Масштабируемый клеточный метод функциональной оценки вариантов Ube3a
Summary
Был разработан простой и масштабируемый метод оценки функциональной значимости вариантов миссенса в Ube3a, гене, потеря и усиление функции которого связаны как с синдромом Ангельмана, так и с расстройством аутистического спектра.
Abstract
Более широкое использование секвенирования в медицине выявило миллионы вариантов кодирования в геноме человека. Многие из этих вариантов встречаются в генах, связанных с нарушениями нервного развития, но функциональное значение подавляющего большинства вариантов остается неизвестным. Настоящий протокол описывает изучение вариантов Ube3a, гена, который кодирует убиквитин-лигазу E3, связанную как с аутизмом, так и с синдромом Ангельмана. Дублирование или трипликация Ube3a тесно связана с аутизмом, тогда как его удаление вызывает синдром Ангельмана. Таким образом, понимание валентности изменений активности белка UBE3A важно для клинических исходов. Здесь описан быстрый клеточный метод, который связывает варианты Ube3a с репортером пути Wnt. Этот простой анализ является масштабируемым и может быть использован для определения валентности и величины изменений активности в любом варианте Ube3a . Кроме того, возможность этого метода позволяет генерировать богатство структурно-функциональной информации, которая может быть использована для получения глубокого понимания ферментативных механизмов UBE3A.
Introduction
Последние технологические достижения сделали секвенирование экзомов и геномов рутинным в клинических условиях 1,2. Это привело к открытию большого количества генетических вариантов, в том числе миллионов ошибочных вариантов, которые обычно изменяют одну аминокислоту в белке. Понимание функциональной значимости этих вариантов остается проблемой, и только небольшая часть (~ 2%) известных вариантов промахов имеет клиническую интерпретацию 1,3.
Ярким примером этой проблемы является Ube3a, ген, который кодирует убиквитин-лигазу E3, которая нацелена на белки субстрата для деградации4. Ube3a находится в хромосоме 15q11-13 и экспрессируется исключительно из унаследованного матерью аллеля 5,6,7. Наблюдения генетики заболевания убедительно свидетельствуют о том, что недостаточная или чрезмерная активность фермента UBE3A вызывает отчетливые нарушения развития нервной системы. Делеция материнской хромосомы 15q11-13 вызывает синдром Ангельмана (AS)8, расстройство, характеризующееся тяжелой умственной отсталостью, двигательными нарушениями, судорогами, счастливым поведением с частой улыбкой и дисморфическими чертами лица 8,9,10. Напротив, дупликация или трипликация материнской хромосомы 15q11-13 вызывает синдром Dup15q, гетерогенное состояние, признанное одной из наиболее распространенных синдромных форм аутизма 11,12,13. Кроме того, существуют сотни вариантов промахов, идентифицированных в Ube3a, большинство из которых считаются вариантами неопределенной значимости (VUS), поскольку их функциональное и клиническое значение неизвестно. Таким образом, существует значительный интерес к разработке методов, которые могут эмпирически оценить варианты Ube3a, чтобы определить, способствуют ли они заболеванию нервного развития.
Фермент UBE3A принадлежит к семейству доменов HECT (гомологичному E6-AP C-terminus) убиквитиновых лигажей E3, которые все обладают одноименным доменом HECT, который содержит биохимический механизм, необходимый для принятия активированного убиквитина из ферментов E2 и переноса его в субстратные белки14. Исторически сложилось так, что характеристика ферментов E3 основывалась на восстановленных системах in vitro, которые требуют ансамбля очищенных белков 4,15,16. Такие методы медленны и трудоемки и не поддаются оценке активности большого количества вариантов. В предыдущей работе было идентифицировано, что UBE3A активирует путь Wnt в клетках HEK293T путем модуляции функции протеасомы для замедления деградации β-катенина17. Это понимание позволяет использовать репортеры путей Wnt в качестве эффективного и быстрого метода для идентификации вариантов Ube3a18 как потери, так и усиления функции. В приведенном ниже протоколе подробно описан метод генерации вариантов Ube3a, а также репортер на основе люциферазы для оценки изменений активности вариантов Ube3a.
Protocol
Representative Results
Discussion
Протокол, описанный здесь, обеспечивает эффективный и масштабируемый метод оценки ферментативной активности вариантов Ube3a. Есть несколько технических деталей, которые требуют тщательного рассмотрения при использовании этого анализа. Одним из соображений является выбор плазмид …
Divulgazioni
The authors have nothing to disclose.
