Méthode pour étudier la toxicité et l’agrégation de la α-synucléine à l’aide d’un modèle de levure humanisée
Summary
Un modèle physiologique in vivo de la α-synucléine est nécessaire pour étudier et comprendre la pathogenèse de la maladie de Parkinson. Nous décrivons une méthode pour surveiller la cytotoxicité et la formation agrégée de α-synucléine à l’aide d’un modèle de levure humanisé.
Abstract
La maladie de Parkinson est la deuxième maladie neurodégénérative la plus fréquente et se caractérise par une mort cellulaire progressive causée par la formation de corps de Lewy contenant de la α-synucléine mal repliée et agrégée. α-synucléine est une protéine présynaptique abondante qui régule le trafic des vésicules synaptiques, mais l’accumulation de ses inclusions protéiques entraîne une neurotoxicité. Des études récentes ont révélé que divers facteurs génétiques, y compris les chaperons bactériens, pourraient réduire la formation d’agrégats de α-synucléine in vitro. Cependant, il est également important de surveiller l’effet anti-agrégation dans la cellule pour l’appliquer comme traitement potentiel pour les patients. Il serait idéal d’utiliser des cellules neuronales, mais ces cellules sont difficiles à manipuler et prennent beaucoup de temps à présenter le phénotype anti-agrégation. Par conséquent, un outil in vivo rapide et efficace est nécessaire pour une évaluation plus approfondie de l’activité anti-agrégation in vivo. La méthode décrite ici a été utilisée pour surveiller et analyser le phénotype anti-agrégation de la levure humanisée Saccharomyces cerevisiae, qui exprimait la α-synucléine humaine. Ce protocole démontre des outils in vivo qui pourraient être utilisés pour surveiller la toxicité cellulaire induite par la α-synucléine, ainsi que la formation d’agrégats de α-synucléine dans les cellules.
Introduction
La maladie de Parkinson (MP) est un problème grave pour les sociétés vieillissantes du monde entier. L’agrégation de la α-synucléine est étroitement associée à la MP, et les agrégats protéiques de α-synucléine sont largement utilisés comme biomarqueur moléculaire pour diagnostiquer la maladie1. α-synucléine est une petite protéine acide (140 acides aminés de longueur) avec trois domaines, à savoir la α-hélice de liaison lipidique N-terminale, le domaine central de liaison amyloïde (NAC) et la queue acide C-terminale2. Le mauvais repliement de la α-synucléine peut se produire spontanément et conduit éventuellement à la formation d’agrégats amyloïdes appelés corps de Lewy3. α-synucléine peut contribuer à la pathogenèse de la MP de plusieurs façons. En général, on pense que ses formes oligomères anormales et solubles appelées protofibrilles sont des espèces toxiques qui provoquent la mort des cellules neuronales en affectant diverses cibles cellulaires, y compris la fonction synaptique3.
Les modèles biologiques utilisés pour étudier les maladies neurodégénératives doivent être pertinents pour les humains en ce qui concerne leur génome et leur biologie cellulaire. Les meilleurs modèles seraient des lignées cellulaires neuronales humaines. Cependant, ces lignées cellulaires sont associées à plusieurs problèmes techniques, tels que des difficultés dans le maintien des cultures, une faible efficacité de la transfection et des dépenses élevées4. Pour ces raisons, un outil simple et fiable est nécessaire pour accélérer les progrès dans ce domaine de recherche. Il est important de noter que l’outil doit être facile à utiliser pour analyser les données collectées. De ce point de vue, divers organismes modèles ont été largement utilisés, notamment la drosophile, Caenorhabditis elegans, Danio rerio, la levure et les rongeurs5. Parmi eux, la levure est le meilleur organisme modèle car la manipulation génétique est facile et moins chère que les autres organismes modèles. Plus important encore, la levure présente de grandes similitudes avec les cellules humaines, telles que 60% d’homologie de séquence avec les orthologues humains et 25% d’homologie étroite avec les gènes liés à la maladie humaine6, et elles partagent également la biologie fondamentale des cellules eucaryotes. La levure contient de nombreuses protéines avec des séquences similaires et des fonctions analogues à celles des cellules humaines7. En effet, la levure exprimant des gènes humains a été largement utilisée comme système modèle pour élucider les processus cellulaires8. Cette souche de levure est appelée levure humanisée et est un outil utile pour explorer la fonction des gènes humains9. La levure humanisée a le mérite d’étudier les interactions génétiques parce que la manipulation génétique est bien établie dans la levure.
