인간화 효모 모델을 이용한 α-시뉴클레인 독성 및 응집을 연구하는 방법
Summary
α-시누클레인의 생체 내 생리학적 모델은 파킨슨병의 발병기전을 연구하고 이해하는 데 필요합니다. 인간화 효모 모델을 사용하여 α-synuclein의 세포 독성 및 응집체 형성을 모니터링하는 방법을 설명합니다.
Abstract
파킨슨 병은 두 번째로 흔한 신경 퇴행성 질환이며 잘못 접히고 응집 된 α- 시누 클레인을 포함하는 Lewy 체의 형성으로 인한 진행성 세포 사멸을 특징으로합니다. α-시누클레인은 시냅스 소포 트래피킹을 조절하는 풍부한 시냅스 전 단백질이지만 단백질성 개재물의 축적은 신경독성을 초래합니다. 최근 연구에 따르면 박테리아 샤페론을 포함한 다양한 유전적 요인이 시험관 내에서 α-시누클레인 응집체의 형성을 감소시킬 수 있음이 밝혀졌습니다. 그러나, 이를 환자에 대한 잠재적인 치료법으로 적용하기 위해 세포에서 항응집 효과를 모니터링하는 것도 중요하다. 신경 세포를 사용하는 것이 이상적이지만 이러한 세포는 다루기가 어렵고 응집 방지 표현형을 나타내는 데 오랜 시간이 걸립니다. 따라서, 생체내 항응집 활성의 추가 평가를 위해 신속하고 효과적인 생체내 도구가 필요하다. 여기에 설명된 방법은 인간 α-시누클레인을 발현하는 인간화 효모 사카로마이세스 세레비시아에에서 항응집 표현형을 모니터링하고 분석하는 데 사용되었습니다. 이 프로토콜은 α-시누클레인 유도 세포 독성과 세포에서 α-시누클레인 응집체 형성을 모니터링하는 데 사용할 수 있는 생체 내 도구를 보여줍니다.
Introduction
파킨슨병(PD)은 전 세계적으로 고령화 사회에 심각한 문제입니다. α-시누클레인의 응집은 PD와 밀접한 관련이 있으며, α-시누클레인의 단백질 응집체는 질병진단을 위한 분자 바이오마커로 널리 사용됩니다1. α- synuclein은 3 개의 도메인, 즉 N 말단 지질 결합 α- 나선, 아밀로이드 결합 중심 도메인 (NAC) 및 C- 말단 산성 꼬리2를 갖는 작은 산성 단백질 (길이 140 아미노산)이다. α-synuclein의 잘못 접힘은 자발적으로 발생할 수 있으며 결국 Lewybody3라고하는 아밀로이드 응집체의 형성으로 이어집니다. α-시누클레인은 여러 면에서 PD의 발병기전에 기여할 수 있다. 일반적으로, 프로토피브릴이라고 하는 그의 비정상적이고 용해성 올리고머 형태는 시냅스 기능3을 포함한 다양한 세포 표적에 영향을 주어 신경 세포 사멸을 유발하는 독성 종으로 생각된다.
신경 퇴행성 질환을 연구하는 데 사용되는 생물학적 모델은 게놈 및 세포 생물학과 관련하여 인간과 관련이 있어야합니다. 가장 좋은 모델은 인간 신경 세포주입니다. 그러나, 이들 세포주는 배양물의 유지의 어려움, 형질감염의 낮은 효율, 및 높은 비용4과 같은 몇몇 기술적 문제와 연관된다. 이러한 이유로이 연구 분야의 진행을 가속화하려면 쉽고 신뢰할 수있는 도구가 필요합니다. 중요한 것은 이 도구가 수집된 데이터를 분석하는 데 사용하기 쉬워야 한다는 것입니다. 이러한 관점에서, 초파리, Caenorhabditis elegans, Danio rerio, 효모 및 설치류5를 포함한 다양한 모델 유기체가 널리 사용되었습니다. 그 중에서도 효모는 유전자 조작이 쉽고 다른 모델 유기체보다 저렴하기 때문에 최고의 모델 유기체입니다. 가장 중요한 것은 효모가 인간 ortholog에 대한 60% 서열 상동성 및 인간 질병 관련 유전자6와 25% 밀접한 상동성과 같이 인간 세포와 높은 유사성을 가지며 근본적인 진핵 세포 생물학도 공유한다는 것입니다. 효모는 인간 세포와 유사한 서열 및 유사한 기능을 가진 많은 단백질을 함유하고 있습니다7. 실제로, 인간 유전자를 발현하는 효모는세포 과정을 해명하기 위한 모델 시스템으로서 널리 사용되어 왔다8. 이 효모 균주는 인간화 효모라고 불리며 인간 유전자의 기능을 탐구하는 데 유용한 도구입니다9. 인간화 효모는 유전자 조작이 효모에서 잘 확립되어 있기 때문에 유전적 상호 작용을 연구하는 데 장점이 있습니다.