Acknowledgements
Эта работа была поддержана премией Фонда Саймонса «Мост к независимости» (SFARI Award #387972; J.J.Y.), премия NARSAD Young Investigator Award от Фонда исследований мозга и поведения (J.J.Y.), исследовательская стипендия от Фонда Альфреда. Слоуна (J.J.Y.) и исследовательские гранты от Фонда синдрома Ангельмана (J.J.Y.), Фонда Уайтхолла (J.J.Y.) и NIMH (R01MH122786; Д.Ж.Ю.).
Materials
| 0.05% Trypsin-EDTA (1x), phenol red | Gibco | 25300-054 | |
| 1 Kb DNA ladder | Lambda Biotech | M108-S | |
| 100 bp DNA Ladder | Lambda Biotech | M107 | |
| 10x Buffer for T4 DNA Ligase with 10 mM ATP | New England BioLabs | B0202A | |
| 5x Phusion HF Reaction Buffer | New England BioLabs | B0518S | |
| Antibiotic-Antimycotic Solution | Corning | 30004CI | |
| Black/White Isoplate-96 Black Frame White Well plate | PerkinElmer | 6005030 | |
| Carbenicillin Disodium Salt | Midwest Scientific | KCC46000-5 | |
| Countess cell counting chamber slides | Invitrogen by Thermo Fisher Scientific | C10283 | |
| Countess II Automated Cell Counter | life technologies | Cell counting machine | |
| Custom DNA oligos | Integrated DNA Technologies (IDT) | ||
| Deoxynucleotide (dNTP) Solution Mix | New England BioLabs | N0447S | |
| DMEM, high glucose, GlutaMAX Supplement, pyruvate | Gibco | 10569044 | Basal medium for supporting the growth of HEK293T cell line |
| DPBS (1x) | Gibco | 14190-136 | |
| Dual-Luciferase Reporter Assay System | Promega | E1910 | |
| EcoRI-HF | New England BioLabs | R3101S | Restriction enzyme |
| Fetal Bovine Serum, qualified, heat inactivated | Gibco | 16140071 | Fetal bovine serum |
| Fisherbrand Surface Treated Tissue Culture Dishes | Fisherbrand | FB012924 | |
| FuGENE 6 Transfection Reagent | Promega | E2691 | |
| Gel Loading Dye Purple (6x) | New England BioLabs | B7024A | |
| HEK293T cells | ATCC | CRL-3216 | |
| High Efficiency ig 10B Chemically Competent Cells | Intact Genomics | 1011-12 | E. coli DH10B cells |
| HiSpeed Plasmid Midi Kit | Qiagen | 12643 | Midi prep |
| pCIG2 plasmid | |||
| pGL3 BAR plasmid | |||
| Phusion HF DNA Polymerase | New England BioLabs | M0530L | DNA polymerase |
| ProFlex 3 x 32 well PCR System | Applied biosystems by life technologies | Thermocycler | |
| pTK Renilla plasmid | |||
| QIAprep Spin Miniprep Kit (250) | Qiagen | 27106 | Mini prep |
| QIAquick Gel Extraction Kit (250) | Qiagen | 28706 | Gel purification |
| QIAquick PCR Purification Kit (250) | Qiagen | 28106 | PCR purification |
| rCutSmart Buffer | New England BioLabs | B6004S | |
| SacI-HF | New England BioLabs | R3156S | Restriction enzyme |
| Synergy HTX Multi-Mode Reader | BioTek | Plate reader runs Gen5 software v3.08 (BioTek) | |
| T4 DNA Ligase | New England BioLabs | M0202L | Ligase |
| TAE Buffer, Tris-Acetate-EDTA, 50x Solution, Electrophoresis | Fisher Scientific | BP13324 | |
| Tissue Culture Plate 96 wells, Flat Bottom | Fisherbrand | FB012931 | |
| UltraPure Ethidium Bromide Solution | Invitrogen by Thermo Fisher Scientific | 15585011 | |
| XmaI | New England BioLabs | R0180S | Restriction enzyme |
Riferimenti
- Landrum, M. J., et al. ClinVar: Public archive of relationships among sequence variation and human phenotype. Nucleic Acids Research. 42, 980-985 (2014).
- Lek, M., et al. Analysis of protein-coding genetic variation in 60,706 humans. Nature. 536 (7616), 285-291 (2016).
- Starita, L. M., et al. Variant interpretation: Functional assays to the rescue. American Journal of Human Genetics. 101 (3), 315-325 (2017).
- Scheffner, M., Huibregtse, J. M., Vierstra, R. D., Howley, P. M. The HPV-16 E6 and E6-AP complex functions as a ubiquitin-protein ligase in the ubiquitination of p53. Cell. 75 (3), 495-505 (1993).
