En effektiv clearingprotokoll for studier av frøutvikling i tomat (Solanum lycopersicum L.)

Summary

Tomatfrøet er en viktig modell for å studere genetikk og utviklingsbiologi under plantereproduksjon. Denne protokollen er nyttig for å rydde tomatfrø på ulike utviklingsstadier for å observere den finere embryonale strukturen.

Abstract

Tomat (Solanum lycopersicum L.) er en av de store kontantavlingene over hele verden. Tomatfrøet er en viktig modell for å studere genetikk og utviklingsbiologi under plantereproduksjon. Visualisering av finere embryonal struktur i et tomatfrø hindres ofte av frøbeleggslim, flercellelags integument og en tykkvegget endosperm, som må løses ved arbeidskrevende innebygging. Et enklere alternativ er å bruke vevsryddingsteknikker som gjør frøet nesten gjennomsiktig ved hjelp av kjemiske midler. Selv om konvensjonelle ryddeprosedyrer gir dyp innsikt i mindre frø med tynnere frøbelegg, fortsetter rydding av tomatfrø å være teknisk utfordrende, spesielt i de sene utviklingsstadiene.

Presentert her er en rask og arbeidsbesparende clearingprotokoll for å observere tomatfrøutvikling fra 3 til 23 dager etter blomstring når embryonal morfologi er nesten fullført. Denne metoden kombinerer klorhydratbasert clearingløsning som er mye brukt i Arabidopsis med andre modifikasjoner, inkludert utelatelse av formalin-aceto-alkohol (FAA) fiksering, tilsetning av natriumhypoklorittbehandling av frø, fjerning av myknet frøbeleggslim og vasking og vakuumbehandling. Denne metoden kan brukes til effektiv rydding av tomatfrø i forskjellige utviklingsstadier og er nyttig i full overvåking av utviklingsprosessen av mutantfrø med god romlig oppløsning. Denne clearingprotokollen kan også brukes på dyp avbildning av andre kommersielt viktige arter i Solanaceae.

Introduction

Tomat (S. lycopersicum L.) er en av de viktigste vegetabilske avlingene rundt om i verden, med en produksjon på 186,8 millioner tonn kjøttfulle frukter fra 5,1 millioner hektar i 2020¹. Den tilhører den store Solanaceae-familien med ca 2,716 arter², inkludert mange kommersielt viktige avlinger som aubergine, paprika, potet og tobakk. Den kultiverte tomaten er en diploid art (2n = 2x = 24) med en genomstørrelse på ca. 900 Mb³. I lang tid har det blitt gjort store anstrengelser mot tomatdomestisering og avl ved å velge ønskelige egenskaper fra vill Solanum spp. Det er over 5000 tomattilganger oppført i Tomato Genetics Resource Center, og mer enn 80.000 bakterieplasma av tomater lagres over hele verden⁴. Tomatplanten er flerårig i drivhuset og forplantes av frø. Et modent tomatfrø består av tre hovedrom: et fullvoksent embryo, gjenværende endosperm av cellulær type og et hardt frøbelegg ^5,6 (figur 1A). Etter dobbel befruktning går utviklingen av cellulær endosperm foran utviklingen av zygoter. Ved ~ 5-6 dager etter blomstring (DAF) observeres tocellet proembryo først når endospermen består av seks til åtte kjerner⁷. I Solanum pimpinellifolium nærmer embryoet seg sin endelige størrelse etter 20 DAF, og frø er levedyktige for spiring etter 32 DAF⁸. Etter hvert som embryoet utvikler seg, absorberes endospermen gradvis, og bare en liten mengde endosperm forblir i frøet. Den gjenværende endospermen består av mikropylær endosperm som omgir radikelspissen, og lateral endosperm i resten av frøet ^9,10. Den ytre frøbelegget er utviklet fra fortykket og lignifisert ytre epidermis av integumentet, og med de døde lagene av integumentrester danner de et hardt skall for å beskytte embryoet og endospermen⁵.

Figur 1: Skjematisk fremstilling av et modent frø i Solanum lycopersicum og Arabidopsis thaliana. (A) Langsgående anatomi av et modent tomatfrø. (B) Langsgående anatomi av et modent Arabidopsis-frø. Et modent tomatfrø er omtrent 70 ganger større i størrelse enn et Arabidopsis-frø. Skala barer = (A) 400 μm, (B) 100 μm. Vennligst klikk her for å se en større versjon av dette tallet.

Produksjon av tomatfrø av høy kvalitet avhenger av koordineringen mellom embryoet, endospermen og morsfrøkomponentene¹¹. Dissekering av viktige gener og nettverk i frøutvikling krever en dyp og fullsporet fenotypisk registrering av mutante frø. Konvensjonelle innebyggingsteknikker, som den halvtynne delen og parafinseksjonen, brukes mye på tomatfrø for å observere de lokale og finere strukturene til embryoet^12,13,14,15. Imidlertid er det vanligvis arbeidskrevende å analysere frøutviklingen fra tynne seksjoner og mangler romlig oppløsning på z-aksen. Til sammenligning er vevsrydding en rask og effektiv metode for å finne utviklingsstadiet av embryodefekter som mest sannsynlig vil oppstå¹⁶. Clearingmetoden reduserer ugjennomsiktigheten av indre vev ved å homogenisere brytningsindeksen med ett eller flere biokjemiske midler¹⁶. Hele vevsrydding tillater observasjon av en plantevevstruktur uten å ødelegge integriteten, og kombinasjonen av clearingteknologi og tredimensjonal avbildning har blitt en ideell løsning for å få informasjon om morfologien og utviklingstilstanden til et planteorgan^17,18. Gjennom årene har frøryddingsteknikker blitt brukt i forskjellige plantearter, inkludert Arabidopsis thaliana, Hordeum vulgare og Beta vulgaris 19,20,21,22,23. Blant disse har hele eggløsningsryddingsteknologien vært en effektiv tilnærming til å studere frøutvikling av Arabidopsis, på grunn av sin lille størrelse, 4-5 lag av frøbeleggcellen og endospermen av kjernetypen^24,25. Med kontinuerlig oppdatering av forskjellige clearingblandinger, for eksempel fremveksten av Hoyers løsning²⁶, ble indre strukturer av byggeggløsningen avbildet med høy grad av klarhet, selv om endospermen utgjør hoveddelen av frøene. Embryogenese av sukkerroer kan observeres ved rydding kombinert med vakuumbehandling og mykning med saltsyre¹⁹. Ikke desto mindre, i motsetning til artene nevnt ovenfor, har embryologiske observasjoner ved å rydde protokoller i tomatfrø ikke blitt rapportert. Dette forhindrer detaljert undersøkelse av embryonal og frøutvikling av tomater.

