Domateste Tohum Geliştirme Çalışması için Verimli Bir Takas Protokolü (Solanum lycopersicum L.)

Summary

Domates tohumu, bitki üremesi sırasında genetik ve gelişim biyolojisini incelemek için önemli bir modeldir. Bu protokol, daha ince embriyonik yapıyı gözlemlemek için farklı gelişim aşamalarında domates tohumlarının temizlenmesi için yararlıdır.

Abstract

Domates (Solanum lycopersicum L.) dünya çapında en büyük nakit mahsullerinden biridir. Domates tohumu, bitki üremesi sırasında genetik ve gelişim biyolojisini incelemek için önemli bir modeldir. Bir domates tohumu içindeki daha ince embriyonik yapının görselleştirilmesi genellikle tohum kabuğu müsilajı, çok hücreli katmanlı bütünlük ve zahmetli gömme bölümleme ile çözülmesi gereken kalın duvarlı bir endosperm tarafından engellenir. Daha basit bir alternatif, kimyasal maddeler kullanarak tohumu neredeyse şeffaf hale getiren doku temizleme teknikleri kullanmaktır. Geleneksel temizleme prosedürleri, daha ince bir tohum kabuğuna sahip daha küçük tohumlara derinlemesine bilgi vermesine rağmen, domates tohumlarının temizlenmesi, özellikle geç gelişim aşamalarında, teknik olarak zor olmaya devam etmektedir.

Burada, embriyonik morfolojinin neredeyse tamamlandığı çiçeklenmeden 3 ila 23 gün sonra domates tohumu gelişimini gözlemlemek için hızlı ve emek tasarrufu sağlayan bir temizleme protokolü sunulmaktadır. Bu yöntem, Arabidopsis’te yaygın olarak kullanılan kloral hidrat bazlı temizleme çözeltisini, Formalin-Aseto-Alkol (FAA) fiksasyonunun ihmal edilmesi, tohumların sodyum hipoklorit muamelesinin eklenmesi, yumuşatılmış tohum kabuğu müsilajının çıkarılması ve yıkama ve vakum işlemi dahil olmak üzere diğer modifikasyonlarla birleştirir. Bu yöntem, domates tohumlarının farklı gelişim aşamalarında verimli bir şekilde temizlenmesi için uygulanabilir ve mutant tohumların gelişim sürecinin iyi mekansal çözünürlükle tam olarak izlenmesinde yararlıdır. Bu temizleme protokolü, Solanaceae’deki ticari olarak önemli diğer türlerin derin görüntülenmesine de uygulanabilir.

Introduction

Domates (S. lycopersicum L.), 2020 yılında 5,1 milyon hektardan 186,8 milyon ton etli meyve üretimi ile dünyadaki en önemli sebze mahsullerinden biridir¹. Patlıcan, biber, patates ve tütün gibi ticari açıdan önemli birçok ürün de dahil olmak üzere yaklaşık 2.716 tür² ile büyük Solanaceae familyasına aittir. Ekili domates, genom boyutu yaklaşık 900 Mb³ olan bir diploid türüdür (2n = 2x = 24). Uzun süredir, yabani Solanum spp’den arzu edilen özellikleri seçerek domates evcilleştirme ve ıslahına yönelik büyük çaba sarf edilmiştir. Domates Genetiği Kaynak Merkezi’nde listelenen 5.000’den fazla domates katılımı vardır ve dünya çapında 80.000’den fazla germplazma domates depolanmaktadır⁴. Domates bitkisi serada çok yıllıktır ve tohumlarla yayılır. Olgun bir domates tohumu üç ana bölmeden oluşur: tam yetişkin bir embriyo, artık hücresel tip endosperm ve sert bir tohum kabuğu ^5,6 (Şekil 1A). Çift döllenmeden sonra, hücresel tip endosperm gelişimi, zigotların gelişiminden önce gelir. Çiçeklenmeden (DAF) ~ 5-6 gün sonra, endosperm altı ila sekiz çekirdek^7’den oluştuğunda iki hücreli proembriyo ilk önce gözlenir. Solanum pimpinellifolium’da, embriyo 20 DAF’tan sonra son boyutuna yaklaşır ve tohumlar 32 DAF^8’den sonra çimlenme için uygundur. Embriyo geliştikçe, endosperm yavaş yavaş emilir ve tohumda sadece az miktarda endosperm kalır. Kalıntı endosperm, radikül ucunu çevreleyen mikropylar endosperm ve tohumun geri kalanında lateral endosperm ^9,10’dan oluşur. Dış tohum kabuğu, bütünlüğün kalınlaşmış ve odunlaşmış dış epidermisinden gelişir ve bütünleşme kalıntılarının ölü katmanlarıyla, embriyoyu ve endospermi korumak için sert bir kabuk oluştururlar⁵.

