바이오마커 프로가스트린 방출 펩타이드(ProGRP)로 예시된 건조 혈청 샘플에서 저농도 바이오마커를 측정하기 위한 프로토콜이 제시됩니다. 항체 코팅된 마그네틱 비드는 프로테오타입 ProGRP 펩타이드의 선택적 클린업 및 농축에 사용됩니다. 포획된 펩타이드는 이후 액체 크로마토그래피-탠덤 질량 분석법으로 분석됩니다.
이 논문은 건조된 샘플에서 소농도 단백질의 효율적인 샘플 클린업을 위한 자세한 설명이 포함된 프로토콜을 제시합니다. 이는 단백질 분해 펩타이드 친화성 캡처 및 액체 크로마토그래피 탠덤 질량분석법(LC-MS/MS) 측정 전에 비드 기반 단백질 분해를 사용하여 수행됩니다. 이 절차는 종이 카드를 사용하는 기존의 건조 검체(예: 건조 혈반[DBS] 및 건조 혈청 기반[DSS])와 체적 흡수 미세 시료 채취(VAMS)와 같은 새로운 시료 채취 방법으로 수집된 시료 모두에 적용할 수 있습니다. 이 절차를 설명하는 것 외에도 트립신 비드와 항체 코팅 비드 모두의 제조가 이 작업에서 단계별 방식으로 제시됩니다. 제시된 절차의 장점은 비드를 사용한 시간 효율적인 단백질 가수분해와 펩타이드 친화성 캡처를 사용한 선택적 강력한 클린업입니다. 현재 절차는 건조 혈청(DSS 및 VAMS 모두)에서 저농도 소세포 폐암(SCLC) 바이오마커인 프로가스트린 방출 펩타이드(ProGRP)의 결정을 설명합니다. 비드 준비에 대한 자세한 절차를 통해 새로운 응용 분야 또는 다른 실험실에서 워크플로우를 더 쉽게 구현할 수 있습니다. 결과는 샘플링 재료에 따라 달라질 수 있음이 입증되었습니다. 현재 프로젝트의 경우 DSS에 비해 VAMS를 사용하여 수집된 샘플에서 더 높은 신호 강도가 나타났습니다.
마이크로샘플링은 1913년 Ivar Bang이 DBS의 포도당 모니터링을 설명한 이래로 100년 이상 사용되어 왔습니다1. Guthrie와 Susi가 1963년 신생아의 페닐알라닌 측정을 위해 DBS를 도입한 후2, 이 기술은 점점 더 널리 보급되었습니다. 단백질의 샘플링 및 저장을 위한 DBS의 첫 번째 보고는 1970년대 초3,4에 이루어졌으며, 10년 후인 1980년대에 DBS에서 단백질을 측정하기 위한 질량분석법(MS)에 대한 첫 번째 보고를 발견했습니다5. 이러한 초기 도입에도 불구하고 세기가 바뀔 때까지 DBS 및 기타 마이크로 샘플링 기술에서 단백질의 MS 측정이 더 널리 보급되었습니다.
임상 적 맥락에서, 질병의 진단 및 추적 관찰뿐만 아니라 치료 모니터링 및 도핑 목적으로 단백질을 결정하는 것이 중요합니다. 소량의 건조된 샘플에서 MS에 의한 단백질 분석물의 표적 측정은 여전히 어려운 일이며, 종종 분석 전에 광범위한 샘플 준비가 필요합니다.
MS에 의한 단백질의 표적 정량 측정은 일반적으로 상향식 접근법을 적용하여 분석 전에 단백질을 펩타이드로 분해하여 수행됩니다. 이 절차는 무수히 많은 펩타이드를 생성하므로 소화된 생물학적 샘플의 직접 분석이 어렵습니다. 이를 회피하는 방법은 분해전후에 MS 분석에 앞서 선택적 친화성 클린업 단계를 적용하는 것이다 6,7,8. 이러한 방식으로, 관심 단백질(또는 분해 후 친화성 포획 단계가 수행되는 경우 이의 단백질형 펩타이드)을 분석 전에 샘플 매트릭스에서 선택적으로 분리하여 검출 한계를 낮춥니다9.
