Un protocollo basato su piastre di microtitolazione a 96 pozzetti che utilizza un saggio di riduzione di 2,3-bis(2-metossi-4-nitro-5-sulfofenil)-5-carbossilide-2H-tetrazolio (XTT) è descritto nel presente documento, per studiare gli effetti degli anticorpi sui biofilm formati da C. tropicalis. Questo protocollo in vitro può essere utilizzato per verificare l'effetto di potenziali nuovi composti antifungini sull'attività metabolica delle cellule della specie Candida nei biofilm.
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Articolo metodologico
Un saggio di riduzione solubile a base di tetrazolio per valutare l'effetto degli anticorpi sui biofilm di Candida tropicalis
* These authors contributed equally
In questo articolo
Sommario
Abstract
Le specie di Candida sono la quarta causa più comune di infezioni nosocomiali sistemiche. La candidosi sistemica o invasiva comporta frequentemente la formazione di biofilm su dispositivi impiantati o cateteri, che è associata ad un aumento della virulenza e della mortalità. I biofilm prodotti da diverse specie di Candida mostrano una maggiore resistenza contro vari farmaci antifungini. Pertanto, vi è la necessità di sviluppare immunoterapie efficaci o trattamenti aggiuntivi contro i biofilm di Candida . Mentre il ruolo dell'immunità cellulare è ben stabilito nella protezione anti-Candida , il ruolo dell'immunità umorale è stato studiato meno.
È stato ipotizzato che l'inibizione della formazione e della maturazione del biofilm sia una delle principali funzioni degli anticorpi protettivi, e gli anticorpi del tubo germinale di Candida albicans (CAGTA) hanno dimostrato di sopprimere la crescita in vitro e la formazione di biofilm di C. albicans in precedenza. Questo articolo delinea un protocollo dettagliato per valutare il ruolo degli anticorpi sui biofilm formati da C. tropicalis. La metodologia per questo protocollo prevede la formazione di biofilm di C. tropicalis in piastre di microtitolazione a 96 pozzetti, che sono state poi incubate in presenza o assenza di anticorpi antigene-specifici, seguite da un saggio 2,3-bis(2-metossi-4-nitro-5-sulfofenil)-5-carbossilide-2H-tetrazolio (XTT) per misurare l'attività metabolica delle cellule fungine nel biofilm.
La specificità è stata confermata utilizzando appropriati controlli sierici, incluso il siero impoverito di anticorpi Sap2. I risultati dimostrano che gli anticorpi presenti nel siero di animali immunizzati possono inibire la maturazione del biofilm di Candida in vitro. In sintesi, questo articolo fornisce importanti approfondimenti sul potenziale degli anticorpi nello sviluppo di nuove immunoterapie e trattamenti sinergici o aggiuntivi contro i biofilm durante la candidosi invasiva. Questo protocollo in vitro può essere utilizzato per verificare l'effetto di potenziali nuovi composti antifungini sull'attività metabolica delle cellule della specie Candida nei biofilm.
Introduzione
La candidosi sistemica è la quarta causa principale di infezioni nosocomiali, che sono associate ad alti tassi di morbilità e mortalità in tutto il mondo. A livello globale, la candidosi sistemica colpisce circa 700.000 individui1. Le specie di Candida, vale a dire C. albicans, C. tropicalis, C. parapsilosis, C. glabrata e C. auris, sono la causa più comune di infezioni invasive da Candida 2. Le specie di Candida sono patogeni opportunisti che producono biofilm3. I biofilm sono prevalentemente associati alla virulenza dell....
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Protocollo
I topi BALB/c sono stati ospitati nella Small Animal Facility di IIT Roorkee. Tutti gli animali sono stati mantenuti in un ciclo luce:buio di 12 h:12 h a 25 °C e sono stati sottoposti a una dieta a pellet e acqua ad libitum. Tutte le procedure animali sono state approvate dall'Institutional Animal Ethics Committee (IAEC) di IIT Roorkee.
1. Preparazione di C. tropicalis
NOTA: Il fungo Candida tropicalis appartiene ai patogeni del gruppo di rischio 2 ed è classificato come microrganismo BSL2. Utilizzare sempre armadi di sicurezza biologica di classe II certificati quando si....
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Risultati
I biofilm di Candida tropicalis sono stati coltivati in piastre di microtitolazione a 96 pozzetti e sono stati ripresi a 40x utilizzando un microscopio invertito (Figura 1A). Il biofilm è stato ulteriormente colorato usando viola cristallino e osservato a 40x usando un microscopio invertito (Figura 1B). La microscopia elettronica a scansione mostra un'immagine rappresentativa del biofilm di C. tropicalis (Figura 1C.......
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Discussione
Le infezioni fungine causate dalle specie di Candida sono associate ad alti tassi di morbilità e mortalità in tutto il mondo. La crescente minaccia di infezione fungina invasiva richiede la gestione precoce di tali malattie potenzialmente letali. La maggior parte delle infezioni da Candida comporta la formazione di biofilm, che aderiscono a una varietà di dispositivi medici e sono responsabili della persistenza e della recidiva delle infezioni fungine in ambito ospedaliero31. I b.......
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Dichiarazioni
Gli autori non dichiarano conflitti di interesse.
Ringraziamenti
Questo lavoro è stato sostenuto dal Ramalingaswami grant DBT-843-BIO (Department of Biotechnology, Government of India) e Early Career Research Award SER-1058-BIO (Science and Engineering Research Board, Government of India) a S.R. Gli autori riconoscono una sovvenzione ICMR-JRF a P.C e una sovvenzione DBT-JRF a P.S. Gli autori ringraziano il Dr. Ravikant Ranjan per i suggerimenti sul manoscritto e l'assistenza tecnica del Sig. Pradeep Singh Thakur durante il SEM.
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Materiali
| Nome | Azienda | Numero di catalogo | Commenti |
|---|---|---|---|
| Provette da centrifuga coniche da 15 mL | BD Falcon | 546021 | |
| 1x PBS | Preparato in laboratorio | NaCl : 4 g KCl : 0,1 g Na2HPO4: 0,72 g KH2PO4 : 0,12 g Acqua 500 mL. Regolazione del pH a 7,4 | |
| Provette per centrifuga coniche da 50 mL | BD Falcon | 546041 | |
| piastre per microtitolazione a 96 pozzetti | Incubatore Nunc | 442404 | |
| Generico | |||
| Menadione | Sigma | M5625 | |
| Lettore di piastre per microtitolazione | Generico | ||
| Pipetta multicanale e puntali | Generico | ||
| Piastre di Petri | Tarson | 460090 | |
| Ringers Lattato | Preparato in laboratorio Cloruro | di sodio 0,6 g Lattato di sodio 0,312 g Cloruro di potassio 0,035 g Cloruro di calcio 0,027 g Acqua 100 mL. Regolare a pH 7,0 | |
| RPMI 1640 MOPS | Himedia | AT180 | |
| Sabouraud destrosio Agar | SRL | 24613 | |
| Sabouraud destrosio Brodo | SRL | 24835 | |
| XTT | Invitrogen | X6493 |
Riferimenti
- Bongomin, F., Gago, S., Oladele, R. O., Denning, D. W. Global and multi-national prevalence of fungal diseases-estimate precision. Journal of Fungi. 3 (4), 57(2017).
- Pappas, P., Lionakis, M., Arendrup, M., Ostrosky-Zeichner, L., Kullberg, B. J. Invasive candidiasis. Nature Reviews Disease Pri....
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Ristampe e permessi
