En flexibel kammare för time-lapse live-cell avbildning med stimulerad Raman Scattering mikroskopi
Summary
Vi rapporterar en steg-top, flexibel miljökammare för time-lapse-avbildning av levande celler med upprätt stimulerad Raman-spridningsmikroskopi med överförd signaldetektering. Lipiddroppar avbildades i SKOV3-celler behandlade med oljesyra i upp till 24 timmar med ett tidsintervall på 3 minuter.
Abstract
Stimulerad Raman-spridning (SRS) mikroskopi är en etikettfri kemisk bildteknik. Levande cellavbildning med SRS har visats för många biologiska och biomedicinska tillämpningar. Långvarig time-lapse SRS-avbildning av levande celler har dock inte antagits allmänt. SRS-mikroskopi använder ofta ett vattennedsänkningsmål med hög numerisk bländare (NA) och en hög NA-oljekondensor för att uppnå högupplöst avbildning. I detta fall är klyftan mellan målet och kondensorn bara några millimeter. Därför kan de flesta kommersiella miljökammare inte användas för SRS-avbildning på grund av deras stora tjocklek med ett styvt glasskydd. Detta dokument beskriver design och tillverkning av en flexibel kammare som kan användas för time-lapse live-cellavbildning med överförd SRS-signaldetektering på en upprätt mikroskopram. Kammarens flexibilitet uppnås genom att använda ett mjukt material – en tunn naturgummifilm. Den nya kapslingen och kammardesignen kan enkelt läggas till i en befintlig SRS-bildinstallation. Testerna och de preliminära resultaten visar att det flexibla kammarsystemet möjliggör stabil, långsiktig, time-lapse SRS-avbildning av levande celler, som kan användas för olika bioimaging-applikationer i framtiden.
Introduction
Optisk mikroskopi används för att observera mikrostrukturerna i prover. Optisk avbildning är snabb, mindre invasiv och mindre destruktiv än andra tekniker1. Levande cellavbildning med optisk mikroskopi utvecklas för att fånga dynamiken hos odlade levande celler under en lång period2. Olika typer av optiska kontraster ger distinkt information om biologiska prover. Till exempel visar optisk fasmikroskopi den subtila skillnaden i brytningsindex över provet3. Fluorescensmikroskopi används ofta för att avbilda specifika biomolekyler eller cellulära organeller. Emellertid resulterar bredbandsexcitations- och emissionsspektra för fluorescens vanligtvis i spektral överlappning när flerfärgad avbildning utförs4. Fluorescerande molekyler är ljuskänsliga och kan blekas efter långvarig, periodisk ljusexponering. Dessutom kan fluorescensmärkning förändra biodistributionen av molekylerna i celler5. SRS-mikroskopi är en etikettfri kemisk bildteknik6. Kontrasten hos SRS bygger på vibrationsövergången av specifika kemiska bindningar. Vibrationsfrekvensen för en kemisk bindning uppvisar ofta en smal spektralbandbredd, vilket gör det möjligt att avbilda flera Raman-band i samma prover7. SRS-mikroskopi är ett unikt verktyg för avbildning av levande celler, vilket ger flera kemiska kontraster på ett etikettfritt sätt8.
Medan SRS-avbildning av ofärgade celler har använts för många studier, har långvarig time-lapse SRS-avbildning av levande celler inte antagits allmänt. En anledning är att kommersiella öppna kammare inte kan användas direkt för SRS-avbildning på grund av deras stora tjocklek 9,10,11,12. Dessa kammare med glaslock är oftast konstruerade för ljusfälts- eller fluorescensavbildning med ett enda högt NA-mål med ett bakåtdetekteringsschema. SRS-avbildning föredrar dock överförd detektion med både ett högt NA-mål och en hög NA-kondensor, vilket bara lämnar ett mycket kort mellanrum (vanligtvis några millimeter) mellan målet och kondensorn. För att övervinna detta problem designade vi en flexibel kammare med ett mjukt material för att möjliggöra time-lapse SRS-avbildning av levande celler med hjälp av en upprätt mikroskopram. I denna design var vattendoppningsmålet inneslutet i den mjuka kammaren och kan fritt röra sig i tre dimensioner för fokuserings- och bildändamål.
