Une chambre flexible pour l’imagerie de cellules vivantes en accéléré avec microscopie à diffusion Raman stimulée
Summary
Nous rapportons une chambre environnementale flexible au sommet de l’étage pour l’imagerie accélérée de cellules vivantes à l’aide de la microscopie à diffusion Raman stimulée verticalement avec détection de signal transmis. Des gouttelettes lipidiques ont été imagées dans des cellules SKOV3 traitées à l’acide oléique pendant 24 heures avec un intervalle de temps de 3 minutes.
Abstract
La microscopie à diffusion Raman stimulée (SRS) est une technologie d’imagerie chimique sans marquage. L’imagerie de cellules vivantes avec SRS a été démontrée pour de nombreuses applications biologiques et biomédicales. Cependant, l’imagerie SRS à long terme de cellules vivantes n’a pas été largement adoptée. La microscopie SRS utilise souvent un objectif d’immersion dans l’eau à grande ouverture numérique (NA) et un condenseur à immersion d’huile à haute NA pour obtenir une imagerie à haute résolution. Dans ce cas, l’écart entre l’objectif et le condensateur n’est que de quelques millimètres. Par conséquent, la plupart des chambres environnementales commerciales ne peuvent pas être utilisées pour l’imagerie SRS en raison de leur grande épaisseur avec un couvercle en verre rigide. Cet article décrit la conception et la fabrication d’une chambre flexible pouvant être utilisée pour l’imagerie de cellules vivantes en accéléré avec détection de signal SRS transmis sur un cadre de microscope vertical. La flexibilité de la chambre est obtenue en utilisant un matériau souple – un film mince de caoutchouc naturel. La nouvelle conception du boîtier et de la chambre peut être facilement ajoutée à une installation d’imagerie SRS existante. Les tests et les résultats préliminaires démontrent que le système de chambre flexible permet une imagerie SRS stable, à long terme et accélérée de cellules vivantes, qui peut être utilisée pour diverses applications de bioimagerie à l’avenir.
Introduction
La microscopie optique est utilisée pour observer les microstructures des échantillons. L’imagerie optique est rapide, moins invasive et moins destructrice que les autres technologies1. L’imagerie de cellules vivantes avec microscopie optique est développée pour capturer la dynamique des cellules vivantes cultivées sur une longue période2. Différents types de contrastes optiques fournissent des informations distinctes sur les échantillons biologiques. Par exemple, la microscopie optique en phase montre la différence subtile dans les indices de réfraction à travers l’échantillon3. La microscopie à fluorescence est largement utilisée pour imager des biomolécules spécifiques ou des organites cellulaires. Cependant, les spectres d’excitation et d’émission à large bande de fluorescence entraînent généralement un chevauchement spectral lorsque l’imagerie multicolore est réalisée4. Les molécules fluorescentes sont sensibles à la lumière et peuvent être blanchies après une exposition périodique à long terme à la lumière. De plus, le marquage par fluorescence peut modifier la biodistribution des molécules dans les cellules5. La microscopie SRS est une technologie d’imagerie chimique sans marquage6. Le contraste du SRS repose sur la transition vibratoire de liaisons chimiques spécifiques. La fréquence vibratoire d’une liaison chimique présente souvent une bande passante spectrale étroite, ce qui permet d’imager plusieurs bandes Raman dans les mêmes échantillons7. La microscopie SRS est un outil unique pour l’imagerie de cellules vivantes, fournissant de multiples contrastes chimiques d’une manière sans marquage8.
Alors que l’imagerie SRS de cellules non colorées a été utilisée pour de nombreuses études, l’imagerie SRS à long terme de cellules vivantes n’a pas été largement adoptée. L’une des raisons est que les chambres ouvertes commerciales ne peuvent pas être utilisées directement pour l’imagerie SRS en raison de leur grande épaisseur 9,10,11,12. Ces chambres avec un couvercle en verre sont principalement conçues pour l’imagerie en fond clair ou en fluorescence utilisant un seul objectif à haute NA avec un schéma de détection arrière. Cependant, l’imagerie SRS préfère la détection transmise utilisant à la fois un objectif NA élevé et un condenseur NA élevé, ce qui ne laisse qu’un très court espace (généralement quelques millimètres) entre l’objectif et le condensateur. Pour surmonter ce problème, nous avons conçu une chambre flexible utilisant un matériau souple pour permettre l’imagerie SRS en accéléré des cellules vivantes à l’aide d’un cadre de microscope vertical. Dans cette conception, l’objectif de trempage d’eau a été enfermé dans la chambre souple et peut se déplacer librement en trois dimensions à des fins de mise au point et d’imagerie.
La température optimale pour la culture de la plupart des cellules de mammifères est de 37 °C, tandis que la température ambiante est toujours inférieure de 10 °C. Une température supérieure ou inférieure à 37 °C a un effet dramatique sur le taux de croissance cellulaire13. Par conséquent, le contrôle de la température de l’environnement de culture cellulaire est nécessaire dans un système d’imagerie de cellules vivantes. On sait que l’instabilité de la température entraînera des problèmes de défocalisation lors de l’imagerie à long terme14. Pour obtenir un environnement stable à 37 °C, nous avons construit une grande chambre d’enceinte pour couvrir l’ensemble du cadre du microscope, y compris une couche d’isolation thermique sous le microscope (Figure 1). Dans la grande chambre de régulation de la température, la petite chambre flexible aide à maintenir avec précision l’humidité physiologique et le pH via le débit d’air régulé complété par 5% de CO 2 (Figure 2). La température et l’humidité des chambres ont été mesurées pour confirmer que la conception à double chambre fournissait les conditions de culture cellulaire optimales pour la croissance cellulaire sous imagerie SRS périodique à long terme (Figure 3). Nous avons ensuite démontré l’application du système pour l’imagerie accélérée et le suivi des gouttelettes lipidiques (LD) dans les cellules cancéreuses SKOV3 (Figure 4, Figure 5 et Figure 6).
