Uzun Menzilli Fiber Hizalamalı Mikromühendislik 3D Kollajen Hidrojelleri
Summary
Bu protokol, lifleri bir 3D kollajen hidrojel (kalınlığı <250 μm) hizalamak için uzatma gerinim (germe) oluşturmak için sıvı akış yönü boyunca değişen geometriye sahip bir mikroakışkan kanalın kullanımını göstermektedir. Ortaya çıkan hizalama birkaç milimetre boyunca uzanır ve uzatma gerinim hızından etkilenir.
Abstract
Hizalanmış kollajen I (COL1) lifleri tümör hücresi motilitesine rehberlik eder, endotel hücre morfolojisini etkiler, kök hücre farklılaşmasını kontrol eder ve kalp ve kas-iskelet sistemi dokularının ayırt edici özelliğidir. İn vitro hizalanmış mikro ortamlara hücre tepkisini incelemek için, manyetik, mekanik, hücre tabanlı ve mikroakışkan yöntemler de dahil olmak üzere tanımlanmış fiber hizalamasına sahip COL1 matrisleri üretmek için çeşitli protokoller geliştirilmiştir. Bunlardan mikroakışkan yaklaşımlar, sıvı akışları ve hücresel mikro çevre üzerinde doğru kontrol gibi gelişmiş yetenekler sunar. Bununla birlikte, gelişmiş in vitro kültür platformları için hizalanmış COL1 matrisleri oluşturmaya yönelik mikroakışkan yaklaşımlar, 500 μm’den daha az mesafelere yayılan ve 3D hücre kültürü uygulamalarına elverişli olmayan COL1 liflerinin ince “paspasları” (<40 μm kalınlığında) ile sınırlandırılmıştır. Burada, mikroakışkan bir cihazda tanımlanmış fiber hizalamasının milimetre ölçekli bölgelerine sahip 3D COL1 matrislerini (130-250 μm kalınlığında) üretmek için bir protokol sunuyoruz. Bu platform, hücre kültürü için mikro mühendislik matrisine doğrudan erişim sağlayarak yapılandırılmış doku mikro ortamlarını modellemek için gelişmiş hücre kültürü yetenekleri sağlar.
Introduction
Hücreler, hücre dışı matris (ECM) adı verilen karmaşık bir 3D fibröz ağda bulunur ve bunların büyük kısmı yapısal protein kollajen tip I (COL1)1,2’den oluşur. ECM’nin biyofiziksel özellikleri, hücrelere rehberlik ipuçları sağlar ve buna cevaben, hücreler ECM mikromimarisiniyeniden şekillendirir 3,4,5. Bu karşılıklı hücre-matriks etkileşimleri,tümör ortamında anjiyogenezi ve hücre invazyonunu teşvik eden hizalanmış COL1 lif alanları6’ya yol açabilir 7,8,9 ve hücre morfolojisini10,11,12, polarizasyon 13 ve farklılaşma 14’ü etkiler. Hizalanmış kollajen lifleri ayrıca yara iyileşmesini destekler 15, doku gelişiminde önemli bir rol oynar16 ve uzun menzilli hücre iletişimine katkıda bulunur17,18. Bu nedenle, yerel COL1 fiber mikromimarisini in vitro olarak çoğaltmak, hizalanmış mikro ortamlara hücre tepkilerini incelemek için yapılandırılmış modeller geliştirmeye yönelik önemli bir adımdır.
