية ، العدد 193 ، الأكتين ، الميوسين ، الشبكات الانقباضية النشطة ، الأكتوميوسين ، المرونة المسامية ، تدفق السوائل ، ارتباط سرعة الهيكل الخلوي - السيتوسول - السرعة
ميكانيكا شبكات الأكتوميوسين المرنة (البورية) الانقباضية كنظام نموذجي للهيكل الخلوي الخلوي
Play Video
PDF DOI DOWNLOAD MATERIALS LIST

Cite this Article

Choudhary, S., Livne, G., Gat, S.,… More

Choudhary, S., Livne, G., Gat, S., Bernheim-Groswasser, A. The Mechanics of (Poro-)Elastic Contractile Actomyosin Networks As a Model System of the Cell Cytoskeleton. J. Vis. Exp. (193), e64377, doi:10.3791/64377 (2023).

Less
Copy Citation Download Citation Reprints and Permissions
View Video

Get cutting-edge science videos from JoVE sent straight to your inbox every month.

Waiting X
Simple Hit Counter