Dans cette étude, nous avons utilisé la levure Saccharomyces cerevisiae comme organisme modèle pour étudier la pathogenèse de la MP, en particulier pour étudier la formation d’agrégats de α-synucléine et la cytotoxicité10. Pour l’expression de la α-synucléine dans la levure bourgeonnante, la souche W303a a été utilisée pour la transformation avec des plasmides codant pour les variantes de type sauvage et familiales associées à la de la α-synucléine. Comme la souche W303a a une mutation auxotrophe sur URA3, elle est applicable pour la sélection de cellules contenant des plasmides avec URA3. L’expression de la α-synucléine codée dans un plasmide est régulée par le promoteur GAL1. Ainsi, le niveau d’expression de la α-synucléine peut être contrôlé. De plus, la fusion de la protéine fluorescente verte (GFP) dans la région C-terminale de la α-synucléine permet de surveiller la formation de foyers de α-synucléine. Pour comprendre les caractéristiques des variantes familiales associées à la MP de la α-synucléine, nous avons également exprimé ces variantes chez la levure et examiné leurs effets cellulaires. Ce système est un outil simple pour le criblage de composés ou de gènes présentant des rôles protecteurs contre la cytotoxicité de la α-synucléine.
Protocol
Representative Results
Discussion
Compte tenu de la complexité des différents systèmes cellulaires chez l’homme, il est avantageux d’utiliser la levure comme modèle pour étudier les maladies neurodégénératives humaines. Bien qu’il soit presque impossible d’étudier les interactions cellulaires complexes du cerveau humain à l’aide de levure, d’un point de vue unicellulaire, les cellules de levure présentent un niveau élevé de similitude avec les cellules humaines en termes d’homologie de séquence génomique et de processus cellu…
Divulgazioni
The authors have nothing to disclose.
Acknowledgements
Nous remercions James Bardwell et Tiago F. Outeiro d’avoir bien voulu partager les plasmides contenant de la α-synucléine. Changhan Lee a reçu un financement de la Fondation nationale de recherche de Corée (NRF) financé par le gouvernement coréen (MSIT) (subvention 2021R1C1C1011690), du Programme de recherche scientifique fondamentale par le biais de la NRF financé par le ministère de l’Éducation (subvention 2021R1A6A1A10044950) et du nouveau fonds de recherche du corps professoral de l’Université Ajou.
Materials
| 96 well plate | SPL | 30096 | |
| Agarose | TAESHIN | 0158 | |
| Bacto Agar | BD Difco | 214010 | |
| Breathe-easy | diversified biotech | BEM-1 | Gas permeable sealing membrane for microtiter plates |
| cover glasses | Marienfeld | 24 x 60 mm | |
| Culture tube | SPL | 40014 | |
| Cuvette | ratiolab | 2712120 | |
| D-(+)-Galactose | sigma | G0625 | |
| D-(+)-Glucose | sigma | G8270 | |
| D-(+)-Raffinose pentahydrate | Daejung | 6638-4105 | |
| Incubator (shaking) | Labtron | model: SHI1 | |
| Incubator (static) | Vision scientific | model: VS-1203PV-O | |
| LiAc | sigma | L6883 | |
| Microplate reader | Tecan | 30050303 01 | Model: Infinite 200 pro |
| multichannel pipette 20-200 µL | gilson | FA10011 | |
| multichannel pipette 2-20 µL | gilson | FA10009 | |
| Olympus microscope | Olympus | IX-53 | |
| PEG | sigma | P4338 | average mol wt 3,350 |
| Petridish | SPL | 10090 | |
| pRS426 | Christianson, T. W., Sikorski, R. S., Dante, M., Shero, J. H. & Hieter, P. Multifunctional yeast high-copy-number shuttle vectors. Gene. 110 (1), 119-122 (1992). | ||
| pRS426 GAL1 promoter α-synuclein A30P | Outeiro, T. F. & Lindquist, S. Yeast cells provide insight into alpha-synuclein biology and pathobiology. Science. 302 (5651), 1772-1775 (2003) | ||
| pRS426 GAL1 promoter α-synuclein A53T | Outeiro, T. F. & Lindquist, S. Yeast cells provide insight into alpha-synuclein biology and pathobiology. Science. 302 (5651), 1772-1775 (2003) | ||
| pRS426 GAL1 promoter α-synuclein E46K | Outeiro, T. F. & Lindquist, S. Yeast cells provide insight into alpha-synuclein biology and pathobiology. Science. 302 (5651), 1772-1775 (2003) | ||
| pRS426 GAL1 promoter α-synuclein WT | Outeiro, T. F. & Lindquist, S. Yeast cells provide insight into alpha-synuclein biology and pathobiology. Science. 302 (5651), 1772-1775 (2003) | ||
| Reservoir | SPL | 23050 | |
| Spectrophotometer | eppendorf | 6131 05560 | |
| W303a | Present from James Bardwell | ||
| Yeast nitrogen base w/o amino acids | Difco | 291940 | |
| Yeast synthetic drop-out medium supplements without uracil | sigma | Y1501 | |
| YPD | Condalab | 1547.00 |
Riferimenti
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