Summary
ここでは、ゼブラフィッシュ(Danio rerio)をモデルとして、ダニの唾液や哺乳類の肉の消費に対するアレルギー反応を評価することにより、α-Gal症候群(AGS)に関連するアレルギー反応と免疫応答を研究しています。
Abstract
ダニは、病原体の伝染によって病気を引き起こす節足動物のベクターであり、その咬傷は世界中の人間の健康に影響を与えるアレルギー反応に関連している可能性があります。一部の個体では、グリカンGalα1-3Galβ1-(3)4GlcNAc-R(α-Gal)に対する高レベルの免疫グロブリンE抗体がダニ刺されによって誘導されています。.ダニの唾液中に存在する糖鎖α-Galを含む糖タンパク質と糖脂質によって媒介されるアナフィラキシー反応は、α-Gal症候群(AGS)または哺乳類の肉アレルギーに関連しています。ゼブラフィッシュ(Danio rerio)は、さまざまな病状の研究に広く使用されている脊椎動物モデルとなっています。この研究では、ゼブラフィッシュは、人間のようにこの糖鎖を合成しないため、α-Galおよび哺乳類の肉の消費に反応するアレルギー反応の研究のモデルとして使用されました。この目的のために、 Ixodes ricinus ダニ唾液および哺乳類肉の消費に応答した行動パターンおよび出血性アナフィラキシー型アレルギー反応を評価した。この実験的アプローチは、AGSを含むダニ媒介性アレルギーの研究のためのゼブラフィッシュ動物モデルを支持する有効なデータの観察を可能にする。
Introduction
ダニは病気を引き起こす病原体の媒介者であり、アレルギー反応の原因でもあり、世界中の人間や動物の健康に影響を与えます1,2。ダニの摂食中、ダニの唾液中の生体分子、特にタンパク質と脂質は、これらの外部寄生虫の摂食を促進し、宿主防御を回避します3。グリカンGalα1-3Galβ1-(3)4GlcNAc-R(α-Gal)修飾を有する一部の唾液生体分子は、ダニ咬傷後に高い抗α-Gal IgE抗体レベルを産生し、一部の個体でのみ、これはα-Gal症候群(AGS)4として知られています。これは、ダニ刺されに対するアナフィラキシー、非霊長類の哺乳類の肉の消費、およびセツキシマブ5などの一部の薬物を引き起こす可能性のあるIgEを介したアレルギーに関連する疾患です。α-Galに対する反応はしばしば重篤であり、時には致命的となる可能性があります6,7,8,9,10,11,12,13,14,15。
α-Galは、旧世界のサル、類人猿、およびα-Gal13を合成する能力を持たない人間を除くすべての哺乳類に見られます。しかし、細菌や原生動物などの病原体は、その表面にこの糖鎖を発現し、大量の抗α-Gal IgM / IgG抗体の産生を誘導する可能性があり、これらの病原体に対する保護メカニズムである可能性があります16,17。しかし、抗α-Gal抗体の産生は、IgEを介した抗α-Galアレルギーを発症するリスクを高めます7,13。主にIgM / IgGサブタイプのヒトで産生された天然の抗α-Gal抗体は、腸内細菌叢の細菌に存在するこの修飾に関連している可能性があります16。現時点での主な診断方法は、特に食物アレルギー(すなわち、そう痒症、限局性じんましん、またはアナフィラキシー、じんましん、および胃腸症状に対する再発性血管浮腫)およびIgE抗α-Gal抗体レベルの測定に関連する遅延性アレルギー反応の病歴に基づいているため、AGSは困難な臨床診断になる可能性があります9。現在の知見は、ダニ咬傷がAGS18,19の出現における主要なリスクの1つを構成することを示唆しており、ダニ咬傷後のIgEレベルのα-Galへの20倍以上の増加19、AGS20,21,22患者のダニ咬傷の病歴、AGS患者におけるダニ抗原に反応する抗体の存在19、 抗α-Gal IgEは抗ダニIgEレベル19,23と強く関連していますが、どの生体分子が実際に関与しているかを評価するにはさらなる研究が必要です。
