Eine Methode zur Untersuchung der Toxizität und Aggregation von α-Synuclein unter Verwendung eines humanisierten Hefemodells
Summary
Ein in vivo physiologisches Modell von α-Synuclein ist erforderlich, um die Pathogenese der Parkinson-Krankheit zu untersuchen und zu verstehen. Wir beschreiben eine Methode zur Überwachung der Zytotoxizität und Aggregatbildung von α-Synuclein unter Verwendung eines humanisierten Hefemodells.
Abstract
Die Parkinson-Krankheit ist die zweithäufigste neurodegenerative Erkrankung und ist gekennzeichnet durch einen fortschreitenden Zelltod, der durch die Bildung von Lewy-Körperchen verursacht wird, die fehlgefaltetes und aggregiertes α-Synuclein enthalten. α-Synuclein ist ein reichlich vorhandenes präsynaptisches Protein, das den synaptischen Vesikeltransport reguliert, aber die Anhäufung seiner proteinartigen Einschlüsse führt zu Neurotoxizität. Neuere Studien haben gezeigt, dass verschiedene genetische Faktoren, einschließlich bakterieller Chaperone, die Bildung von α-Synuclein-Aggregaten in vitro reduzieren könnten. Es ist jedoch auch wichtig, den Anti-Aggregationseffekt in der Zelle zu überwachen, um dies als mögliche Behandlung für die Patienten anzuwenden. Es wäre ideal, neuronale Zellen zu verwenden, aber diese Zellen sind schwer zu handhaben und brauchen lange, um den Anti-Aggregations-Phänotyp zu zeigen. Daher ist ein schnelles und effektives In-vivo-Tool für die weitere Bewertung der In-vivo-Antiaggregationsaktivität erforderlich. Die hier beschriebene Methode wurde verwendet, um den Anti-Aggregationsphänotyp in der humanisierten Hefe Saccharomyces cerevisiae zu überwachen und zu analysieren, der humanes α-Synuclein exprimierte. Dieses Protokoll demonstriert In-vivo-Werkzeuge, die zur Überwachung der α-Synuclein-induzierten zellulären Toxizität sowie der Bildung von α-Synuclein-Aggregaten in Zellen verwendet werden könnten.
Introduction
Die Parkinson-Krankheit (PD) ist ein ernstes Problem für alternde Gesellschaften weltweit. Die Aggregation von α-Synuclein ist eng mit Parkinson verbunden, und Proteinaggregate von α-Synuclein werden häufig als molekularer Biomarker für die Diagnose der Krankheit verwendet1. α-Synuclein ist ein kleines saures Protein (140 Aminosäuren lang) mit drei Domänen, nämlich der N-terminalen Lipid-bindenden α-Helix, der Amyloid-bindenden zentralen Domäne (NAC) und dem C-terminalen sauren Schwanz2. Die Fehlfaltung von α-Synuclein kann spontan auftreten und führt schließlich zur Bildung von Amyloid-Aggregaten, die als Lewy-Körper3 bezeichnet werden. α-Synuclein kann auf verschiedene Weise zur Pathogenese der Parkinson-Krankheit beitragen. Im Allgemeinen wird angenommen, dass seine abnormalen, löslichen oligomeren Formen, die Protofibrillen genannt werden, toxische Spezies sind, die den neuronalen Zelltod verursachen, indem sie verschiedene zelluläre Ziele, einschließlich der synaptischen Funktion3, beeinflussen.
Die biologischen Modelle, mit denen neurodegenerative Erkrankungen untersucht werden, müssen für den Menschen in Bezug auf sein Genom und seine Zellbiologie relevant sein. Die besten Modelle wären menschliche neuronale Zelllinien. Diese Zelllinien sind jedoch mit mehreren technischen Problemen verbunden, wie z. B. Schwierigkeiten bei der Aufrechterhaltung von Kulturen, geringer Effizienz der Transfektion und hohen Kosten4. Aus diesen Gründen ist ein einfaches und zuverlässiges Werkzeug erforderlich, um den Fortschritt in diesem Forschungsbereich zu beschleunigen. Wichtig ist, dass das Tool für die Analyse der gesammelten Daten einfach zu bedienen ist. Aus dieser Perspektive wurden verschiedene Modellorganismen weit verbreitet, darunter Drosophila, Caenorhabditis elegans, Danio rerio, Hefe und Nagetiere5. Unter ihnen ist Hefe der beste Modellorganismus, weil genetische Manipulation einfach und billiger ist als die anderen Modellorganismen. Am wichtigsten ist, dass Hefe hohe Ähnlichkeiten mit menschlichen Zellen aufweist, wie z.B. 60% Sequenzhomologie zu menschlichen Orthologen und 25% enge Homologie mit menschlichen krankheitsbezogenen Genen6, und sie teilen auch eine grundlegende eukaryotische Zellbiologie. Hefe enthält viele Proteine mit ähnlichen Sequenzen und ähnlichen Funktionen wie in menschlichen Zellen7. In der Tat wurde Hefe, die menschliche Gene exprimiert, häufig als Modellsystem zur Aufklärung zellulärer Prozesse verwendet8. Dieser Hefestamm wird als humanisierte Hefe bezeichnet und ist ein nützliches Werkzeug, um die Funktion menschlicher Gene zu erforschen9. Humanisierte Hefe hat Vorteile für die Untersuchung genetischer Interaktionen, da die genetische Manipulation in Hefe gut etabliert ist.