Resim 1: Solanum lycopersicum ve Arabidopsis thaliana’da olgun bir tohumun şematik gösterimi . (A) Olgun bir domates tohumunun uzunlamasına anatomisi. (B) Olgun bir Arabidopsis tohumunun uzunlamasına anatomisi. Olgun bir domates tohumu, bir Arabidopsis tohumundan yaklaşık 70 kat daha büyüktür. Ölçek çubukları = (A) 400 μm, (B) 100 μm. Bu şeklin daha büyük bir versiyonunu görüntülemek için lütfen buraya tıklayın.

Yüksek kaliteli domates tohumlarının üretimi, embriyo, endosperm ve maternal tohum bileşenleri arasındaki koordinasyona bağlıdır¹¹. Tohum gelişimindeki anahtar genlerin ve ağların diseksiyonu, mutant tohumların derin ve tam hatlı bir fenotipik kaydını gerektirir. Yarı ince kesit ve parafin kesit gibi geleneksel gömme-kesit teknikleri, embriyonun yerel ve daha ince yapılarını gözlemlemek için domates tohumlarına yaygın olarak uygulanır^12,13,14,15. Bununla birlikte, tohum gelişimini ince kesitlerden analiz etmek genellikle zahmetlidir ve z ekseni uzamsal çözünürlüğünden yoksundur. Buna karşılık, doku temizleme, ortaya çıkması en muhtemel embriyo defektlerinin gelişim aşamasını belirlemek için hızlı ve etkili bir yöntemdir¹⁶. Temizleme yöntemi, kırılma indisini bir veya daha fazla biyokimyasal ajanla homojenleştirerek iç dokunun opaklığını azaltır¹⁶. Tüm doku temizleme, bir bitki doku yapısının bütünlüğünü bozmadan gözlemlenmesine izin verir ve temizleme teknolojisi ile üç boyutlu görüntülemenin kombinasyonu, bir bitki organının morfolojisi ve gelişimsel durumu hakkında bilgi edinmek için ideal bir çözüm haline gelmiştir^17,18. Yıllar geçtikçe, Arabidopsis thaliana, Hordeum vulgare ve Beta vulgaris^{19,20,21,22,23} dahil olmak üzere çeşitli bitki türlerinde tohum temizleme teknikleri kullanılmıştır. Bunlar arasında, bütün monte edilmiş ovül temizleme teknolojisi, küçük boyutu, tohum kabuğu hücresinin 4-5 katmanı ve nükleer tip endosperm^24,25 nedeniyle Arabidopsis’in tohum gelişimini incelemek için etkili bir yaklaşım olmuştur. Hoyer çözeltisi^26’nın ortaya çıkması gibi farklı temizleme karışımlarının sürekli güncellenmesiyle, arpa ovülünün iç yapıları, endospermi tohumların büyük kısmını oluşturmasına rağmen, yüksek derecede netlikle görüntülenmiştir. Şeker pancarının embriyogenezi, vakum işlemi ile birlikte temizlenerek ve hidroklorik asit¹⁹ ile yumuşatılarak gözlemlenebilir. Bununla birlikte, yukarıda belirtilen türlerin aksine, domates tohumlarındaki protokollerin temizlenmesiyle embriyolojik gözlemler bildirilmemiştir. Bu, domateslerin embriyonik ve tohum gelişiminin ayrıntılı bir şekilde araştırılmasını önler.