さらに、別の考えられるシナリオは、ダニ刺されおよび高レベルの抗α-Gal IgE抗体に対して強いアレルギー反応を示すが、哺乳類の肉の消費に耐性がある患者です12。したがって、哺乳類の肉アレルギーは、特定のタイプのダニ咬傷関連アレルギーである可能性があります。AGSに関連する主なダニ種には、Amblyomma americanum(米国)、Amblyomma sculptum(ブラジル)、Amblyomma testudinariumおよびHaemaphysalis longicornis(日本)、Ixodes holocyclus(オーストラリア)、およびIxodes ricinus(ヨーロッパにおけるライムボレリア症の主なベクター)が含まれます11,24。
マダニ刺されに関連するIgE産生を評価するために使用された唯一のモデルは、他の哺乳類と同様に、マウスもタンパク質および脂質上にα-Galを発現し、α-GalにIgEを産生しないため、α−1,3−ガラクトース転移酵素ノックアウト(α−Gal KO)マウス25,26の遺伝子で遺伝子改変されたマウスモデルである。しかし、ゼブラフィッシュ(Danio rerio)は、哺乳類と解剖学的に多くの類似点を共有し、人間と同様にα-Galを合成することができないため、哺乳類に適用される生物医学研究に有用なモデルです。α-Galはゼブラフィッシュで自然に生成されないため、手頃な価格のモデルであり、操作が容易で、α-Gal関連のアレルギー反応の研究に高いサンプルサイズを可能にします。
この研究では、ゼブラフィッシュをモデル生物として使用して、局所アレルギー反応、行動パターン、およびダニ唾液26,27およびその後の哺乳類肉消費に対する経皮感作への反応に関連する分子メカニズムを特徴付け、説明しています。この目的のために、魚は皮内注射によってダニの唾液にさらされ、次にα-Gal27を含む動物の使用に適した哺乳類の肉由来製品を含む犬の飼料を与え、次に関連するアレルギー反応の可能性を評価します。この方法は、アレルギープロセスに関連する他の生体分子、特にAGSに関連する生体分子の研究に適用できます。
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Protocol
ここに記載されているすべての方法は、カスティーリャラマンチャ大学の動物実験に関する倫理委員会によって、「不活化M. ボビス ワクチンに対する免疫応答の評価とゼブラフィッシュモデル番号PR-2017-05-12の M.マリナム への挑戦」の研究の下で承認されています。
ダニは実験室コロニーから得られ、コロニー内のダニの代表的なサンプルは、病原体の不在を確認するために一般的なダニ病原体についてPCRによってテストされ、チェコ共和国のチェコ科学アカデミー生物学センター(IP BC CAS)の寄生虫学研究所で維持されましたすべての動物実験は、チェコ共和国の動物保護法第246/1992 Sb(倫理承認第34/2018号)に従って実施されました。
1.ゼブラフィッシュ治療
注:この試験は、哺乳類の肉の消費に反応してダニの唾液で処理されたゼブラフィッシュのアレルギー反応と免疫反応を評価するように設計されています。
- 魚を(セクション4で説明したように)ダニの唾液、市販のGala1-3Gal-BSA 3(α-Gal)( 材料の表を参照)で処理し、ポジティブコントロールとして使用し、ネガティブコントロールとしてリン酸緩衝生理食塩水(PBS)を使用します。成体のゼブラフィッシュは、性別のバランスのとれた3つのグループにランダムに分布しています(図1)。
注:AGSに関連するその他の望ましい化合物は、このモデルを使用して評価できます。
2. イクソデス・リシナス ・ダニ唾液抽出
- モルモットに6〜7日間給餌された半充血した病原体のない雌ダニを使用する。
- ダニを5μLの塩酸ピロカルピン溶液( 材料の表を参照)でpH 7.4でヘモコエルに処理し、前述のように0.33 mmの針を備えた50 μLシリンジを使用してヘモコエルに入れます28 ダニの唾液産生を誘発します。.