이 연구에서는 효모 사카로 마이 세스 세레 비시 애를 PD의 발병 기전을 연구하기위한 모델 유기체로 사용했으며, 특히 α- 시누 클레인 응집체 형성 및 세포 독성을 조사했습니다10. 출아 효모에서 α-시누클레인의 발현을 위해, W303a 균주를 α-시누클레인의 야생형 및 가족성 PD-관련 변이체를 암호화하는 플라스미드로 형질전환에 사용하였다. W303a 균주는 URA3에 영양요구성 돌연변이가 있기 때문에 URA3가 있는 플라스미드를 포함하는 세포의 선택에 적용할 수 있습니다. 플라스미드에서 암호화된 α-시누클레인의 발현은 GAL1 프로모터 하에서 조절된다. 따라서, α-시누클레인의 발현 수준을 조절할 수 있다. 또한, α- 시누 클레인의 C- 말단 영역에서 녹색 형광 단백질 (GFP)의 융합은 α- 시누 클레인 초점 형성의 모니터링을 가능하게한다. α-synuclein의 가족성 PD 관련 변이체의 특성을 이해하기 위해, 우리는 또한 효모에서 이러한 변이체를 발현하고 그들의 세포 효과를 조사하였다. 이 시스템은 α-시누클레인의 세포독성에 대한 보호 역할을 나타내는 화합물 또는 유전자를 스크리닝하기 위한 간단한 도구입니다.
Protocol
Representative Results
Discussion
인간의 다양한 세포 시스템의 복잡성을 감안할 때, 인간 신경 퇴행성 질환을 연구하기위한 모델로서 효모를 사용하는 것이 유리하다. 효모를 사용하여 인간 뇌의 복잡한 세포 상호 작용을 조사하는 것은 거의 불가능하지만, 단일 세포 관점에서 효모 세포는 게놈 서열 상 동성 및 근본적인 진핵 세포 과정 8,13 측면에서 인간 세포와 높은 수준의 유사성을…
Divulgazioni
The authors have nothing to disclose.
Acknowledgements
α-시누클레인을 함유한 플라스미드를 친절하게 공유해 주신 James Bardwell과 Tiago F. Outeiro에게 감사드립니다. 이창한은 한국 정부(MSIT)가 후원하는 한국연구재단(NRF)(보조금 2021R1C1C1C1011690), 교육부가 후원하는 NRF를 통한 기초과학 연구 프로그램(보조금 2021R1A6A1A10044950), 아주대학교 신임 교수 연구비로부터 자금을 지원받았다.
Materials
| 96 well plate | SPL | 30096 | |
| Agarose | TAESHIN | 0158 | |
| Bacto Agar | BD Difco | 214010 | |
| Breathe-easy | diversified biotech | BEM-1 | Gas permeable sealing membrane for microtiter plates |
| cover glasses | Marienfeld | 24 x 60 mm | |
| Culture tube | SPL | 40014 | |
| Cuvette | ratiolab | 2712120 | |
| D-(+)-Galactose | sigma | G0625 | |
| D-(+)-Glucose | sigma | G8270 | |
| D-(+)-Raffinose pentahydrate | Daejung | 6638-4105 | |
| Incubator (shaking) | Labtron | model: SHI1 | |
| Incubator (static) | Vision scientific | model: VS-1203PV-O | |
| LiAc | sigma | L6883 | |
| Microplate reader | Tecan | 30050303 01 | Model: Infinite 200 pro |
| multichannel pipette 20-200 µL | gilson | FA10011 | |
| multichannel pipette 2-20 µL | gilson | FA10009 | |
| Olympus microscope | Olympus | IX-53 | |
| PEG | sigma | P4338 | average mol wt 3,350 |
| Petridish | SPL | 10090 | |
| pRS426 | Christianson, T. W., Sikorski, R. S., Dante, M., Shero, J. H. & Hieter, P. Multifunctional yeast high-copy-number shuttle vectors. Gene. 110 (1), 119-122 (1992). | ||
| pRS426 GAL1 promoter α-synuclein A30P | Outeiro, T. F. & Lindquist, S. Yeast cells provide insight into alpha-synuclein biology and pathobiology. Science. 302 (5651), 1772-1775 (2003) | ||
| pRS426 GAL1 promoter α-synuclein A53T | Outeiro, T. F. & Lindquist, S. Yeast cells provide insight into alpha-synuclein biology and pathobiology. Science. 302 (5651), 1772-1775 (2003) | ||
| pRS426 GAL1 promoter α-synuclein E46K | Outeiro, T. F. & Lindquist, S. Yeast cells provide insight into alpha-synuclein biology and pathobiology. Science. 302 (5651), 1772-1775 (2003) | ||
| pRS426 GAL1 promoter α-synuclein WT | Outeiro, T. F. & Lindquist, S. Yeast cells provide insight into alpha-synuclein biology and pathobiology. Science. 302 (5651), 1772-1775 (2003) | ||
| Reservoir | SPL | 23050 | |
| Spectrophotometer | eppendorf | 6131 05560 | |
| W303a | Present from James Bardwell | ||
| Yeast nitrogen base w/o amino acids | Difco | 291940 | |
| Yeast synthetic drop-out medium supplements without uracil | sigma | Y1501 | |
| YPD | Condalab | 1547.00 |
Riferimenti
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