Kloral hidrat, daldırılmış dokuların ve hücrelerin farklı optik düzlemlerde görüntülenmesini sağlayan ve hücreleri veya doku bileşenlerini büyük ölçüde koruyan bir temizleme çözeltisi olarak yaygın olarak kullanılır^27,28,29. Kloral hidrat bazlı temizleme protokolü, Arabidopsis^21,28’in embriyosunu ve endospermini gözlemlemek için tohumların tamamen temizlenmesi için başarıyla kullanılmıştır. Bununla birlikte, bu temizleme çözeltisi, Arabidopsis tohumlarından daha geçirimsiz olan domates tohumlarının temizlenmesinde etkili değildir. Fiziksel engeller şunları içerir: (1) domates bütünlüğünün 3 ila 15 DAF 30,31’de yaklaşık 20 hücre katmanı vardır, (2) domates endospermi nükleer tip 32 değil, hücresel tiptedir ve (3) domates tohumları ^33,34 boyutunda yaklaşık⁷⁰ kat daha büyüktür ve (4) temizleme reaktiflerinin penetrasyonunu engelleyen ve embriyo hücrelerinin görselleştirilmesini etkileyen büyük miktarlarda tohum kabuğu müsilajı üretir.

Bu nedenle, bu rapor, domates tohumlarının farklı aşamalarda tamamen monte edilmesi için optimize edilmiş bir kloral hidrat bazlı temizleme yöntemi sunar ve bu da embriyo gelişim sürecinin derin görüntülenmesini sağlar (Şekil 2).

Protocol

1. Çözeltilerin hazırlanması 50 mL’lik bir santrifüj tüpüne 2,5 mL% 37 formaldehit, 2,5 mL buzul asetik asit ve 45 mL% 70 etanol ekleyerek FAA fiksatif hazırlayın. Vorteks yapın ve 4 °C’de saklayın. Kullanmadan hemen önce FAA fiksatif hazırlayın.DİKKAT: formaldehit aşındırıcıdır ve maruz kalırsa veya solunduğunda potansiyel olarak kanserojendir. Fiksatif, uygun kişisel koruyucu ekipman giyerken bir duman başlığında yapılmalıdır. Kalay folyo ile…

Representative Results

Domates tohumları Arabidopsis’te olduğu gibi geleneksel bir yöntem kullanılarak temizlendiğinde, yoğun endosperm hücreleri erken domates embriyolarının 3 DAF ve 6 DAF’ta görselleştirilmesini engelledi (Şekil 3A, B). Embriyonun toplam hacmi arttıkça, küresel bir embriyo 9 DAF’ta zar zor ayırt edilebildi (Şekil 3C). Bununla birlikte, tohum büyüklüğü artmaya devam ettikçe, geçirgenliği azaldı ve 12 DAF’ta bulanık…

Discussion

Mekanik kesitleme ile karşılaştırıldığında, temizleme teknolojisi, bitki dokularının veya organlarının bütünlüğünü koruduğu için üç boyutlu görüntüleme için daha avantajlıdır¹⁶. Geleneksel temizleme protokolleri, kimyasal çözeltilerin daha kolay nüfuz etmesi nedeniyle genellikle küçük numunelerle sınırlıdır. Domates tohumu, doku temizliği için sorunlu bir örnektir, çünkü boyut olarak bir Arabidopsis tohumundan yaklaşık 70 kat daha büyüktür …

Materials

1,000 µL pipette	GILSON	FA10006M
1,000 µL pipette tips	Corning	T-1000-B
2 ml centrifuge tube	Axygen	MCT-200-C
37% formaldehyde	DAMAO	685-2013
5,000 µL pipette	Eppendorf	3120000275
5,000 µL pipette tips	biosharp	BS-5000-TL
50 ml centrifuge tube	Corning	430829
Absolute Ethanol	BOYUAN	678-2002
Bottle glass	Fisher	FB800-100
Chloral Hydrate	Meryer	M13315-100G
Coverslip	Leica	384200
DIC microscope	Zeiss	Axio Imager A1	10x, 20x and 40x magnification
Disinfectant	QIKELONGAN	17-9185
Dissecting needle	Bioroyee	17-9140
Flower nutrient soil	FANGJIE
Forceps	HAIOU	4-94
Glacial Acetic Acid	BOYUAN	676-2007
Glycerol	Solarbio	G8190
Magnetic stirrer	IKA	RET basic
Micro-Tom	Tomato Genetics Resource Center	LA3911
Orbital shaker	QILINBEIER	QB-206
Seeding substrate	PINDSTRUP	LV713/018-LV252	Screening:0-10 mm
Single concave slide	HUABODEYI	HBDY1895
Slide	Leica	3800381
Stereomicroscope	Leica	S8 APO	1x to 4x magnification
Tin foil	ZAOWUFANG	613
Tween 20	Sigma	P1379
Vacuum pump	SHIDING	SHB-III
Vortex meter	Silogex	MX-S