Den optimala temperaturen för odling av de flesta däggdjursceller är 37 °C, medan rumstemperaturen alltid är 10° lägre än detta. Temperatur högre eller lägre än 37 °C har en dramatisk effekt på celltillväxthastigheten13. Därför krävs temperaturkontroll av cellodlingsmiljön i ett levande cellavbildningssystem. Det är känt att temperaturinstabilitet kommer att leda till oskärpningsproblem under långvarig avbildning14. För att uppnå en stabil miljö på 37 °C byggde vi en stor kapslingskammare för att täcka hela mikroskopramen, inklusive ett värmeisoleringsskikt under mikroskopet (figur 1). I den stora temperaturkontrollkammaren hjälper den lilla flexibla kammaren till att noggrant bibehålla den fysiologiska fuktigheten och pH-värdet via det reglerade luftflödet kompletterat med 5% CO 2 (figur 2). Kamrarnas temperatur och fuktighet mättes för att bekräfta att dubbelkammardesignen gav det optimala cellodlingsförhållandet för celltillväxt under långsiktig, periodisk SRS-avbildning (figur 3). Vi demonstrerade sedan tillämpningen av systemet för time-lapse-avbildning och spårning av lipiddroppar (LD) i SKOV3-cancerceller (figur 4, figur 5 och figur 6).
Protocol
Representative Results
Discussion
Time-lapse live-cell SRS-mikroskopi är en alternativ bildteknik för molekylspårning på ett etikettfritt sätt. Jämfört med fluorescensmärkning är SRS-avbildning fri från fotoblekning, vilket möjliggör långtidsövervakning av molekyler. Hittills är dock det levande cellavbildningssystemet på en upprätt SRS-mikroskopi inte kommersiellt tillgängligt. I detta arbete utvecklades ett levande cellavbildningssystem med en stabil värmeisolerad mikroskophöljeslåda och en flexibel inre mjukkammare för att möjli…
Divulgazioni
The authors have nothing to disclose.
Acknowledgements
Vi vill tacka 2019 Undergraduate Senior Design Team (Suk Chul Yoon, Ian Foxton, Louis Mazza och James Walsh) vid Binghamton University för design, tillverkning och testning av mikroskophöljet. Vi tackar Scott Hancock, Olga Petrova och Fabiola Moreno Olivas vid Binghamton University för hjälpsamma diskussioner. Denna forskning stöddes av National Institutes of Health under Award Number R15GM140444.
Materials
| A lab-built SRS microscope | https://rdcu.be/cP6ve | ||
| HF2LI 50 MHz lock-in amplifer | Zurich Instruments | HF2LI | |
| Iris diaphragm | Thorlabs Inc | SM1D12 | |
| Kinematic mirror mount | Thorlabs Inc | KM100 | |
| Microscope frame | Nikon Inc | FN-1 | |
| Motorized microscopy stage | Prior Scientific | Z-Deck | |
| Oil-immersion condenser (C-AA Achromat/Aplanat, NA 1.4) | Nikon Inc | MBL71405 | |
| Water-immersion objective (CFI75 Apo 25XC W 1300) | Nikon Inc | MRD77225 | |
| Materials and parts for the microscope enclosure (31'' x 29'' x 28'' L x W x H) | |||
| Airtherm heater module | World Precision Instruments (WPI) | AIRTHERM-SAT-1W | |
| Airtherm heater controller, CO2 and humidity monitor | World Precision Instruments (WPI) | AIRTHERM-SMT-1W | |
| Air/CO2 mixer module | World Precision Instruments (WPI) | ECU-HOC-W | |
| Flexible duct hose (2-1/2'' ID, 2-3/4'' OD) | McMaster-Carr | 56675K71 | |
| High-temperature glass-mica ceramic, easy-to-machine (6'' x 6'', 1/4'' thickness) | McMaster-Carr | 8489K62 | |
| Polycarbonate sheets (thickness 0.25'') | McMaster-Carr | 8574K286 | |
| Silicone rubber sheets (36'' x 36'', thickness 1/8'') | McMaster-Carr | 5827T43 | |
| Materials and parts for the Flexible chamber | |||
| Hot plate | McMaster-Carr | 31745K11 | |
| High-purity inline filter, 1/4 NPT | McMaster-Carr | 6645T18 | |
| Hole saw (cutting diameter 1-7/8 inch) | McMaster-Carr | 4066A34 | |