DBS 카드를 사용한 마이크로샘플링은 기존의 혈액 샘플에 비해 적은 샘플 부피, 덜 침습적인 샘플링 및 향상된 저장 안정성을 포함하여 특정 이점이 있습니다. 그러나 시료 매트릭스는 다르며 분석에 다른 문제가 발생할 수 있습니다(예: 건조 시료 매트릭스 대 액체 시료 매트릭스 및 모세혈관 대 혈청 또는 혈장)10,11. DBSs에서 관찰되는 또 다른 문제는 소위 헤마토크릿 효과(hematocrit effect)인데, 여기서 혈액 헤마토크릿은 분석을 위해 추가로 처리된 샘플 부피에 영향을 미치며, 따라서 분석에서 개인간 변동성을 도입한다12. 201413년에 도입된 VAMS와 같은 최신 마이크로샘플링 장치는 혈액 방울 대신 고정된 양의 혈액을 수집하여 이 문제를 해결합니다.
이 프로토콜은 건조된 미세 샘플에서 저농도 바이오마커 분석을 위한 설정을 설명합니다. 용출 후, 건조된 샘플은 분해되고, 이어서, 단백질형 펩티드는 펩티드 친화성 포획에 의해 분리된다. 모델 분석물은 SCLC 바이오마커 ProGRP입니다. ProGRP는 전혈에서 확실하게 측정할 수 없기 때문에 혈청을 샘플 매트릭스로 사용했습니다. VAMS를 사용하여 수집된 DSS 및 혈청 샘플의 대표적인 결과가 표시됩니다.
설명된 프로토콜에는 트립신 비드 및 항체 코팅 마그네틱 비드의 준비를 포함하여 건조된 미세 샘플(DSS 및 VAMS)에서 저농도 바이오마커 분석에서 몇 가지 중요한 단계를 수행하는 방법에 대한 정보가 포함되어 있습니다. 이전 경험에 비추어 볼 때, 우리는 항체의 배향을 개선하기 위해 비드 고정화 전에 항상 항체를 산으로 처리한다15.
이 절차에서 중요한 단계 중 하나는 가장 적합한 마이크로샘플링 형식을 선택하는 것입니다. 첫째, 문제의 분석 물을 전혈에서 측정 할 수 있는지 또는 농도가 혈액 세포의 영향을 받아 혈청 또는 혈장에서 측정해야하는지 고려해야합니다 (모델 분석 물, ProGRP의 경우).
종이 및 폴리머 기반 접근 방식에는 장점과 한계가 있습니다. ProGRP의 경우 VAMS는 샘플러에서 추출한 후 분석물 회수와 관련하여 분명한 이점을 제공합니다. 그러나 이것은 아마도 DSS 샘플에 대해 다른 추출 용액을 사용하여 최적화될 수 있습니다. 그럼에도 불구하고 분석물과 샘플링 물질 간의 이러한 잠재적 상호 작용은 분석 변동을 증가시키고 검출 한계를 높일 수 있으므로 고려하는 것이 중요합니다. 사용된 IS는 SIL 펩타이드이고 소화 후 처음 첨가되므로 IS는 분해 후 단계(예: 친화성 추출 및 LC-MS/MS 분석)를 보정합니다. DSS/VAMS 및 분해 단계에서 추출하는 경우 IS 보정이 불가능합니다.
절차에는 두 가지 유형의 비드가 사용됩니다: 샘플러에서 혈청 샘플을 추출한 후 소화를 위한 트립신 비드와 소화 후 단백질 형성 펩타이드를 포획하기 위한 항체 코팅된 자기 비드. 트립신 비드를 사용하는 주된 이유는 소화 속도를 높이는 것 외에도 친화성 포획 중에 샘플의 잔류 트립신 활성을 최소화하기 위함입니다. 이는 친화성 포획 동안 mAb의 트립신 단백질 분해를 피하는 데 중요합니다.
