Een flexibele kamer voor time-lapse live-cell imaging met gestimuleerde Raman-verstrooiingsmicroscopie
Summary
We rapporteren een stage-top, flexibele omgevingskamer voor time-lapse beeldvorming van levende cellen met behulp van rechtop gestimuleerde Raman-verstrooiingsmicroscopie met verzonden signaaldetectie. Lipidedruppeltjes werden afgebeeld in SKOV3-cellen behandeld met oliezuur gedurende maximaal 24 uur met een tijdsinterval van 3 minuten.
Abstract
Stimulated Raman scattering (SRS) microscopie is een labelvrije chemische beeldvormingstechnologie. Live-cell beeldvorming met SRS is aangetoond voor vele biologische en biomedische toepassingen. Langdurige time-lapse SRS-beeldvorming van levende cellen is echter niet op grote schaal toegepast. SRS-microscopie maakt vaak gebruik van een waterdompelobjectief met hoog numeriek diafragma (NA) en een hoge NA-oliedompelcondensor om beeldvorming met hoge resolutie te bereiken. In dit geval is de opening tussen het objectief en de condensor slechts enkele millimeters. Daarom kunnen de meeste commerciële podiumomgevingskamers niet worden gebruikt voor SRS-beeldvorming vanwege hun grote dikte met een stijve glazen afdekking. Dit artikel beschrijft het ontwerp en de fabricage van een flexibele kamer die kan worden gebruikt voor time-lapse live-cell imaging met verzonden SRS-signaaldetectie op een rechtopstaand microscoopframe. De flexibiliteit van de kamer wordt bereikt door een zacht materiaal te gebruiken – een dunne natuurlijke rubberen film. De nieuwe behuizing en het ontwerp van de kamer kunnen eenvoudig worden toegevoegd aan een bestaande SRS-beeldvormingsopstelling. De tests en voorlopige resultaten tonen aan dat het flexibele kamersysteem stabiele, langdurige, time-lapse SRS-beeldvorming van levende cellen mogelijk maakt, die in de toekomst voor verschillende bioimaging-toepassingen kan worden gebruikt.
Introduction
Optische microscopie wordt gebruikt om de microstructuren van monsters te observeren. Optische beeldvorming is snel, minder invasief en minder destructief dan andere technologieën1. Live-cell imaging met optische microscopie is ontwikkeld om de dynamiek van gekweekte levende cellen over een lange periode vast te leggen2. Verschillende soorten optische contrasten bieden verschillende informatie over biologische monsters. Optische fasemicroscopie toont bijvoorbeeld het subtiele verschil in de brekingsindices in het monster3. Fluorescentiemicroscopie wordt veel gebruikt om specifieke biomoleculen of cellulaire organellen in beeld te brengen. De breedbandexcitatie- en emissiespectra van fluorescentie resulteren echter meestal in spectrale overlapping wanneer meerkleurige beeldvorming wordt uitgevoerd4. Fluorescerende moleculen zijn lichtgevoelig en kunnen worden gebleekt na langdurige, periodieke blootstelling aan licht. Bovendien kan fluorescentielabeling de biodistributie van de moleculen in cellen5 veranderen. SRS-microscopie is een labelvrije chemische beeldvormingstechnologie6. Het contrast van SRS is gebaseerd op de trillingsovergang van specifieke chemische bindingen. De trillingsfrequentie van een chemische binding vertoont vaak een smalle spectrale bandbreedte, waardoor het mogelijk is om meerdere Raman-banden in dezelfde monsters af te beelden7. SRS-microscopie is een uniek hulpmiddel voor beeldvorming van levende cellen en biedt meerdere chemische contrasten op een labelvrije manier8.
Hoewel SRS-beeldvorming van niet-gekleurde cellen voor veel studies is gebruikt, is SRS-beeldvorming van levende cellen op lange termijn niet op grote schaal toegepast. Een reden is dat commerciële open kamers niet direct kunnen worden gebruikt voor SRS-beeldvorming vanwege hun grote dikte 9,10,11,12. Deze kamers met een glazen deksel zijn meestal ontworpen voor brightfield- of fluorescentiebeeldvorming met behulp van een enkel hoog NA-objectief met een achterwaarts detectieschema. SRS-beeldvorming geeft echter de voorkeur aan verzonden detectie met behulp van zowel een hoog NA-objectief als een hoge NA-condensor, waardoor er slechts een zeer korte opening (meestal enkele millimeters) tussen het objectief en de condensor overblijft. Om dit probleem op te lossen, hebben we een flexibele kamer ontworpen met behulp van een zacht materiaal om time-lapse SRS-beeldvorming van levende cellen mogelijk te maken met behulp van een rechtopstaand microscoopframe. In dit ontwerp is het waterdompelobjectief ingesloten in de zachte kamer en kan het vrij bewegen in drie dimensies voor scherpstel- en beeldvormingsdoeleinden.