注:ティックは鉗子を使用して処理されます。それらを握るときに力を入れすぎないように注意してください。 - マイクロピペットに取り付けられた10μLのチップを使用して唾液を採取します。
- ダニのハイポストームの内側に先端を慎重に導入します。
- 唾液を氷上の1.5mLチューブに入れてプールし、前述のように-80°Cで保管します27。
- 唾液タンパク質濃度を決定し、製造業者の推奨に従ってBCAタンパク質アッセイキット(材料の表を参照)を使用して、以前の研究27のように魚に注入されるタンパク質の量を確立します。
3.ゼブラフィッシュの維持
- ゼブラフィッシュを27°Cのフロースルー水系で14時間/10時間の明暗サイクルで維持します(図2)。
- 2日目まで、午前9時30分と午後1時30分に1日2回、干魚の餌(50〜70μg/魚)を与えます。
- 午前9時30分と午後1時30分に、治療注射後2日目から実験終了まで、ドライドッグ飼料(50〜70μg/魚)を毎日2回給餌します。
4.ゼブラフィッシュ注射
- 雌/雄の比率が似ており、体重が似ているグループごとに10匹の魚を選択します。
注:グループ1にはPBSを注入した魚が含まれ、グループ2にはダニの唾液を注入した魚が含まれ、グループ3にはα-Galを注入された魚が含まれます。 - 0.02%メタンスルホン酸トリカイン(MS-222)に浸して魚を短時間麻酔します(動画1)。
注:適切に麻酔をかけられた魚は、通常の呼吸を示し、水泳はありませんが、水槽の底に置くか、浮かぶ可能性があります。起こりうる生理学的損傷を避けるために、各魚は個別に麻酔をかけなければなりません。 - 漁網を使用して麻酔をかけた魚を捕獲します。
- 病変を制御するために、鉗子または手を使用して魚を慎重に、湿ったスポンジの上に尾びれを右側に置き、同じ方向に化合物を注入します。
- 以前の研究26と同様に、魚のグループを尾びれまで5 mm、魚の体に対して45°の角度で筋肉に皮内に注射します(動画2)。前述のように、0、3、および8日目に適切な治療を使用します27、1 cm、29 Gの針を取り付けた100 μLの注射器で、10 μLのPBS(ダニの唾液)中の1 μLのリシナス唾液(9 μg/μLのタンパク質を含む)、10 μLのPBS(αダニの唾液)中の5 μgのα-Gal27、 および10 μLのPBSを使用します(図3)。
注意: 動物への物理的な損傷を避けるために、取り扱いは迅速かつ慎重に行う必要があります。
ダニの唾液中の他の生体分子は、このプロトコルに従って評価することができる。 - 処理した魚を回復のために麻酔なしで淡水タンクに戻します。
注:同じグループのすべての魚は、回復のために同じ水槽に入れることができます。
5.ゼブラフィッシュの餌やり
- ドッグフードを乳鉢と乳棒でマッシュアップします。
- 50〜70μg/魚を午前9時30分と午後1時30分に1日2回、2日目まで乾いた魚の餌を与えます。
- 治療注射後2日目から8日目の実験終了まで、午前9時30分と午後1時30分に1日2回、マッシュドッグフィードで50〜70μg/魚を給餌します。
注:さまざまな接種中の治療または飼料に反応したα-GalまたはIgE抗体に対する免疫マーカーまたは抗体価を評価する場合は、実験が終了するまで給餌が必要になります。
6.ゼブラフィッシュのアレルギー反応、病変、行動の評価
- 拡大鏡または実体顕微鏡を使用して出血性タイプのアレルギー反応(皮膚の発赤、変色、出血)を正確に調べ、 表1 に含まれる分類に従って魚に出現する場所を示します(図4A)。
注: 図4 に示すアレルギー反応は、ダニの唾液の注射と赤身の肉を含む飼料の摂取後に現れました。したがって、記載された反応は、同様の反応が臨床状況に現れるので、AGSに関連する反応のタイプである。- 魚が水槽にいる間、治療後および1日2回食物を投与している間に反応が現れないか観察してください。
- 表1に含まれる分類に従って、水泳パターンの変化27(移動性、速度、水槽の底に動かずに立っている、ジグザグに泳ぐ)を評価して、魚の行動を調べます。
- 累積死亡率を評価し、死亡時間/死亡日を含む死んだ魚の数を報告します(図4B)。
注:すべてのパラメータは、処理直後または飼料の変更後に評価され、質的変数を分類する8日目の実験終了まで毎日追跡されます(表1)。推奨事項として、この評価は、ゼブラフィッシュに関する知識を持つ専門家が実施し、ゼブラフィッシュの背景とこの動物モデルを使用した経験に基づいて行動の変化を検討する必要があります。 - 各グループで報告されたアレルギー反応、異常行動、摂食変化を含む1日あたりのゼブラフィッシュの数を計算し、一元配置分散分析によってグループ間を比較します。