아가로스 비드는 트립신 비드의 제조에 사용되었고, 자성 비드는 항체 코팅 비드의 제조에 사용되었습니다. 아가로스 비드는 자성 비드보다 저렴하지만 용액으로부터 비드를 분리하려면 원심분리가 필요하다는 한계가 있습니다. 이것은 비드와 상청액의 분리를 자기 비드를 사용할 때보다 덜 효율적으로 만듭니다. 또한, 워크플로우의 자동화는 아가로스 비드를 사용하는 것이 어렵다. 그러나 마그네틱 NHS 활성화 비드를 사용할 수 있으며 보다 능률적이고 자동화된 시료 전처리 워크플로우에 사용할 수 있습니다.
마이크로샘플링은 약물과 바이오마커 모두의 바이오분석에서 중요한 추세입니다. 현재 접근 방식의 한 가지 과제는 제한된 양의 시료량(10μL)이며, 이는 ProGRP(pg/mL-낮은 ng/mL 수준)와 같은 매우 낮은 존재비의 분석물을 측정하는 데 특히 중요할 수 있습니다. 그러나 이러한 문제는 최첨단 분석 장비를 사용하여 우회할 수 있습니다. 이러한 저농도 분석물질의 경우 시료 전처리의 선택이 매우 중요하며, 항체 기반 친화성 캡처를 통한 선택적 시료 세척이 가장 자주 필요합니다. 펩타이드 포획은 단백질 포획(동일한 항체 사용)보다 더 깨끗한 추출물과 낮은 검출 한계를 제공하는 것으로 나타났기 때문에14, 본 방법은 마이크로샘플링과 함께 이 접근법에 초점을 맞춥니다. 펩타이드 포획 접근법의 또 다른 장점은 IS SIL 펩타이드가 친화성 포획 단계도 보정한다는 것입니다.
이 연구에서는 단백질을 표적으로 하는 항체를 펩타이드 포획에 사용했습니다. 이는 단백질을 표적으로 하는 기성 항체의 가용성이 단백질형 펩타이드를 표적으로 하는 기성 항체보다 높기 때문에 이점입니다. 그러나, 항-단백질 항체가 프로테오타입 펩티드를 효율적으로 포획하기 위해서는 단백질 소화 후 에피토프가 손상되지 않아야 합니다. 또한, 많은 항체의 경우, 정확한 에피토프가 알려져 있지 않아 항 단백질 항체를 찾는 것이 지루합니다. 이는 펩티드 포획에 적용할 수 있는 이용 가능한 항단백질 항체의 수를 제한한다. 설명된 절차는 혈청을 매트릭스로, ProGRP를 표적 분석물로 사용하여 시연됩니다. 이 절차는 다른 매트릭스 및 다른 표적 분석물에 적용할 수 있도록 고안되었습니다. 단백질형 펩티드의 친화성 포획을 위해 시판되는 항-단백질 항체를 사용하는 대신에, 또한 맞춤형 항-펩티드 항체를 사용할 수 있다. 단백질 포획과 비교한 펩타이드 포획의 클린업 효율은 그림 5에 나와 있습니다. 트립신 비드의 제조에 사용되는 아가로스 비드를 자성 비드로 교환함으로써, 절차는 또한 시장에 나와있는 로봇 샘플 준비 워크 스테이션과 호환되어야합니다.
The authors have nothing to disclose.
노르웨이 라듐 병원(노르웨이 오슬로 대학 병원)의 Elisabeth Paus 교수가 ProGRP 표준물질과 항-ProGRP 단일클론항체 M18을 제공한 것에 대해 큰 감사를 드립니다. 출판비는 Apoteker Harald Conrad Thaulows legat의 보조금으로 충당되었습니다. Trine Grønhaug Halvorsen과 Léon Reubsaet은 노르웨이 INFRASTRUKTUR 연구 위원회(프로젝트 번호: 295910)가 자금을 지원하는 NAPI(National Network of Advanced Proteomics Infrastructure) 컨소시엄의 파트너입니다.