De optimale temperatuur voor het kweken van de meeste zoogdiercellen is 37 °C, terwijl de kamertemperatuur altijd 10° lager is dan dit. Temperatuur hoger of lager dan 37 °C heeft een dramatisch effect op de celgroeisnelheid13. Daarom is temperatuurregeling van de celkweekomgeving vereist in een live-cell imaging-systeem. Het is bekend dat temperatuurinstabiliteit zal leiden tot onscherpe problemen tijdens langdurige beeldvorming14. Om een stabiele omgeving van 37 °C te bereiken, hebben we een grote behuizingskamer gebouwd om het hele microscoopframe te bedekken, inclusief een thermische isolatielaag onder de microscoop (figuur 1). In de omvangrijke temperatuurregelkamer helpt de kleine flexibele kamer om de fysiologische vochtigheid en pH nauwkeurig te handhaven via de gereguleerde luchtstroom aangevuld met 5% CO 2 (figuur 2). De temperatuur en vochtigheid van de kamers werden gemeten om te bevestigen dat het ontwerp met dubbele kamer de optimale celkweekconditie bood voor celgroei onder langdurige, periodieke SRS-beeldvorming (figuur 3). Vervolgens demonstreerden we de toepassing van het systeem voor time-lapse beeldvorming en het volgen van lipidedruppels (LDs) in SKOV3-kankercellen (figuur 4, figuur 5 en figuur 6).
Protocol
Representative Results
Discussion
Time-lapse live-cell SRS-microscopie is een alternatieve beeldvormingstechniek voor het volgen van moleculen op een labelvrije manier. In vergelijking met fluorescentie-etikettering is SRS-beeldvorming vrij van fotobleken, waardoor moleculen op lange termijn kunnen worden gemonitord. Tot op heden is het live cell imaging-systeem op een rechtopstaande SRS-microscopie echter niet in de handel verkrijgbaar. In dit werk werd een live cell imaging-systeem met een stabiele thermisch geïsoleerde microscoopbehuizingsdoos en een…
Divulgazioni
The authors have nothing to disclose.
Acknowledgements
We willen het 2019 Undergraduate Senior Design Team (Suk Chul Yoon, Ian Foxton, Louis Mazza en James Walsh) aan de Binghamton University bedanken voor het ontwerp, de fabricage en het testen van de microscoopbehuizingsdoos. We bedanken Scott Hancock, Olga Petrova en Fabiola Moreno Olivas van Binghamton University voor nuttige discussies. Dit onderzoek werd ondersteund door de National Institutes of Health onder awardnummer R15GM140444.
Materials
| A lab-built SRS microscope | https://rdcu.be/cP6ve | ||
| HF2LI 50 MHz lock-in amplifer | Zurich Instruments | HF2LI | |
| Iris diaphragm | Thorlabs Inc | SM1D12 | |
| Kinematic mirror mount | Thorlabs Inc | KM100 | |
| Microscope frame | Nikon Inc | FN-1 | |
| Motorized microscopy stage | Prior Scientific | Z-Deck | |
| Oil-immersion condenser (C-AA Achromat/Aplanat, NA 1.4) | Nikon Inc | MBL71405 | |
| Water-immersion objective (CFI75 Apo 25XC W 1300) | Nikon Inc | MRD77225 | |
| Materials and parts for the microscope enclosure (31'' x 29'' x 28'' L x W x H) | |||
| Airtherm heater module | World Precision Instruments (WPI) | AIRTHERM-SAT-1W | |
| Airtherm heater controller, CO2 and humidity monitor | World Precision Instruments (WPI) | AIRTHERM-SMT-1W | |
| Air/CO2 mixer module | World Precision Instruments (WPI) | ECU-HOC-W | |
| Flexible duct hose (2-1/2'' ID, 2-3/4'' OD) | McMaster-Carr | 56675K71 | |
| High-temperature glass-mica ceramic, easy-to-machine (6'' x 6'', 1/4'' thickness) | McMaster-Carr | 8489K62 | |
| Polycarbonate sheets (thickness 0.25'') | McMaster-Carr | 8574K286 | |
| Silicone rubber sheets (36'' x 36'', thickness 1/8'') | McMaster-Carr | 5827T43 | |
| Materials and parts for the Flexible chamber | |||