7.サンプル収集
- 8日目に0.04%MS-222に浸して魚を安楽死させます。
注:試験中にアレルギー反応で死亡した魚からもサンプルを収集します。 - ピンでパラフィンプレートに魚を固定します。
- 安楽死直後、えらがまだ血液で洗浄されているときに、1cm、29Gの針を取り付けた0.5mLの注射器を使用して、魚のえら血管29 から血清を収集する。使用するまで-20°Cの1.5mLチューブに保存してください(動画3)。
- メスの刃で魚を矢状に切り、内部病変(出血性病変または肉芽腫)が現れた場合は評価します27,30。
注:病変は必ずしも現れるとは限りませんが、現れる場合は登録する必要があります。 - 前述のように、各魚の腸(動画4)と腎臓(動画5)を別々の空の1.5 mLチューブに集め31、-80°Cで保存します(図4C)。
- RNA精製キットを使用して、ゼブラフィッシュの腸および腎臓サンプルからトータルRNAを抽出します(材料の表を参照)。
- ゼブラフィッシュにおける免疫応答に関連する遺伝子の発現を分析し30,32(プライマー配列については表2を参照)し、RT-qPCR用の逆転写ミックス(材料の表を参照)を用いて定量的逆転写ポリメラーゼ連鎖反応(RT-qPCR)を行い、製造元の指示に従って。mRNA cT値をD. rerio GAPDHに対して正規化し、不等分散のスチューデントt検定を使用してグループ間(唾液で処理された魚、α-Gal、およびPBSで処理されたグループ)を比較します。
- 血清サンプル中のゼブラフィッシュ中のα-Galを認識するIgM抗体価を、前述のようにELISAによって決定する27、30。プレートリーダーを使用して抗体価をO.D.450 nm 値として記録し、不等分散のスチューデントt検定を使用してグループ(唾液で処理された魚、α-Gal、およびPBS処理されたグループ)を比較します。
注:IgM抗体価の測定および発現遺伝子解析は任意であり、免疫学的情報が必要な場合にのみ実施されます。RT-qPCRミックスは、リアルタイムqPCRを用いた遺伝子発現解析用の第一鎖cDNA合成キットです。
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Representative Results
ここで提示されたプロトコルは、以前に発表された実験27,30のいくつかの側面と、ゼブラフィッシュモデルが確立され、AGSの研究とα-Galに対する免疫応答のために検証された私たちの研究室で実行された結果に基づいています。このモデルは、ダニの唾液に対する宿主の反応(図4)の結果としてのさまざまなアレルギー反応の特性評価と評価を可能にし、AGSにおけるそれらの意味合いを可能にします。さらに、対照魚では観察されないダニの唾液処理に応答して、ゆっくりと泳ぐ(動画6)、水槽の底に横たわる(動画7)、食べない、振動する、ジグザグの動き(動画8)などの行動の変化が観察されます。これらの所見は、2日目のドッグフードの投与後に特に重要です。この時点で、魚はすでにアルファガルとダニの唾液で感作されており、飼料を介した赤身の肉の投与が始まりました。最後に、ダニの唾液で処理された魚ではアレルギー反応の有意な発生率が観察され(図4A、Bおよび表3)、ダニの唾液にさらされたゼブラフィッシュのみがアレルギー反応を発症し、急速な脱感作と耐性を示しました。一方、以前の研究では、魚の餌を与えられたゼブラフィッシュは目に見える病変や反応を発症しませんでした27。行動の変化は、α-Galのみよりもダニの唾液で処理された魚でより顕著でした(図5)。最も代表的な免疫応答メーカー(IFN、TLR2、IL1 β、およびAKR2)の発現のさらなる分析をRT-PCRによって実施し(表3)、治療に対する異なる免疫応答を研究した。結果は、腎臓のゼブラフィッシュ群間に違いを示し、対照群と比較して、唾液とα-Galで処理された魚で最も免疫応答マーカーがダウンレギュレーションされているように見えましたが(図6)、腸での遺伝子発現に有意差は見られませんでした。ゼブラフィッシュのさまざまなダニ唾液成分に対するアレルギー反応に関する以前の研究では、同様の結果が示されました27。さらに、代表的な結果として、このプロトコルを使用してダニの唾液とα-Galで処理されたゼブラフィッシュは、以前の研究で見られたように、PBSで処理された魚よりも高いレベルを示すα-Galに対するIgM抗体を開発しました(図7)、27,30。