| Hole saw (cutting diameter 50 mm) | McMaster-Carr | 4556A19 | |
| High-temperature silicone rubber tubing, soft, 2 mm ID, 5 mm OD | McMaster-Carr | 5054K313 | |
| Inline filter (1/4 NPT, 40 micron) | McMaster-Carr | 98385K843 | |
| Multipurpose 6061 Aluminum round tube (1/8'' wall thickness, 4'' OD) | McMaster-Carr | 9056K42 | |
| Multipurpose 6061 Aluminum round tube (3/4'' wall thickness, 3-3/4'' OD) | McMaster-Carr | 9056K47 | |
| Multipurpose 6061 Aluminum bar (12'' x 12'', thickness 1/4'') | McMaster-Carr | 8975K142 | |
| Multipurpose 6061 Aluminum bar (8'' x 8'', thickness 3/8'') | McMaster-Carr | 9246K21 | |
| Objective nosepiece (single) | Nikon Inc | FN-MN-H | |
| Sample holder (modified) | Prior Scientific | HZ202 | |
| Ultra-thin natural rubber film (thickness 0.01'') | McMaster-Carr | 8611K13 | |
| Vacuum-sealable glass jar | McMaster-Carr | 3231T44 | |
| Software | |||
| MATLAB | MathWorks | ||
| ImageJ (Fiji) | imagej.net | ||
| ScanImage | Vidrio Technologies, LLC | SRS imaging software | |
| Materials for live-cell imaging | |||
| Cover glass bottom sterile culture dishes (Dia.x H, 50 x 7 mm) | Electron Microscopy Sciences (EMS) | 70674-02 | |
| DMEM cell culture medium | ThermoFisher Scientific | 11965092 | |
| Fetal bovine serum (FBS) | ThermoFisher Scientific | 26140079 | |
| LysoSensor fluorescent dye DND-189 | ThermoFisher Scientific | L7535 (Invitrogen) | |
| Oleic acid | MilliporeSigma | 364525 | |
| SKOV3 cell line | ATCC | HTB-77 |
Riferimenti
- Mertz, J. . Introduction to Optical Microscopy. , (2019).
- Ettinger, A., Wittmann, T. Fluorescence live cell imaging. Methods in Cell Biology. 123, 77-94 (2014).
- Park, Y., Depeursinge, C., Popescu, G. Quantitative phase imaging in biomedicine. Nature Photonics. 12 (10), 578-589 (2018).
- Hu, C. D., Kerppola, T. K. Simultaneous visualization of multiple protein interactions in living cells using multicolor fluorescence complementation analysis. Nature Biotechnology. 21 (5), 539-545 (2003).
- lamo, P., et al. Fluorescent dye labeling changes the biodistribution of tumor-targeted nanoparticles. Pharmaceutics. 12 (11), 1004 (2020).
- Cheng, J. X., Xie, X. S. Vibrational spectroscopic imaging of living systems: An emerging platform for biology and medicine. Science. 350 (6264), aaa870 (2015).
- Lu, F. K., et al. Label-free DNA imaging in vivo with stimulated Raman scattering microscopy. Proceedings of the National Academy of Sciences of the United States of America. 112 (37), 11624-11629 (2015).
- Hill, A. H., Fu, D. Cellular imaging using stimulated Raman scattering microscopy. Analytical Chemistry. 91 (15), 9333-9342 (2019).
- Buđa, R., Vukušić, K., Tolić, I. . Methods in Cell Biology. (139), 81-101 (2017).
- Chiarelli, T. J., Grieshaber, N. A., Grieshaber, S. S. Live-cell forward genetic approach to identify and isolate developmental mutants in Chlamydia trachomatis. Journal of Visualized Experiments. (160), e61365 (2020).
- Lemon, W. C., McDole, K. Live-cell imaging in the era of too many microscopes. Current Opinion in Cell Biology. 66, 34-42 (2020).
- Birk, S. E., et al. Management of oral biofilms by nisin delivery in adhesive microdevices. European Journal of Pharmaceutics and Biopharmaceutics. 167, 83-88 (2021).
- Watanabe, I., Okada, S. Effects of temperature on growth rate of cultured mammalian cells (L5178Y). Journal of Cell Biology. 32 (2), 309-323 (1967).
- Lac, A., Lam, A. L., Heit, B. . Fluorescent Microscopy. , 57-73 (2022).
- Grossman, D. G. Machinable glass-ceramics based on tetrasilicic mica. Journal of the American Ceramic Society. 55 (9), 446-449 (1972).