Acetic acid N-hydroxysuccinimide ester | Carbosynt (Staad, Switzerland) | FA33719 | Store in freezer below -20 °C |
ALGNQQPSWDSEDSSNF[K_13C6 _15N2] (≥ 95%) |
Innovagen (Lund, Sweden) | Not applicable | Store in freezer below -20 °C |
Ammonium bicarbonate BioUltra (≥ 99.5% ) | Sigma Aldrich (St. Louis, MO, USA) | 09830-500G | |
Aquasil C18 column, 3 µm, 50 mm x 1 mm | Thermo scientific (Waltham, MA, USA) | 77503-051030 | Analytical column compatible with 100% aqueous mobile phase |
Benzamidine (≥ 95.0% ) | Sigma Aldrich (St. Louis, MO, USA) | 12072 | Store in fridge at 2-6 °C |
Calsium chloride dihydrate (≥ 99% ) | Sigma Aldrich (St. Louis, MO, USA) | 223506-500G | |
Centrifuge 5804 | Eppendorf (Hamburg, Tyskland) | 5804000010 | |
Cloned ProGRP isoform 1 | Radium hospital, Oslo University Hospital (Oslo, Norway) | Not applicable | Store in freezer below -20 °C |
Disodium hydrogenphosphate dihydrate (pro analysis) | Sigma Aldrich (St. Louis, MO, USA) | 30435-500G | |
Disodium hydrogenphosphate dodecahydrate (pro analysis) | Merck (Darmstadt, Tyskland) | 1.06579.0500 | |
Dynabeads M-280 tosylactivated 10 mL | Invitrogen (Carlsbad, USA) | 14204 | Store in fridge at 2-6 °C |
DynaMag-2 | Invitrogen (Carlsbad, USA) | 123-21D | |
Ethanolamine (pro analysis, ≥ 99%) | Sigma Aldrich (St. Louis, MO, USA) | #02400 | |
Formic acid (≥ 99% ) for LC-MS | VWR International (Radnor, PA, USA) | 84865.260 | |
FTA DMPK-C cellulose card | Whatman (Kent, UK) | WB129243 | DBS card |
HPLC vials, clear glass, 1.5 mL, 32 x 11.6 mm, Clean Pack | Nerliens Meszansky (Oslo, Norge) | LPP 11 09 0519 | |
Hulamixer sample mixer | Invitrogen (Carlsbad, USA) | 101561503016 | Sample mixer with end-over-end mixing and reciprocal rotation and vibration |
Human serum from healty blood donors | Bloodbank, Ullevål, Oslo University Hospital (Oslo, Norway) | Not applicable | Store in freezer below -20 °C |
Hydrochloric acid fuming 37% (Emsure for analysis) | Merck (Darmstadt, Tyskland) | 1.00317.1000 | |
LC-MS/MS system: Ultimate 3000 system (Autosampler, WPS-3000TRS; Micropump, LPG-3400M; Flow manager, FLM-3300, MIC, 1X2P-10P) and TSQ Quantum access. Controlled by Xcalibur 2.2 SP1.48 | Thermo scientific (Waltham, MA, USA) | Not applicable | |
LiChrosolv Acetonitrile hypergrade for LC-MS | Merck (Darmstadt, Tyskland) | 1.00029.2500 | |
LL Biotrode, Combined glass electrode | Metrohm (Herisau, Sveits) | 6.0224.100 | |
Magnetic stirrer, Type M10 | Franz Morat KG (Eisenbach, Germany) | 10236 | |
Micro inserts, glass (31 x 6 mm, 0.1 mL) | VWR International (Radnor, PA, USA) | 548-0006 | |
MilliQ integral 3 with Q-POD | Merck Millipore (Molsheim, France) | ZRXQ003T0 | For production of Type 1 water |
monoclonal antibody M18 | Radium hospital, Oslo University Hospital (Oslo, Norway) | Not applicable | Store in fridge at 2-6 °C |
Neoteryx Mitra microsampler (10 μL) 4 sampler Clamshell | Fisher Scientific (Waltham, MA, USA) | NC1382947 | |
NHS-activated sepharose beads 4 fast flow | Sigma Aldrich (St. Louis, MO, USA) | GE17-0906-01 | Agarose beads, store in fridge at 2-6 °C |
Optifit, Refill pipet tips, 10 mL | Sartorius Biohit (Helsinki, Finland) | 613-2911 | |