図1:ゼブラフィッシュ試験の実験計画。 魚に陰性対照としてα-Gal、ダニの唾液、およびPBSを皮内注射します。サンプルは、魚が死んだ後または実験の終わりに収集されます。サンプルは、qRT-PCR27による抗α-Gal IgMレベルおよび選択された免疫応答遺伝子マーカーの発現の分析に使用できます。行動の変化またはアレルギー反応は、実験全体を通して記録されます。 この図の拡大版を表示するには、ここをクリックしてください。
図2:ゼブラフィッシュ実験施設。 ゼブラフィッシュは、14時間/10時間の明暗サイクルで27°Cのフロースルー水システムに維持されます。 この 図の拡大版を表示するには、ここをクリックしてください。
図3:ゼブラフィッシュ治療注射。 1cm、29Gの針を装着した100μLのシリンジによるゼブラフィッシュ治療注射は、尾びれから5mmの距離で皮内投与される。魚は麻酔をかけられ、温水に浸したスポンジの上で一つずつ処理されます。 この図の拡大版を表示するには、ここをクリックしてください。
図4:ダニの唾液を注入し、摂食変化前の2日目に死亡したゼブラフィッシュのアナフィラキシー型出血反応の証拠。 (A)処理後に水槽内でアレルギー反応を起こした魚。(B)出血性アナフィラキシー反応(アレルギー反応型:変色、皮膚の発赤。(C)サンプル収集。赤い矢印は腸を示し、赤い円は腎臓を示します。 この図の拡大版を表示するには、ここをクリックしてください。
図5:魚類に観察された行動パターン。 異常な行動パターンは、ゆっくりとした水泳、水槽の底に静止して立つ、ジグザグに泳ぐことで構成されていました。青い矢印は治療時間を示し、赤い矢印は魚の餌から犬の餌に変わる時間を示します。ドッグフードを与えられた魚を唾液処理した対照魚とPBS処理した対照魚とを一元配置分散分析(p = 0.05;N = 5匹の魚/グループ)。 この図の拡大版を表示するには、ここをクリックしてください。
図6:ゼブラフィッシュ腎臓における選択された免疫応答マーカーの発現。実験終了時のゼブラフィッシュの腎臓におけるqRT-PCRによる遺伝子発現解析。mRNA cT値は、D. rerio GAPDHに対して正規化され、平均±SDとして提示され、唾液で処理された魚、α-Gal、およびPBSで処理された対照群の間で、不等分散(*p < 0.05;N = 3-7)。このフィギュアは平成27年から採用され、許可を得て複製しています。この図の拡大版を表示するには、ここをクリックしてください。
図7:IgM抗体価。 ゼブラフィッシュのα-Galに対するIgM抗体価は、ELISAによって決定され、450nmでの平均±SD O.D.として表され、唾液で処理された魚、α-Gal、およびPBSで処理された対照群の間で、不等分散(*p < 0.005;N = 3-7)。このフィギュアは平成27 年から採用され、許可を得て複製しています。 この図の拡大版を表示するには、ここをクリックしてください。
表1:評価された病変と行動パターン。質的変数の分類。定性的に評価されるパラメータは、怪我(ひれと鱗)、水泳、摂食、そして魚の死がテストによるものか取り扱いによるものかです。主観的な考慮事項として、各変数は非常に軽度から重度に分類されます この表をダウンロードするには、ここをクリックしてください。
表2:qRT-PCRのオリゴヌクレオチドプライマーおよびアニーリング温度。この表は30 から採用され、許可を得て複製されています。 この表をダウンロードするには、ここをクリックしてください。
表3:代表的な結果。ゼブラフィッシュのアレルギーと死亡の記録、および選択された免疫応答マーカーの発現は、ゼブラフィッシュの腎臓と腸におけるqRT-PCRによって分析されます。mRNA cT値はD. rerio GAPDHに対して正規化され、唾液で処理された魚、α-Gal、およびPBSで処理された対照群の間で、不等分散(*p < 0.05;N = 3-7)。この表は27,30から採用され、許可を得て複製されています。この表をダウンロードするには、ここをクリックしてください。
動画1:麻酔をかけた魚。麻酔をかけられた魚は動きや泳ぎを見せませんが、呼吸を続けます。 この動画をダウンロードするには、ここをクリックしてください。
動画2:魚への治療の注射。魚は濡れたスポンジの上に麻酔をかけられ、指示された処理で体に45°の角度で注射されます。 この動画をダウンロードするには、ここをクリックしてください。
