Eine flexible Kammer für die Zeitraffer-Bildgebung lebender Zellen mit stimulierter Raman-Streumikroskopie
Summary
Wir berichten über eine flexible Klimakammer mit Tischaufsatz für die Zeitraffer-Bildgebung lebender Zellen mittels aufrecht stimulierter Raman-Streumikroskopie mit Transitsignaldetektion. Lipidtröpfchen wurden in SKOV3-Zellen, die mit Ölsäure behandelt wurden, für bis zu 24 h in einem Zeitintervall von 3 Minuten abgebildet.
Abstract
Die stimulierte Raman-Streumikroskopie (SRS) ist eine markierungsfreie chemische Bildgebungstechnologie. Die Lebendzellbildgebung mit SRS wurde für viele biologische und biomedizinische Anwendungen demonstriert. Die Langzeit-Zeitraffer-SRS-Bildgebung von lebenden Zellen ist jedoch noch nicht weit verbreitet. Die SRS-Mikroskopie verwendet häufig ein Wasserimmersionsobjektiv mit hoher numerischer Apertur (NA) und einen Ölimmersionskondensator mit hoher NA, um eine hochauflösende Bildgebung zu erzielen. In diesem Fall beträgt der Abstand zwischen Objektiv und Kondensor nur wenige Millimeter. Daher können die meisten kommerziellen Stage-Top-Klimakammern aufgrund ihrer großen Dicke mit einer starren Glasabdeckung nicht für die SRS-Bildgebung verwendet werden. Dieser Artikel beschreibt das Design und die Herstellung einer flexiblen Kammer, die für die Zeitraffer-Bildgebung lebender Zellen mit transmittierter SRS-Signaldetektion auf einem aufrechten Mikroskoprahmen verwendet werden kann. Die Flexibilität der Kammer wird durch die Verwendung eines weichen Materials – einer dünnen Naturkautschukfolie – erreicht. Das neue Gehäuse- und Kammerdesign kann problemlos in ein bestehendes SRS-Bildgebungssystem integriert werden. Die Tests und vorläufigen Ergebnisse zeigen, dass das flexible Kammersystem eine stabile, langfristige Zeitraffer-SRS-Bildgebung von lebenden Zellen ermöglicht, die in Zukunft für verschiedene Bioimaging-Anwendungen verwendet werden kann.
Introduction
Die optische Mikroskopie dient der Beobachtung der Mikrostrukturen von Proben. Die optische Bildgebung ist schnell, weniger invasiv und weniger zerstörerisch als andere Technologien1. Die Bildgebung lebender Zellen mit optischer Mikroskopie wurde entwickelt, um die Dynamik kultivierter lebender Zellen über einen langen Zeitraum zu erfassen2. Verschiedene Arten von optischen Kontrasten liefern unterschiedliche Informationen über biologische Proben. Zum Beispiel zeigt die optische Phasenmikroskopie den feinen Unterschied in den Brechungsindizes in der Probe3. Die Fluoreszenzmikroskopie wird häufig verwendet, um bestimmte Biomoleküle oder Zellorganellen abzubilden. Die breitbandigen Anregungs- und Emissionsspektren der Fluoreszenz führen jedoch in der Regel zu spektralen Überlappungen, wenn eine Mehrfarbenbildgebung durchgeführt wird4. Fluoreszierende Moleküle sind lichtempfindlich und können nach längerer, periodischer Lichtexposition gebleicht werden. Darüber hinaus kann die Fluoreszenzmarkierung die Bioverteilung der Moleküle in Zellen verändern5. Die SRS-Mikroskopie ist eine markierungsfreie chemische Bildgebungstechnologie6. Der Kontrast von SRS beruht auf dem Schwingungsübergang spezifischer chemischer Bindungen. Die Schwingungsfrequenz einer chemischen Bindung weist oft eine schmale spektrale Bandbreite auf, so dass es möglich ist, mehrere Raman-Banden in denselben Proben abzubilden7. Die SRS-Mikroskopie ist ein einzigartiges Werkzeug für die Bildgebung lebender Zellen, das mehrere chemische Kontraste auf markierungsfreie Weise liefert8.