| Hot plate | McMaster-Carr | 31745K11 | |
| High-purity inline filter, 1/4 NPT | McMaster-Carr | 6645T18 | |
| Hole saw (cutting diameter 1-7/8 inch) | McMaster-Carr | 4066A34 | |
| Hole saw (cutting diameter 50 mm) | McMaster-Carr | 4556A19 | |
| High-temperature silicone rubber tubing, soft, 2 mm ID, 5 mm OD | McMaster-Carr | 5054K313 | |
| Inline filter (1/4 NPT, 40 micron) | McMaster-Carr | 98385K843 | |
| Multipurpose 6061 Aluminum round tube (1/8'' wall thickness, 4'' OD) | McMaster-Carr | 9056K42 | |
| Multipurpose 6061 Aluminum round tube (3/4'' wall thickness, 3-3/4'' OD) | McMaster-Carr | 9056K47 | |
| Multipurpose 6061 Aluminum bar (12'' x 12'', thickness 1/4'') | McMaster-Carr | 8975K142 | |
| Multipurpose 6061 Aluminum bar (8'' x 8'', thickness 3/8'') | McMaster-Carr | 9246K21 | |
| Objective nosepiece (single) | Nikon Inc | FN-MN-H | |
| Sample holder (modified) | Prior Scientific | HZ202 | |
| Ultra-thin natural rubber film (thickness 0.01'') | McMaster-Carr | 8611K13 | |
| Vacuum-sealable glass jar | McMaster-Carr | 3231T44 | |
| Software | |||
| MATLAB | MathWorks | ||
| ImageJ (Fiji) | imagej.net | ||
| ScanImage | Vidrio Technologies, LLC | SRS imaging software | |
| Materials for live-cell imaging | |||
| Cover glass bottom sterile culture dishes (Dia.x H, 50 x 7 mm) | Electron Microscopy Sciences (EMS) | 70674-02 | |
| DMEM cell culture medium | ThermoFisher Scientific | 11965092 | |
| Fetal bovine serum (FBS) | ThermoFisher Scientific | 26140079 | |
| LysoSensor fluorescent dye DND-189 | ThermoFisher Scientific | L7535 (Invitrogen) | |
| Oleic acid | MilliporeSigma | 364525 | |
| SKOV3 cell line | ATCC | HTB-77 |
Riferimenti
- Mertz, J. . Introduction to Optical Microscopy. , (2019).
- Ettinger, A., Wittmann, T. Fluorescence live cell imaging. Methods in Cell Biology. 123, 77-94 (2014).
- Park, Y., Depeursinge, C., Popescu, G. Quantitative phase imaging in biomedicine. Nature Photonics. 12 (10), 578-589 (2018).
- Hu, C. D., Kerppola, T. K. Simultaneous visualization of multiple protein interactions in living cells using multicolor fluorescence complementation analysis. Nature Biotechnology. 21 (5), 539-545 (2003).
- lamo, P., et al. Fluorescent dye labeling changes the biodistribution of tumor-targeted nanoparticles. Pharmaceutics. 12 (11), 1004 (2020).
- Cheng, J. X., Xie, X. S. Vibrational spectroscopic imaging of living systems: An emerging platform for biology and medicine. Science. 350 (6264), aaa870 (2015).
- Lu, F. K., et al. Label-free DNA imaging in vivo with stimulated Raman scattering microscopy. Proceedings of the National Academy of Sciences of the United States of America. 112 (37), 11624-11629 (2015).
- Hill, A. H., Fu, D. Cellular imaging using stimulated Raman scattering microscopy. Analytical Chemistry. 91 (15), 9333-9342 (2019).
- Buđa, R., Vukušić, K., Tolić, I. . Methods in Cell Biology. (139), 81-101 (2017).
- Chiarelli, T. J., Grieshaber, N. A., Grieshaber, S. S. Live-cell forward genetic approach to identify and isolate developmental mutants in Chlamydia trachomatis. Journal of Visualized Experiments. (160), e61365 (2020).
- Lemon, W. C., McDole, K. Live-cell imaging in the era of too many microscopes. Current Opinion in Cell Biology. 66, 34-42 (2020).
- Birk, S. E., et al. Management of oral biofilms by nisin delivery in adhesive microdevices. European Journal of Pharmaceutics and Biopharmaceutics. 167, 83-88 (2021).
- Watanabe, I., Okada, S. Effects of temperature on growth rate of cultured mammalian cells (L5178Y). Journal of Cell Biology. 32 (2), 309-323 (1967).