動画3:鰓血管からの血清採取。魚をピン付きのパラフィンプレートに固定し、血清を1 cm、29 Gの針を取り付けた0.5 mLシリンジを使用してえらから採取します。 この動画をダウンロードするには、ここをクリックしてください。
動画4:安楽死させた魚からの腸の採取。魚はメスの刃を使って矢状に切られ、腸はピンセットで集められます。 この動画をダウンロードするには、ここをクリックしてください。
動画5:安楽死させた魚からの腎臓の収集。水泳用膀胱を取り除き、腎臓を採取します。 この動画をダウンロードするには、ここをクリックしてください。
動画6:処理したゼブラフィッシュで観察された代表的な行動の側面。1匹の魚はゆっくりと泳いでいました。同じグループのすべての魚は同じ水槽に入っています、ビデオはこの行動を説明するための例であり、いくつかの魚は一日の異なる時間にこの行動をしているかもしれません。 この動画をダウンロードするには、ここをクリックしてください。
動画7:処理したゼブラフィッシュで観察された代表的な行動の側面。1匹の魚が水槽の底にとどまりました。同じグループのすべての魚は同じ水槽に入っています、ビデオはこの行動を説明するための例であり、いくつかの魚は一日の異なる時間にこの行動をとるかもしれません。 この動画をダウンロードするには、ここをクリックしてください。
動画8:処理されたゼブラフィッシュで観察された代表的な行動の側面。1匹の魚は振動する水泳を示しました。同じグループのすべての魚は同じ水槽に入っています、ビデオはこの行動を説明するための例であり、いくつかの魚は一日の異なる時間にこの行動をとるかもしれません。 この動画をダウンロードするには、ここをクリックしてください。
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Discussion
ゼブラフィッシュは費用対効果が高く扱いやすいモデルであり、免疫応答、病原体疾患、新薬検査、ワクチン接種および感染に対する防御の分子メカニズムの研究のための非常に実行可能なツールでもあります33,34,35。ゼブラフィッシュの行動に関する研究は、以前の研究では、ストレスがかかっても水槽の底で動かず、食物消費に影響を与え、食べる量が少ないことがわかっているため、有用です。さらに、彼らが動くときのジグザグは、魚のストレスや不安にも関連している可能性があります36,37。ゼブラフィッシュでこれらのパラメータを評価することによって研究から生成された情報は、哺乳類の肉の消費に対するアレルギーを含むAGSの発症につながる可能性のあるα-Galに対する宿主免疫応答に関与するダニと宿主の分子相互作用とメカニズムの基本的な理解を提供します。
注入された分子に対する偽陽性反応を避けるためには、ゼブラフィッシュの体と平行に、それほど深くない皮内注射を行い、注射時に魚が損傷しているかどうかを評価することが重要です。取り扱いや針の貫通に起因する怪我をした魚は、分析に含めるべきではありません。さらに、ゼブラフィッシュの知識を持つ専門家が、このモデルでのバックグラウンドと経験に基づいて行動の変化を検討するために、水泳や摂食などの行動の変化を評価することを強くお勧めします38。もう一つの重要な考慮事項は麻酔です。適切な用量は、収集されたサンプルの最適な状態にとって重要です。さらに、注射治療の間、より顕著なストレス応答が回避され、これはストレス診断29に関連する起こり得る困難を補うことができる。
結果は、ゼブラフィッシュモデルがダニ刺されや他のアレルギー反応の後にAGSを発症するリスクを評価する可能性も前進させることを示しました。さらに、これらのアレルギーの診断、治療、および予防の標的は、この方法および評価されるパラメータがゼブラフィッシュにおけるアレルギー反応のより正確な特徴付けを可能にするので、ヒトに適用することができる。
この方法は、アレルギー反応の原因となり、ダニの唾液中に存在する他の唾液生体分子を評価することを可能にする可能性がある。ダニの唾液中のα-Gal含有量は以前に定量化されています27が、AGSの発症に関与する可能性のある他の化合物は不明です。アレルギー反応は、ダニの唾液とα-Galで治療されたグループで観察されましたが、PBSグループでは観察されませんでした(表3)が、行動はα-Galグループよりもダニの唾液で治療されたグループでより影響を受けます(図5)。このデータから、α-Galと組み合わせた他の生体分子がAGSに関与しているという仮説が立てられるため、唾液中に存在する他のどの分子がこれらの発見に影響を与えるかをさらなる実験で研究する必要があります。さらに、抗α-gal抗体価は、ダニの唾液とα-galで処理されたゼブラフィッシュで有意に高く、以前の研究26,29と同様に、ダニの唾液に存在するα-galに対する免疫応答を示しました(図7)。