Mikroakışkan hücre kültürü sistemleri, mikrofizyolojik sistemler (MPS) geliştirmek için tercih edilen bir teknoloji olarak kurulmuştur19,20,21,22,23. Uygun mikro ölçekli ölçeklendirme etkilerinden yararlanan bu sistemler, sıvı akışları üzerinde hassas kontrol sağlar, mekanik kuvvetlerin kontrollü bir şekilde kullanılmasını destekler ve bir mikrokanal 21,24,25,26,27 içindeki biyokimyasal mikro ortamı tanımlar. MPS platformları, dokuya özgü mikro ortamları modellemek ve çoklu organ etkileşimlerini incelemek için kullanılmıştır28. Aynı zamanda, hidrojeller, in vivo29,30 gözlemlenen ECM’nin 3D mekaniğini ve biyolojik etkisini özetlemek için yaygın olarak araştırılmıştır. 3D kültürün mikroakışkan platformlarla entegrasyonuna giderek artan bir vurgu ile, çok sayıda yaklaşım COL1 hidrojellerini mikroakışkan cihazlarda birleştirebilir31,32,33. Bununla birlikte, COL1 hidrojellerini mikroakışkan kanallarda hizalama yöntemleri, <1 mm genişliğindeki kanallarda ince 2D "paspaslar" (<40 μm kalınlığında) ile sınırlandırılmıştır ve hizalanmış 3D mikro ortamlarda hücre tepkilerini modellemek için sınırlı potansiyel sunar31,34,35,36.
Mikroakışkan bir sistemde hizalanmış 3D COL1 hidrojelleri elde etmek için, kendiliğinden monte edilen bir COL1 çözeltisi yerel uzatma akışlarına maruz kaldığında (akış yönünde hız değişimi), ortaya çıkan COL1 hidrojellerinin, yaşadıkları uzatma gerinim oranının büyüklüğü ile doğru orantılı bir derece lif hizalaması gösterdiği gösterilmiştir37, 38. Bu protokoldeki mikrokanal tasarımı iki şekilde benzersizdir; Birincisi, segmentli tasarım COL1 çözümüne yerel uzatma gerinimi getirir ve ikincisi, “iki parçalı” yapısı, kullanıcının COL1 liflerini hizalamasına ve daha sonra hizalanmış liflere açık bir biçimde doğrudan erişmek için kanalı sökmesine izin verir. Bu yaklaşım, sıralı COL1 matrislerine sahip mikrofizyolojik sistemler geliştiren modüler mikroakışkan platformlar geliştirmek için de benimsenebilir. Aşağıdaki protokol, parçalı mikro kanalların üretilmesi sürecini açıklamakta ve sığır atelo COL1’i hizalamak için kanalların kullanımını detaylandırmaktadır. Bu protokol aynı zamanda COL1 üzerindeki hücrelerin açık bir kuyu biçiminde kültürlenmesi için talimatlar sağlar ve modüler, manyetik bir taban katmanı kullanarak platforma işlevsellik eklemeyi tartışır.
Protocol
Representative Results
Discussion
Hizalanmış liflerle COL1 matrisleri oluşturmak için protokoller, manyetik yöntemler, mekanik gerinimin doğrudan uygulanması ve mikroakışkan teknikler kullanılarak tanımlanmıştır47. Mikroakışkan yaklaşımlar, biyokimyasal mikro çevre üzerinde hassas kontrol sağlayan iyi tanımlanmış akış ve taşıma özellikleri nedeniyle mikrofizyolojik sistemler oluşturmak için yaygın olarak kullanılmaktadır. Hizalanmış COL1 lifleri, yara iyileşmesi, tümör hücresi invazyonu ve d…
Divulgazioni
The authors have nothing to disclose.
Acknowledgements
Bu çalışma kısmen R21GM143658 ödül numarası altında Ulusal Sağlık Enstitüsü ve 2150798 hibe numarası altında Ulusal Bilim Vakfı tarafından desteklenmiştir. İçerik yalnızca yazarların sorumluluğundadır ve finansman kuruluşlarının resmi görüşlerini temsil etmek zorunda değildir.