Protocol
Representative Results
Discussion
La microscopie SRS à cellules vivantes en accéléré est une technique d’imagerie alternative pour le suivi des molécules de manière sans marquage. Par rapport au marquage par fluorescence, l’imagerie SRS est exempte de photoblanchiment, ce qui permet une surveillance à long terme des molécules. Cependant, à ce jour, le système d’imagerie de cellules vivantes sur une microscopie SRS verticale n’est pas disponible dans le commerce. Dans ce travail, un système d’imagerie de cellules vivantes avec une bo?…
Divulgazioni
The authors have nothing to disclose.
Acknowledgements
Nous tenons à remercier l’équipe de conception principale de premier cycle 2019 (Suk Chul Yoon, Ian Foxton, Louis Mazza et James Walsh) de l’Université de Binghamton pour la conception, la fabrication et les tests de la boîte d’enceinte de microscope. Nous remercions Scott Hancock, Olga Petrova et Fabiola Moreno Olivas de l’Université de Binghamton pour leurs discussions utiles. Cette recherche a été soutenue par les National Institutes of Health sous le numéro d’attribution R15GM140444.
Materials
| A lab-built SRS microscope | https://rdcu.be/cP6ve | ||
| HF2LI 50 MHz lock-in amplifer | Zurich Instruments | HF2LI | |
| Iris diaphragm | Thorlabs Inc | SM1D12 | |
| Kinematic mirror mount | Thorlabs Inc | KM100 | |
| Microscope frame | Nikon Inc | FN-1 | |
| Motorized microscopy stage | Prior Scientific | Z-Deck | |
| Oil-immersion condenser (C-AA Achromat/Aplanat, NA 1.4) | Nikon Inc | MBL71405 | |
| Water-immersion objective (CFI75 Apo 25XC W 1300) | Nikon Inc | MRD77225 | |
| Materials and parts for the microscope enclosure (31'' x 29'' x 28'' L x W x H) | |||
| Airtherm heater module | World Precision Instruments (WPI) | AIRTHERM-SAT-1W | |
| Airtherm heater controller, CO2 and humidity monitor | World Precision Instruments (WPI) | AIRTHERM-SMT-1W | |
| Air/CO2 mixer module | World Precision Instruments (WPI) | ECU-HOC-W | |
| Flexible duct hose (2-1/2'' ID, 2-3/4'' OD) | McMaster-Carr | 56675K71 | |
| High-temperature glass-mica ceramic, easy-to-machine (6'' x 6'', 1/4'' thickness) | McMaster-Carr | 8489K62 | |
| Polycarbonate sheets (thickness 0.25'') | McMaster-Carr | 8574K286 | |
| Silicone rubber sheets (36'' x 36'', thickness 1/8'') | McMaster-Carr | 5827T43 | |
| Materials and parts for the Flexible chamber | |||
| Hot plate | McMaster-Carr | 31745K11 | |
| High-purity inline filter, 1/4 NPT | McMaster-Carr | 6645T18 | |
| Hole saw (cutting diameter 1-7/8 inch) | McMaster-Carr | 4066A34 | |
| Hole saw (cutting diameter 50 mm) | McMaster-Carr | 4556A19 | |
| High-temperature silicone rubber tubing, soft, 2 mm ID, 5 mm OD | McMaster-Carr | 5054K313 | |
| Inline filter (1/4 NPT, 40 micron) | McMaster-Carr | 98385K843 | |
| Multipurpose 6061 Aluminum round tube (1/8'' wall thickness, 4'' OD) | McMaster-Carr | 9056K42 | |
| Multipurpose 6061 Aluminum round tube (3/4'' wall thickness, 3-3/4'' OD) | McMaster-Carr | 9056K47 | |
| Multipurpose 6061 Aluminum bar (12'' x 12'', thickness 1/4'') | McMaster-Carr | 8975K142 | |
| Multipurpose 6061 Aluminum bar (8'' x 8'', thickness 3/8'') | McMaster-Carr | 9246K21 | |
| Objective nosepiece (single) | Nikon Inc | FN-MN-H | |
| Sample holder (modified) | Prior Scientific | HZ202 | |
| Ultra-thin natural rubber film (thickness 0.01'') | McMaster-Carr | 8611K13 | |
| Vacuum-sealable glass jar | McMaster-Carr | 3231T44 | |
| Software | |||
| MATLAB | MathWorks | ||
| ImageJ (Fiji) | imagej.net | ||
| ScanImage | Vidrio Technologies, LLC | SRS imaging software | |
| Materials for live-cell imaging | |||
| Cover glass bottom sterile culture dishes (Dia.x H, 50 x 7 mm) | Electron Microscopy Sciences (EMS) | 70674-02 | |
| DMEM cell culture medium | ThermoFisher Scientific | 11965092 | |
| Fetal bovine serum (FBS) | ThermoFisher Scientific | 26140079 | |
| LysoSensor fluorescent dye DND-189 | ThermoFisher Scientific | L7535 (Invitrogen) | |
| Oleic acid | MilliporeSigma | 364525 | |
| SKOV3 cell line | ATCC | HTB-77 |
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