In dieser Studie haben wir die Hefe Saccharomyces cerevisiae als Modellorganismus verwendet, um die Pathogenese der Parkinson-Krankheit zu untersuchen, insbesondere um die Bildung von α-Synuclein-Aggregaten und die Zytotoxizität zu untersuchen10. Für die Expression von α-Synuclein in der Knospungshefe wurde der W303a-Stamm zur Transformation mit Plasmiden verwendet, die für die Wildtyp- und familiären PD-assoziierten Varianten von α-Synuclein kodieren. Da der W303a-Stamm eine auxotrophe Mutation auf URA3 aufweist, ist er für die Selektion von Zellen geeignet, die Plasmide mit URA3 enthalten. Die Expression von α-Synuclein, das in einem Plasmid kodiert ist, wird unter dem GAL1-Promotor reguliert. So kann das Expressionsniveau von α-Synuclein gesteuert werden. Darüber hinaus ermöglicht die Fusion von grün fluoreszierendem Protein (GFP) an der C-terminalen Region von α-Synuclein die Überwachung der Bildung von α-Synuclein-Herden. Um die Eigenschaften der familiären PD-assoziierten Varianten von α-Synuclein zu verstehen, haben wir diese Varianten auch in Hefe exprimiert und ihre zellulären Wirkungen untersucht. Dieses System ist ein einfaches Werkzeug für das Screening von Verbindungen oder Genen, die eine schützende Rolle gegen die Zytotoxizität von α-Synuclein spielen.
Protocol
Representative Results
Discussion
Angesichts der Komplexität verschiedener zellulärer Systeme beim Menschen ist es vorteilhaft, Hefe als Modell für die Untersuchung menschlicher neurodegenerativer Erkrankungen zu verwenden. Obwohl es nahezu unmöglich ist, die komplexen zellulären Interaktionen des menschlichen Gehirns mit Hilfe von Hefe zu untersuchen, weisen Hefezellen aus Einzelzellperspektive eine hohe Ähnlichkeit mit menschlichen Zellen in Bezug auf die genomische Sequenzhomologie und grundlegende eukaryotische zelluläre Prozesse auf<sup class…
Divulgazioni
The authors have nothing to disclose.
Acknowledgements
Wir danken James Bardwell und Tiago F. Outeiro für die freundliche Bereitstellung der Plasmide, die α-Synuclein enthalten. Changhan Lee erhielt Fördermittel von der National Research Foundation of Korea (NRF), die von der koreanischen Regierung (MSIT) finanziert wurde (Grant 2021R1C1C1011690), dem Basic Science Research Program durch das NRF, das vom Bildungsministerium finanziert wurde (Grant 2021R1A6A1A10044950) und dem neuen Fakultätsforschungsfonds der Ajou University.
Materials
| 96 well plate | SPL | 30096 | |
| Agarose | TAESHIN | 0158 | |
| Bacto Agar | BD Difco | 214010 | |
| Breathe-easy | diversified biotech | BEM-1 | Gas permeable sealing membrane for microtiter plates |
| cover glasses | Marienfeld | 24 x 60 mm | |
| Culture tube | SPL | 40014 | |
| Cuvette | ratiolab | 2712120 | |
| D-(+)-Galactose | sigma | G0625 | |
| D-(+)-Glucose | sigma | G8270 | |
| D-(+)-Raffinose pentahydrate | Daejung | 6638-4105 | |
| Incubator (shaking) | Labtron | model: SHI1 | |
| Incubator (static) | Vision scientific | model: VS-1203PV-O | |
| LiAc | sigma | L6883 | |
| Microplate reader | Tecan | 30050303 01 | Model: Infinite 200 pro |
| multichannel pipette 20-200 µL | gilson | FA10011 | |
| multichannel pipette 2-20 µL | gilson | FA10009 | |
| Olympus microscope | Olympus | IX-53 | |
| PEG | sigma | P4338 | average mol wt 3,350 |
| Petridish | SPL | 10090 | |
| pRS426 | Christianson, T. W., Sikorski, R. S., Dante, M., Shero, J. H. & Hieter, P. Multifunctional yeast high-copy-number shuttle vectors. Gene. 110 (1), 119-122 (1992). | ||
| pRS426 GAL1 promoter α-synuclein A30P | Outeiro, T. F. & Lindquist, S. Yeast cells provide insight into alpha-synuclein biology and pathobiology. Science. 302 (5651), 1772-1775 (2003) | ||
| pRS426 GAL1 promoter α-synuclein A53T | Outeiro, T. F. & Lindquist, S. Yeast cells provide insight into alpha-synuclein biology and pathobiology. Science. 302 (5651), 1772-1775 (2003) | ||
| pRS426 GAL1 promoter α-synuclein E46K | Outeiro, T. F. & Lindquist, S. Yeast cells provide insight into alpha-synuclein biology and pathobiology. Science. 302 (5651), 1772-1775 (2003) | ||
| pRS426 GAL1 promoter α-synuclein WT | Outeiro, T. F. & Lindquist, S. Yeast cells provide insight into alpha-synuclein biology and pathobiology. Science. 302 (5651), 1772-1775 (2003) | ||
| Reservoir | SPL | 23050 | |
| Spectrophotometer | eppendorf | 6131 05560 | |
| W303a | Present from James Bardwell | ||
| Yeast nitrogen base w/o amino acids | Difco | 291940 | |
| Yeast synthetic drop-out medium supplements without uracil | sigma | Y1501 | |
| YPD | Condalab | 1547.00 |
Riferimenti
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