Materials
| (3-Aminopropyl)triethoxysilane, 99% (APTES) | Sigma Aldrich | 440140-100ML | |
| 20 Gauge IT Series Angled Dispensing Tip | Jensen Global | JG-20-1.0-90 | |
| 3/16" dia. x 1/16" thick Nickel Plated Magnet | KJ Magnetics | D31 | |
| 3M (TC) 12X12-6-467MP | DigiKey | 3M9726-ND | |
| ACETONE ACS REAGENT ≥99.5% | Signa Aldrich | 179124-4L | |
| BD-20AC LABORATORY CORONA TREATER | Electro-Technic Products | 12051A | |
| Bovine Serum Albumin (BSA), Fraction V, 98%, Reagent Grade, Alfa Aesar | VWR | AAJ64100-09 | |
| Clear cast acrylic sheet | McMaster-Carr | 8560K181 | |
| Corning 100 mL Trypsin 10x, 2.5% Trypsin in HBSS [-] calcium, magnesium, phenol red, Porcine Parvovirus Tested | VWR | 45000-666 | |
| Countess II Automated Cell Counter | Thermo Fisher Scientific | AMQAX1000 | |
| CT-FIRE software | LOCI – University of Wisconsin | ||
| EGM-2 Endothelial Cell Growth Medium-2 BulletKit, (CC-3156 & CC-4176), Lonza CC-3162, 500 mL | Lonza | CC-3162 | |
| Glutaraldehyde 50% in aqueous solution, Reagent Grade, Packaging=HDPE Bottle, Size=100 mL | VWR | VWRV0875-100ML | |
| Graphtec CELITE-50 | Graphtec | CE LITE-50 | |
| HEPES (1 M) | Thermo Fisher Scientific | 15-630-080 | |
| High-Purity Silicone Rubber .010" Thick, 6" X 8" Sheet, 55A Durometer | McMaster-Carr | 87315K62 | |
| Human Umbilical Vein Endothelial cells | Thermo Fisher Scientific | C0035C | |
| Invitrogen Trypan Blue Stain (0.4%) | Thermo Fisher Scientific | T10282 | |
| Isopropanol | Fisher Scientific | A4154 | |
| Laser cutter | Full Spectrum | 20×12 H-series | |
| Microfluidics Syringe pump | New Era Syringe Pumps | NE-1002X | |
| Microman E Single Channel Pipettor, Gilson, Model M1000E | Gilson | FD10006 | |
| Molecular Probes Alexa Fluor 488 Phalloidin | Thermo Fisher Scientific | A12379 | |
| Molecular Probes Hoechst 33342, Trihydrochloride, Trihydrate | Thermo Fisher Scientific | H3570 | |
| Nutragen Bovine Atelo Collagen | Advanced BioMatrix | 5010-50ML | |
| Pbs (10x), pH 7.4 | VWR | 70011044.00 | |
| PBS pH 7.4 | Thermo Fisher Scientific | 10010049.00 | |
| Phosphate-buffered saline (PBS, 10x), with Triton X-100 | Alfa Aesar | J63521 | |
| Replacement carrier sheet for graphtec craft ROBO CC330L-20 | USCUTTER | GRPCARSHTN | |
| Restek Norm-Ject Plastic Syringe 1 mL Luer Slip | Restek | 22766.00 | |
| Silicon wafer | University wafer | 452 | |
| Sodium Hydroxide, ACS, Packaging=Poly Bottle, Size=500 g | VWR | BDH9292-500G | |
| Sylgard 184 | VWR | 102092-312 | |
| Thermo Scientific Pierce 20x PBS Tween 20 | Thermo Fisher Scientific | 28352.00 |
Riferimenti
- Frantz, C., Stewart, K. M., Weaver, V. M. The extracellular matrix at a glance. Journal of Cell Science. 123 (24), 4195-4200 (2010).
- Bosman, F. T., Stamenkovic, I. Functional structure and composition of the extracellular matrix. The Journal of Pathology. 200 (4), 423-428 (2003).
- Cox, T. R., Erler, J. T. Remodeling and homeostasis of the extracellular matrix: Implications for fibrotic diseases and cancer. Disease Models & Mechanisms. 4 (2), 165-178 (2011).
- Cross, V. L., et al. Dense type I collagen matrices that support cellular remodeling and microfabrication for studies of tumor angiogenesis and vasculogenesis in vitro. Biomaterials. 31 (33), 8596-8607 (2010).
- Lu, P., Takai, K., Weaver, V. M., Werb, Z. Extracellular matrix degradation and remodeling in development and disease. Cold Spring Harbor Perspectives in Biology. 3 (12), 005058 (2011).