- Yuan, Y., Shah, N., Almohaisin, M. I., Saha, S., Lu, F. Assessing fatty acid-induced lipotoxicity and its therapeutic potential in glioblastoma using stimulated Raman microscopy. Scientific Reports. 11 (1), 1-14 (2021).
- Pologruto, T. A., Sabatini, B. L., Svoboda, K. ScanImage: flexible software for operating laser scanning microscopes. Biomedical Engineering Online. 2 (1), 1-9 (2003).
- Sun, M. W., Yuan, Y. H., Lu, F. K., Di Pasqua, A. J. Physicochemical factors that influence the biocompatibility of cationic liposomes and their ability to deliver DNA to the nuclei of ovarian cancer SK-OV-3 cells. Materials. 14 (2), 416 (2021).
- Schneider, C. A., Rasband, W. S., Eliceiri, K. W. NIH Image to ImageJ: 25 years of image analysis. Nature Methods. 9 (7), 671-675 (2012).
- Ozeki, Y., Itoh, K. Stimulated Raman scattering microscopy for live-cell imaging with high contrast and high sensitivity. Laser Physics. 20 (5), 1114-1118 (2010).
- Zhang, X., et al. Label-free live-cell imaging of nucleic acids using stimulated Raman scattering microscopy. ChemPhysChem. 13 (4), 1054-1059 (2012).
- Stiebing, C., et al. Real-time Raman and SRS imaging of living human macrophages reveals cell-to-cell heterogeneity and dynamics of lipid uptake. Journal of Biophotonics. 10 (9), 1217-1226 (2017).
- Miao, K., Wei, L. Live-cell imaging and quantification of PolyQ aggregates by stimulated Raman scattering of selective deuterium labeling. ACS Central Science. 6 (4), 478-486 (2020).
- Brzozowski, K., et al. Stimulated Raman scattering microscopy in chemistry and life science -Development, innovation, perspectives. Biotechnology Advances. 60, 108003 (2022).
- Hislop, E. W., Tipping, W. J., Faulds, K., Graham, D. Label-free imaging of lipid droplets in prostate cells using stimulated Raman scattering microscopy and multivariate analysis. Analytical Chemistry. 94 (25), 8899-8908 (2022).
- Chen, T., Yavuz, A., Wang, M. C. Dissecting lipid droplet biology with coherent Raman scattering microscopy. Journal of Cell Science. 135 (5), jcs252353 (2022).
- Cao, C., Zhou, D., Chen, T., Streets, A. M., Huang, Y. Label-Free digital quantification of lipid droplets in single cells by stimulated Raman microscopy on a microfluidic platform. Analytical Chemistry. 88 (9), 4931-4939 (2016).
- Zhang, C., et al. Stimulated Raman scattering flow cytometry for label-free single-particle analysis. Optica. 4 (1), 103-109 (2017).
- Suzuki, Y., et al. Label-free chemical imaging flow cytometry by high-speed multicolor stimulated Raman scattering. Proceedings of the National Academy of Sciences of the United States of America. 116 (32), 15842-15848 (2019).
- Gala de Pablo, J., Lindley, M., Hiramatsu, K., Goda, K. High-throughput Raman flow cytometry and beyond. Accounts of Chemical Research. 54 (9), 2132-2143 (2021).
- Cole, R. Live-cell imaging: the cell’s perspective. Cell Adhesion & Migration. 8 (5), 452-459 (2014).
- Kreft, M., Stenovec, M., Zorec, R. Focus-drift correction in time-lapse confocal imaging. Annals of the New York Academy of Sciences. 1048 (1), 321-330 (2005).
- Firestone, L., Cook, K., Culp, K., Talsania, N., Preston Jr, K. Comparison of autofocus methods for automated microscopy. Cytometry: The Journal of the International Society for Analytical Cytology. 12 (3), 195-206 (1991).
- Van Helvert, S., Storm, C., Friedl, P. Mechanoreciprocity in cell migration. Nature Cell Biology. 20 (1), 8-20 (2018).
- Zong, C., et al. Plasmon-enhanced stimulated Raman scattering microscopy with single-molecule detection sensitivity. Nature Communications. 10 (1), 1-11 (2019).
- Wei, L., et al. Super-multiplex vibrational imaging. Nature. 544 (7651), 465-470 (2017).