Optifit, Refill pipet tips, 10 μL | Sartorius Biohit (Helsinki, Finland) | 790012 | |
Optifit, Refill pipet tips, 1,000 μL | Sartorius Biohit (Helsinki, Finland) | 791002 | |
Optifit, Refill pipet tips, 200 μL | Sartorius Biohit (Helsinki, Finland) | 790202 | |
pH glass electrode | Metrohm (Herisau, Sveits) | 6.0233.100 | |
pH meter 744 | Metrohm (Herisau, Sveits) | 8.744.1003 | |
Pipet 10 mL | Sartorius Biohit (Helsinki, Finland) | 725090 | |
Pipet m10 µL | Sartorius Biohit (Helsinki, Finland) | 725020 | |
Pipet m100 µL | Sartorius Biohit (Helsinki, Finland) | 725050 | |
Pipet m1,000 µL | Sartorius Biohit (Helsinki, Finland) | 725070 | |
Pipet m20 µL | Sartorius Biohit (Helsinki, Finland) | 725030 | |
Potassium chloride (KCl ≥ 99.9%) | Sigma Aldrich (St. Louis, MO, USA) | P-3911 | |
Potassium dihydrogenphosphate (pro analysis) | Merck (Darmstadt, Tyskland) | 1.04873.0250 | |
Protein LoBind Eppendorf tube 0.5 mL | Eppendorf (Hamburg, Tyskland) | 525-0133 (0030 108.094) | |
Protein LoBind Eppendorf tube 1.5 mL | Eppendorf (Hamburg, Tyskland) | 525-0132 (0030 108.116) | |
Protein LoBind Eppendorf tube 2.0 mL | Eppendorf (Hamburg, Tyskland) | 525-0134 (0030 108.450) | |
Protein LoBind Eppendorf tube 5.0 mL | Eppendorf (Hamburg, Tyskland) | 525-0792 (0030108.302) | |
Scissors | Sigma Aldrich (St. Louis, MO, USA) | Z186716-1EA | |
Sodium azide (BioUltra; ≥ 99.5% ) | Sigma Aldrich (St. Louis, MO, USA) | 71289-5G | |
Sodium chloride (for analysis) | Merck (Darmstadt, Tyskland) | 1.06404.1000 | |
Sodium dihydrogenphosphate monohydrate (pro analysis) | Merck (Darmstadt, Tyskland) | 1.06346.0500 | |
Sodium hydroxide (AnalaR NORMAPUR) | VWR International (Radnor, PA, USA) | 28244.295 | |
Sodium tetraborate decahydrate (≥ 99. %) | Sigma Aldrich (St. Louis, MO, USA) | S9640-500G | |
Spectrafuge Mini Centrifuge | LABNET International (Edison, NJ, USA) | C1301 | |
Stirring magnet, 25 mm x 6 mm Ø, circular | Leybold (Cologne, Germany) | 666 851 | |
Stuart Scientific SA8 vortex mixer | Stuart (Staffordshire, UK) | Z648531-1EA | |
SuperClear centrifuge tubes (15 mL) | VWR International (Radnor, PA, USA) | 525-0150 | |
SuperClear centrifuge tubes (50 mL) | VWR International (Radnor, PA, USA) | 525-0155 | |
Thermomixer comfort 1.5 mL | Eppendorf (Hamburg, Tyskland) | 53,55,27,831 | Temperature controlled mixer |
Trizma base (reagent grade, ≥ 99.0 %) | Sigma Aldrich (St. Louis, MO, USA) | T6066 | Tris(hydroxymethyl)aminometan (tris) |
Trizma HCl (reagent grade, ≥ 99.0%) | Sigma Aldrich (St. Louis, MO, USA) | T3253-100G | Tris(hydroxymethyl)aminometan HCl (tris HCl) |
Trypsin (TCPK-treated from bovine pancreas, 10,000-15,000 BAEE units/mg Protein) | Sigma Aldrich (St. Louis, MO, USA) | T8802 | Store in freezer below -20 °C |
Tween 20 | Sigma Aldrich (St. Louis, MO, USA) | P7949-500ML | polysorbate 20 |
Tweezers | Sigma Aldrich (St. Louis, MO, USA) | TEM-78511-27 | |
Vial caps, white, 9 mm | Nerliens Meszansky (Oslo, Norge) | LPP 09 15 0981 | |
Mitra microsampler with VAMS (Volumetric adsorptive microsampling) technology, 10 µL, 4-sampler clamshell | Neoteryx (Torrance, CA, USA) |