- Piotrowski-Daspit, A. S., Nerger, B. A., Wolf, A. E., Sundaresan, S., Nelson, C. M. Dynamics of tissue-induced alignment of fibrous extracellular matrix. Biophysical Journal. 113 (3), 702-713 (2017).
- Provenzano, P. P., et al. Collagen reorganization at the tumor-stromal interface facilitates local invasion. BMC Medicine. 4 (1), 38 (2006).
- Provenzano, P. P., et al. Collagen density promotes mammary tumor initiation and progression. BMC Medicine. 6 (1), 11 (2008).
- Szulczewski, J. M., et al. Directional cues in the tumor microenvironment due to cell contraction against aligned collagen fibers. Acta Biomaterialia. 129, 96-109 (2021).
- Aubin, H., et al. Directed 3D cell alignment and elongation in microengineered hydrogels. Biomaterials. 31 (27), 6941-6951 (2010).
- Gruschwitz, R., et al. Alignment and cell-matrix interactions of human corneal endothelial cells on nanostructured collagen type I matrices. Investigative Ophthalmology & Visual Science. 51 (12), 6303-6310 (2010).
- Wang, W. Y., et al. Extracellular matrix alignment dictates the organization of focal adhesions and directs uniaxial cell migration. APL Bioengineering. 2 (4), 046107 (2018).
- Wang, W. Y., Lin, D., Jarman, E. H., Polacheck, W. J., Baker, B. M. Functional angiogenesis requires microenvironmental cues balancing endothelial cell migration and proliferation. Lab on a Chip. 20 (6), 1153-1166 (2020).
- Lanfer, B. The growth and differentiation of mesenchymal stem and progenitor cells cultured on aligned collagen matrices. Biomaterials. 30 (30), 5950-5958 (2009).
- Brauer, E., et al. Collagen fibrils mechanically contribute to tissue contraction in an in vitro wound healing scenario. Advanced Science. 6 (9), 1801780 (2019).
- Ingber, D. E. From mechanobiology to developmentally inspired engineering. PhilosophicalTransactions of the Royal Society B: Biological Sciences. 373 (1759), 20170323 (2018).
- Wang, H., Abhilash, A. S., Chen, C. S., Wells, R. G., Shenoy, V. B. Long-range force transmission in fibrous matrices enabled by tension-driven alignment of fibers. Biophysical Journal. 107 (11), 2592-2603 (2014).
- Reinhart-King, C. A., Dembo, M., Hammer, D. A. Cell-cell mechanical communication through compliant substrates. Biophysical Journal. 95 (12), 6044-6051 (2008).
- Ahadian, S., et al. Organ-on-a-chip platforms: A convergence of advanced materials, cells, and microscale technologies. Advanced Healthcare Materials. 7 (2), 1700506 (2018).
- Hou, X., et al. Interplay between materials and microfluidics. Nature Reviews Materials. 2 (5), 17016 (2017).
- Abhyankar, V. V., et al. A platform for assessing chemotactic migration within a spatiotemporally defined 3D microenvironment. Lab on a Chip. 8 (9), 1507-1515 (2008).
- Abhyankar, V. V., Wu, M., Koh, C. Y., Hatch, A. V. A reversibly sealed, easy access, modular (SEAM) microfluidic architecture to establish in vitro tissue interfaces. PLoS One. 11 (5), 0156341 (2016).
- Williams, M. J., et al. A low-cost, rapidly integrated debubbler (RID) module for microfluidic cell culture applications. Micromachines. 10 (6), 360 (2019).
- Hsu, M. C., et al. A miniaturized 3D printed pressure regulator (µPR) for microfluidic cell culture applications. Scientific Reports. 12, 10769 (2022).
- Huh, D., Torisawa, Y. S., Hamilton, G. A., Kim, H. J., Ingber, D. E. Microengineered physiological biomimicry: organs-on-chips. Lab on a Chip. 12 (12), 2156-2164 (2012).
- Abhyankar, V. V., Lokuta, M. A., Huttenlocher, A., Beebe, D. J. Characterization of a membrane-based gradient generator for use in cell-signaling studies. Lab on a Chip. 6 (3), 389-393 (2006).