- Lac, A., Lam, A. L., Heit, B. . Fluorescent Microscopy. , 57-73 (2022).
- Grossman, D. G. Machinable glass-ceramics based on tetrasilicic mica. Journal of the American Ceramic Society. 55 (9), 446-449 (1972).
- Yuan, Y., Shah, N., Almohaisin, M. I., Saha, S., Lu, F. Assessing fatty acid-induced lipotoxicity and its therapeutic potential in glioblastoma using stimulated Raman microscopy. Scientific Reports. 11 (1), 1-14 (2021).
- Pologruto, T. A., Sabatini, B. L., Svoboda, K. ScanImage: flexible software for operating laser scanning microscopes. Biomedical Engineering Online. 2 (1), 1-9 (2003).
- Sun, M. W., Yuan, Y. H., Lu, F. K., Di Pasqua, A. J. Physicochemical factors that influence the biocompatibility of cationic liposomes and their ability to deliver DNA to the nuclei of ovarian cancer SK-OV-3 cells. Materials. 14 (2), 416 (2021).
- Schneider, C. A., Rasband, W. S., Eliceiri, K. W. NIH Image to ImageJ: 25 years of image analysis. Nature Methods. 9 (7), 671-675 (2012).
- Ozeki, Y., Itoh, K. Stimulated Raman scattering microscopy for live-cell imaging with high contrast and high sensitivity. Laser Physics. 20 (5), 1114-1118 (2010).
- Zhang, X., et al. Label-free live-cell imaging of nucleic acids using stimulated Raman scattering microscopy. ChemPhysChem. 13 (4), 1054-1059 (2012).
- Stiebing, C., et al. Real-time Raman and SRS imaging of living human macrophages reveals cell-to-cell heterogeneity and dynamics of lipid uptake. Journal of Biophotonics. 10 (9), 1217-1226 (2017).
- Miao, K., Wei, L. Live-cell imaging and quantification of PolyQ aggregates by stimulated Raman scattering of selective deuterium labeling. ACS Central Science. 6 (4), 478-486 (2020).
- Brzozowski, K., et al. Stimulated Raman scattering microscopy in chemistry and life science -Development, innovation, perspectives. Biotechnology Advances. 60, 108003 (2022).
- Hislop, E. W., Tipping, W. J., Faulds, K., Graham, D. Label-free imaging of lipid droplets in prostate cells using stimulated Raman scattering microscopy and multivariate analysis. Analytical Chemistry. 94 (25), 8899-8908 (2022).
- Chen, T., Yavuz, A., Wang, M. C. Dissecting lipid droplet biology with coherent Raman scattering microscopy. Journal of Cell Science. 135 (5), jcs252353 (2022).
- Cao, C., Zhou, D., Chen, T., Streets, A. M., Huang, Y. Label-Free digital quantification of lipid droplets in single cells by stimulated Raman microscopy on a microfluidic platform. Analytical Chemistry. 88 (9), 4931-4939 (2016).
- Zhang, C., et al. Stimulated Raman scattering flow cytometry for label-free single-particle analysis. Optica. 4 (1), 103-109 (2017).
- Suzuki, Y., et al. Label-free chemical imaging flow cytometry by high-speed multicolor stimulated Raman scattering. Proceedings of the National Academy of Sciences of the United States of America. 116 (32), 15842-15848 (2019).
- Gala de Pablo, J., Lindley, M., Hiramatsu, K., Goda, K. High-throughput Raman flow cytometry and beyond. Accounts of Chemical Research. 54 (9), 2132-2143 (2021).
- Cole, R. Live-cell imaging: the cell’s perspective. Cell Adhesion & Migration. 8 (5), 452-459 (2014).
- Kreft, M., Stenovec, M., Zorec, R. Focus-drift correction in time-lapse confocal imaging. Annals of the New York Academy of Sciences. 1048 (1), 321-330 (2005).
- Firestone, L., Cook, K., Culp, K., Talsania, N., Preston Jr, K. Comparison of autofocus methods for automated microscopy. Cytometry: The Journal of the International Society for Analytical Cytology. 12 (3), 195-206 (1991).
- Van Helvert, S., Storm, C., Friedl, P. Mechanoreciprocity in cell migration. Nature Cell Biology. 20 (1), 8-20 (2018).
- Zong, C., et al. Plasmon-enhanced stimulated Raman scattering microscopy with single-molecule detection sensitivity. Nature Communications. 10 (1), 1-11 (2019).
- Wei, L., et al. Super-multiplex vibrational imaging. Nature. 544 (7651), 465-470 (2017).