Kloralhydrat brukes ofte som en clearingløsning som gjør at nedsenket vev og celler kan vises på forskjellige optiske plan, og bevarer cellene eller vevskomponentene vesentlig^27,28,29. Kloralhydratbasert clearingprotokoll har blitt brukt til helmontering av frø for å observere embryo og endosperm av Arabidopsis^21,28. Denne clearingløsningen er imidlertid ikke effektiv når det gjelder å rydde tomatfrø, som er mer ugjennomtrengelige enn Arabidopsisfrø. De fysiske barrierene inkluderer: (1) tomatintegumentet har nesten 20 cellelag ved 3 til 15 DAF 30,31, (2) tomatendospermen er cellulær type, ikke nukleær-type³², og (3) tomatfrø er omtrent 70 ganger større i størrelse^33,34 og (4) produserer store mengder frøbelegg^, som blokkerer penetrasjonen av clearingreagenser og påvirker visualiseringen av embryoceller.

Derfor presenterer denne rapporten en optimalisert kloralhydratbasert clearingmetode for helmontering av tomatfrø på forskjellige stadier, noe som muliggjør dyp avbildning av embryoutviklingsprosessen (figur 2).

Protocol

1. Fremstilling av løsninger Forbered FAA-fiksativ ved å tilsette 2,5 ml 37% formaldehyd, 2,5 ml iseddik og 45 ml 70% etanol i et 50 ml sentrifugerør. Vortex og oppbevar den ved 4 °C. Tilberedt FAA-fikseringsmiddel rett før bruk.FORSIKTIG: 37% formaldehyd er etsende og potensielt kreftfremkallende hvis det eksponeres eller inhaleres. Fikseringsmiddelet må utføres i en avtrekkshette mens du har på deg passende personlig verneutstyr. Forbered ryddeløsningen ved å tilsette…

Representative Results

Når tomatfrø ble fjernet ved hjelp av en konvensjonell metode som i Arabidopsis, blokkerte tette endospermceller visualiseringen av tidlige tomatembryoer ved 3 DAF og 6 DAF (figur 3A, B). Etter hvert som det totale volumet av embryoet økte, var et globulært embryo knapt å skille på 9 DAF (figur 3C). Men etter hvert som frøstørrelsen fortsatte å øke, ble permeabiliteten redusert, noe som resulterte i et fuzzy hjerteembryo ved 1…

Discussion

Sammenlignet med mekanisk seksjonering er clearingteknologien mer fordelaktig for tredimensjonal avbildning, da den beholder integriteten til plantevev eller organer¹⁶. Konvensjonelle clearingprotokoller er ofte begrenset til små prøver på grunn av lettere penetrasjon av kjemiske løsninger. Tomatfrø er en problematisk prøve for vevsrydding fordi den er omtrent 70 ganger større enn et Arabidopsis-frø i størrelse og har flere permeabilitetsbarrierer. Arabidopsis frøbelegg…

Materials

1,000 µL pipette	GILSON	FA10006M
1,000 µL pipette tips	Corning	T-1000-B
2 ml centrifuge tube	Axygen	MCT-200-C
37% formaldehyde	DAMAO	685-2013
5,000 µL pipette	Eppendorf	3120000275
5,000 µL pipette tips	biosharp	BS-5000-TL
50 ml centrifuge tube	Corning	430829
Absolute Ethanol	BOYUAN	678-2002
Bottle glass	Fisher	FB800-100
Chloral Hydrate	Meryer	M13315-100G
Coverslip	Leica	384200
DIC microscope	Zeiss	Axio Imager A1	10x, 20x and 40x magnification
Disinfectant	QIKELONGAN	17-9185
Dissecting needle	Bioroyee	17-9140
Flower nutrient soil	FANGJIE
Forceps	HAIOU	4-94
Glacial Acetic Acid	BOYUAN	676-2007
Glycerol	Solarbio	G8190
Magnetic stirrer	IKA	RET basic
Micro-Tom	Tomato Genetics Resource Center	LA3911
Orbital shaker	QILINBEIER	QB-206
Seeding substrate	PINDSTRUP	LV713/018-LV252	Screening:0-10 mm
Single concave slide	HUABODEYI	HBDY1895
Slide	Leica	3800381
Stereomicroscope	Leica	S8 APO	1x to 4x magnification
Tin foil	ZAOWUFANG	613
Tween 20	Sigma	P1379
Vacuum pump	SHIDING	SHB-III
Vortex meter	Silogex	MX-S