- Hasan, M. R., et al. One-step fabrication of flexible nanotextured PDMS as a substrate for selective cell capture. Biomedical Physics & Engineering Express. 4 (2), 025015 (2018).
- Meyvantsson, I., Beebe, D. J. Cell culture models in microfluidic systems. Annual Review of Physical Chemistry. 1, 423-449 (2008).
- Ma, Y., et al. Viscoelastic cell microenvironment: Hydrogel-based strategy for recapitulating dynamic ECM mechanics. Advanced Functional Materials. 31 (24), 2100848 (2021).
- Ma, Y., et al. 3D spatiotemporal mechanical microenvironment: A hydrogel-based platform for guiding stem cell fate. Advanced Materials. 30 (49), 1705911 (2018).
- Lee, P., Lin, R., Moon, J., Lee, L. P. Microfluidic alignment of collagen fibers for in vitro cell culture. Biomedical Microdevices. 8 (1), 35-41 (2006).
- Del Amo, C., Borau, C., Movilla, N., Asín, J., García-Aznar, J. M. Quantifying 3D chemotaxis in microfluidic-based chips with step gradients of collagen hydrogel concentrations. Integrative Biology. 9 (4), 339-349 (2017).
- Shi, N., et al. A 3D, magnetically actuated, aligned collagen fiber hydrogel platform recapitulates physical microenvironment of myoblasts for enhancing myogenesis. Small Methods. 5 (6), 2100276 (2021).
- Lanfer, B., et al. Aligned fibrillar collagen matrices obtained by shear flow deposition. Biomaterials. 29 (28), 3888-3895 (2008).
- Saeidi, N., Sander, E. A., Ruberti, J. W. Dynamic shear-influenced collagen self-assembly. Biomaterials. 30 (34), 6581-6592 (2009).
- Saeidi, N., Sander, E. A., Zareian, R., Ruberti, J. W. Production of highly aligned collagen lamellae by combining shear force and thin film confinement. Acta Biomaterialia. 7 (6), 2437-2447 (2011).
- Ahmed, A., et al. Microengineered 3D collagen gels with independently tunable fiber anisotropy and directionality. Advanced Materials Technologies. 6 (4), 2001186 (2021).
- Ahmed, A., et al. Local extensional flows promote long-range fiber alignment in 3D collagen hydrogels. Biofabrication. 14 (3), 035019 (2022).
- Mansouri, M., et al. The modular µSiM reconfigured: Integration of microfluidic capabilities to study in vitro barrier tissue models under flow. Advanced Healthcare Materials. , (2022).
- Paten, J. A., et al. Flow-induced crystallization of collagen: a potentially critical mechanism in early tissue formation. ACS Nano. 10 (5), 5027-5040 (2016).
- Liu, Y., Eliceiri, K. W. Quantifying fibrillar collagen organization with curvelet transform-based tools. Journal of Visualized Experiments. (165), e61931 (2020).
- Bredfeldt, J. S., et al. Automated quantification of aligned collagen for human breast carcinoma prognosis. Journal of Pathology Informatics. 5 (1), 28 (2014).
- Bredfeldt, J. S., et al. Computational segmentation of collagen fibers from second-harmonic generation images of breast cancer. Journal of Biomedical Optics. 19 (1), 016007 (2014).
- Carey, S. P., et al. Local extracellular matrix alignment directs cellular protrusion dynamics and migration through Rac1 and FAK. Integrative Biology. 8 (8), 821-835 (2016).
- Carey, S. P., Kraning-Rush, C. M., Williams, R. M., Reinhart-King, C. A. Biophysical control of invasive tumor cell behavior by extracellular matrix microarchitecture. Biomaterials. 33 (16), 4157-4165 (2012).
- Ahmed, A., et al. Engineering fiber anisotropy within natural collagen hydrogels. AmericanJournal of Physiology-Cell Physiology. 320 (6), 1112-1124 (2021).
- Mohammadi, H., Janmey, P. A., McCulloch, C. A. Lateral boundary mechanosensing by adherent cells in a collagen gel system. Biomaterials. 35 (4), 1138-1149 (2014).