最後に、免疫応答マーカーは、PBS処理群と比較した場合、ダニ唾液およびαgalで処理されたゼブラフィッシュ群において下方制御された(表3 および 図6)。これらの結果は、他のAGS関連の生体分子が試験された他の研究27で得られた結果と一致しているが、ダニ刺されおよび赤身肉の消費に反応したα-Gal KOマウスがIgE応答および炎症性Toll様受容体(TLR)およびIL-1シグナル伝達経路のアップレギュレーション発現を示し、その結果Akr2の活性化をもたらした以前の研究25 とは対照的である。したがって、ゼブラフィッシュのダニ唾液および他の生体分子に対するこれらの応答の活性化経路を理解するには、この方法論の適用によって達成できるさらなる研究が必要である。
次いで、この方法論は、単独または組み合わせてアレルギー反応を引き起こし、AGSおよび他のダニ媒介性アレルギーなどのアレルギー性疾患につながる宿主免疫応答に影響を及ぼし得る生体分子のスクリーニングを可能にし得る27。
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Disclosures
著者は開示するものは何もありません。
Acknowledgments
SaBioグループのメンバーが実験計画に協力し、魚類実験施設とゼブラフィッシュを提供してくれたフアンガルセランサエス(IN-CSIC-UMH、スペイン)との技術支援に感謝します。この作業は、スペインおよびEU-FEDERのMCIN/AEI/10.13039/501100011033のMinisterio de Ciencia e Innovación/Agencia Estatal de Investigación MCIN/AEI/10.13039/(Grant BIOGAL PID2020-116761GB-I00)の支援を受けました。マリネラコントレラスは、スペインのイノバシオン大学シエンシア大臣から資金提供を受けており、IJC2020-042710-Iの助成金を受けています。
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| 1.5 mL tube | VWR | 525-0990 | |
| All Prep DNA/RNA | Qiagen | 80284 | |
| Aquatics facilities | |||
| BCA Protein Assay Kit | Thermo Fisher Scientific | 23225 | |
| Disection set | VWR | 631-1279 | |
| Dog Food - Red Classic | Acana | ||
| ELISA plates-96 well | Thermo Fisher Scientific | 10547781 | |
| Gala1-3Gal-BSA 3 (α-Gal) | Dextra | NGP0203 | |
| iScript Reverse Transcription Supermix | Supermix | 1708840 | |
| Microliter syringes | Hamilton | 7638-01 | |
| Plate reader | any | ||
| Phosphate buffered saline | Sigma | P4417-50TAB | |
| pilocarpine hydrochloride | Sigma | P6503 | |
| Pipette tip P10 | VWR | 613-0364 | |
| Pipette tip P1000 | VWR | 613-0359 | |
| Premium food tropical fish | DAPC | ||
| Sponge Animal Holder | Made from scrap foam | ||
| Stereomicroscope | any | ||
| Thermal Cycler Real-Time PCR | any | ||
| Tricaine methanesulphonate (MS-222) | Sigma | E10521 |
References
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