Während die SRS-Bildgebung von ungefärbten Zellen für viele Studien verwendet wurde, ist die Langzeit-Zeitraffer-SRS-Bildgebung von lebenden Zellen noch nicht weit verbreitet. Ein Grund dafür ist, dass kommerzielle offene Kammern aufgrund ihrer großen Dicke nicht direkt für die SRS-Bildgebung verwendet werden können 9,10,11,12. Diese Kammern mit Glasdeckel sind meist für die Hellfeld- oder Fluoreszenzbildgebung mit einem einzigen Objektiv mit hoher NA und einem Rückwärtsdetektionsschema ausgelegt. Die SRS-Bildgebung bevorzugt jedoch die transmittierte Detektion sowohl mit einem Objektiv mit hoher NA als auch mit einem Kondensator mit hoher NA, wodurch nur ein sehr kurzer Abstand (typischerweise einige Millimeter) zwischen dem Objektiv und dem Kondensator verbleibt. Um dieses Problem zu lösen, haben wir eine flexible Kammer aus weichem Material entwickelt, die eine Zeitraffer-SRS-Bildgebung von lebenden Zellen mit einem aufrechten Mikroskoprahmen ermöglicht. Bei dieser Konstruktion wurde das Wassertauchobjektiv in der weichen Kammer eingeschlossen und kann sich zu Fokussier- und Abbildungszwecken frei dreidimensional bewegen.
Die optimale Temperatur für die Kultivierung der meisten Säugetierzellen liegt bei 37 °C, während die Raumtemperatur immer 10° niedriger ist. Eine Temperatur von mehr oder weniger als 37 °C hat einen dramatischen Einfluss auf die Zellwachstumsrate13. Daher ist eine Temperaturkontrolle der Zellkulturumgebung in einem Lebendzell-Bildgebungssystem erforderlich. Es ist bekannt, dass Temperaturinstabilität während der Langzeitbildgebung zu Defokussierungsproblemen führt14. Um eine stabile Umgebung bei 37 °C zu erreichen, haben wir eine große Gehäusekammer gebaut, die den gesamten Mikroskoprahmen abdeckt, einschließlich einer Wärmedämmschicht unter dem Mikroskop (Abbildung 1). Innerhalb der großen Temperaturregelkammer trägt die kleine flexible Kammer dazu bei, die physiologische Luftfeuchtigkeit und den pH-Wert durch den regulierten Luftstrom, der mit 5 % CO 2 ergänzt wird, genau aufrechtzuerhalten (Abbildung 2). Die Temperatur und Luftfeuchtigkeit der Kammern wurden gemessen, um zu bestätigen, dass das Doppelkammerdesign die optimalen Zellkulturbedingungen für das Zellwachstum unter langfristiger, periodischer SRS-Bildgebung bot (Abbildung 3). Anschließend demonstrierten wir die Anwendung des Systems zur Zeitraffer-Bildgebung und Verfolgung von Lipidtröpfchen (LDs) in SKOV3-Krebszellen (Abbildung 4, Abbildung 5 und Abbildung 6).
Protocol
Representative Results
Discussion
Die Zeitraffer-Lebendzell-SRS-Mikroskopie ist ein alternatives bildgebendes Verfahren zur markierungsfreien Molekülverfolgung. Im Vergleich zur Fluoreszenzmarkierung ist die SRS-Bildgebung frei von Photobleichung, was eine Langzeitüberwachung von Molekülen ermöglicht. Bisher ist das Lebendzell-Bildgebungssystem auf einer aufrechten SRS-Mikroskopie jedoch nicht kommerziell erhältlich. In dieser Arbeit wurde ein Lebendzell-Bildgebungssystem mit einer stabilen, thermisch isolierten Mikroskopgehäusebox und einer flexib…
Divulgazioni
The authors have nothing to disclose.
Acknowledgements
Wir möchten dem Undergraduate Senior Design Team 2019 (Suk Chul Yoon, Ian Foxton, Louis Mazza und James Walsh) an der Binghamton University für das Design, die Herstellung und das Testen der Mikroskopgehäusebox danken. Wir danken Scott Hancock, Olga Petrova und Fabiola Moreno Olivas von der Binghamton University für die hilfreichen Gespräche. Diese Forschung wurde von den National Institutes of Health unter der Fördernummer R15GM140444 unterstützt.