- Albrecht, U., et al. Imprinted expression of the murine Angelman syndrome gene, Ube3a, in hippocampal and Purkinje neurons. Nature Genetics. 17 (1), 75-78 (1997).
- Rougeulle, C., Glatt, H., Lalande, M. The Angelman syndrome candidate gene, UBE3A/E6-AP, is imprinted in brain. Nature Genetics. 17 (1), 14-15 (1997).
- Vu, T. H., Hoffman, A. R. Imprinting of the Angelman syndrome gene, UBE3A, is restricted to brain. Nature Genetics. 17 (1), 12-13 (1997).
- Kishino, T., Lalande, M., Wagstaff, J. UBE3A/E6-AP mutations cause Angelman syndrome. Nature Genetics. 15 (1), 70-73 (1997).
- Jiang, Y. H., et al. Mutation of the Angelman ubiquitin ligase in mice causes increased cytoplasmic p53 and deficits of contextual learning and long-term potentiation. Neuron. 21 (4), 799-811 (1998).
- Mabb, A. M., Judson, M. C., Zylka, M. J., Philpot, B. D. Angelman syndrome: Insights into genomic imprinting and neurodevelopmental phenotypes. Trends in Neuroscience. 34 (6), 293-303 (2011).
- Hogart, A., Wu, D., LaSalle, J. M., Schanen, N. C. The comorbidity of autism with the genomic disorders of chromosome 15q11.2-q13. Neurobiology of Disease. 38 (2), 181-191 (2010).
- Urraca, N., et al. The interstitial duplication 15q11.2-q13 syndrome includes autism, mild facial anomalies and a characteristic EEG signature. Autism Research. 6 (4), 268-279 (2013).
- de la Torre-Ubieta, L., Won, H., Stein, J. L., Geschwind, D. H. Advancing the understanding of autism disease mechanisms through genetics. Nature Medicine. 22 (4), 345-361 (2016).
- Scheffner, M., Staub, O. HECT E3s and human disease. BMC Biochemistry. 8, (2007).
- Cooper, E. M., Hudson, A. W., Amos, J., Wagstaff, J., Howley, P. M. Biochemical analysis of Angelman syndrome-associated mutations in the E3 ubiquitin ligase E6-associated protein. Journal of Biological Chemistry. 279 (39), 41208-41217 (2004).
- Yi, J. J., Barnes, A. P., Hand, R., Polleux, F., Ehlers, M. D. TGF-beta signaling specifies axons during brain development. Cell. 142 (1), 144-157 (2010).
- Yi, J. J., et al. The autism-linked UBE3A T485A mutant E3 ubiquitin ligase activates the Wnt/beta-catenin pathway by inhibiting the proteasome. Journal of Biological Chemistry. 292 (30), 12503-12515 (2017).
- Weston, K. P., et al. Identification of disease-linked hyperactivating mutations in UBE3A through large-scale functional variant analysis. Nature Communications. 12 (1), 6809 (2021).
- Hand, R., Polleux, F. Neurogenin2 regulates the initial axon guidance of cortical pyramidal neurons projecting medially to the corpus callosum. Neural Development. 6, 30 (2011).
- Karginov, A. V., Ding, F., Kota, P., Dokholyan, N. V., Hahn, K. M. Engineered allosteric activation of kinases in living cells. Nature Biotechnology. 28 (7), 743-747 (2010).
- Biechele, T. L., Moon, R. T. Assaying beta-catenin/TCF transcription with beta-catenin/TCF transcription-based reporter constructs. Methods in Molecular Biology. , 99-110 (2008).
- Yi, J. J., et al. An Autism-linked mutation disables phosphorylation control of UBE3A. Cell. 162 (4), 795-807 (2015).
- Kuhnle, S., et al. Angelman syndrome-associated point mutations in the Zn(2+)-binding N-terminal (AZUL) domain of UBE3A ubiquitin ligase inhibit binding to the proteasome. Journal of Biological Chemistry. 293 (47), 18387-18399 (2018).
- Yamamoto, Y., Huibregtse, J. M., Howley, P. M. The human E6-AP gene (UBE3A) encodes three potential protein isoforms generated by differential splicing. Genomics. 41 (2), 263-266 (1997).
- Avagliano Trezza, R., et al. Loss of nuclear UBE3A causes electrophysiological and behavioral deficits in mice and is associated with Angelman syndrome. Nature Neuroscience. 22 (8), 1235-1247 (2019).
- Bossuyt, S. N. V., et al. Loss of nuclear UBE3A activity is the predominant cause of Angelman syndrome in individuals carrying UBE3A missense mutations. Human Molecular Genetics. 30 (6), 430-442 (2021).