Materials
| A lab-built SRS microscope | https://rdcu.be/cP6ve | ||
| HF2LI 50 MHz lock-in amplifer | Zurich Instruments | HF2LI | |
| Iris diaphragm | Thorlabs Inc | SM1D12 | |
| Kinematic mirror mount | Thorlabs Inc | KM100 | |
| Microscope frame | Nikon Inc | FN-1 | |
| Motorized microscopy stage | Prior Scientific | Z-Deck | |
| Oil-immersion condenser (C-AA Achromat/Aplanat, NA 1.4) | Nikon Inc | MBL71405 | |
| Water-immersion objective (CFI75 Apo 25XC W 1300) | Nikon Inc | MRD77225 | |
| Materials and parts for the microscope enclosure (31'' x 29'' x 28'' L x W x H) | |||
| Airtherm heater module | World Precision Instruments (WPI) | AIRTHERM-SAT-1W | |
| Airtherm heater controller, CO2 and humidity monitor | World Precision Instruments (WPI) | AIRTHERM-SMT-1W | |
| Air/CO2 mixer module | World Precision Instruments (WPI) | ECU-HOC-W | |
| Flexible duct hose (2-1/2'' ID, 2-3/4'' OD) | McMaster-Carr | 56675K71 | |
| High-temperature glass-mica ceramic, easy-to-machine (6'' x 6'', 1/4'' thickness) | McMaster-Carr | 8489K62 | |
| Polycarbonate sheets (thickness 0.25'') | McMaster-Carr | 8574K286 | |
| Silicone rubber sheets (36'' x 36'', thickness 1/8'') | McMaster-Carr | 5827T43 | |
| Materials and parts for the Flexible chamber | |||
| Hot plate | McMaster-Carr | 31745K11 | |
| High-purity inline filter, 1/4 NPT | McMaster-Carr | 6645T18 | |
| Hole saw (cutting diameter 1-7/8 inch) | McMaster-Carr | 4066A34 | |
| Hole saw (cutting diameter 50 mm) | McMaster-Carr | 4556A19 | |
| High-temperature silicone rubber tubing, soft, 2 mm ID, 5 mm OD | McMaster-Carr | 5054K313 | |
| Inline filter (1/4 NPT, 40 micron) | McMaster-Carr | 98385K843 | |
| Multipurpose 6061 Aluminum round tube (1/8'' wall thickness, 4'' OD) | McMaster-Carr | 9056K42 | |
| Multipurpose 6061 Aluminum round tube (3/4'' wall thickness, 3-3/4'' OD) | McMaster-Carr | 9056K47 | |
| Multipurpose 6061 Aluminum bar (12'' x 12'', thickness 1/4'') | McMaster-Carr | 8975K142 | |
| Multipurpose 6061 Aluminum bar (8'' x 8'', thickness 3/8'') | McMaster-Carr | 9246K21 | |
| Objective nosepiece (single) | Nikon Inc | FN-MN-H | |
| Sample holder (modified) | Prior Scientific | HZ202 | |
| Ultra-thin natural rubber film (thickness 0.01'') | McMaster-Carr | 8611K13 | |
| Vacuum-sealable glass jar | McMaster-Carr | 3231T44 | |
| Software | |||
| MATLAB | MathWorks | ||
| ImageJ (Fiji) | imagej.net | ||
| ScanImage | Vidrio Technologies, LLC | SRS imaging software | |
| Materials for live-cell imaging | |||
| Cover glass bottom sterile culture dishes (Dia.x H, 50 x 7 mm) | Electron Microscopy Sciences (EMS) | 70674-02 | |
| DMEM cell culture medium | ThermoFisher Scientific | 11965092 | |
| Fetal bovine serum (FBS) | ThermoFisher Scientific | 26140079 | |
| LysoSensor fluorescent dye DND-189 | ThermoFisher Scientific | L7535 (Invitrogen) | |
| Oleic acid | MilliporeSigma | 364525 | |
| SKOV3 cell line | ATCC | HTB-77 |
Riferimenti
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