neuroHuMiX是一种先进的肠道芯片模型,用于研究细菌、上皮细胞和神经元细胞在近端和代表性共培养条件下的相互作用。该模型可以揭示肠道微生物组和神经系统之间通信的分子机制。
人体被至少与人体细胞组成数量相同数量的微生物细胞定植,并且这些微生物中的大多数位于肠道中。尽管肠道微生物组和宿主之间的相互作用已被广泛研究,但肠道微生物组如何与肠道神经系统相互作用在很大程度上仍然未知。迄今为止,尚不存在用于研究肠道微生物组-神经系统相互作用的具有生理学代表性的 体 外模型。
为了填补这一空白,我们通过将诱导多能干细胞衍生的肠道神经元引入设备中,进一步开发了人微生物串扰 (HuMiX) 肠道芯片模型。由此产生的模型“neuroHuMiX”允许细菌、上皮和神经元细胞跨微流控通道共培养,由半透膜隔开。尽管分离了不同的细胞类型,但细胞可以通过可溶性因子相互交流,同时提供了单独研究每种细胞类型的机会。这种设置可以初步了解肠道微生物组如何影响肠道神经元细胞。这是研究和理解人类肠道微生物组-神经系统轴的关键第一步。
人类肠道微生物组在人类健康和疾病中起着至关重要的作用。在过去的十五年里,它已被广泛研究,现已确定其在调节健康和疾病方面的潜在作用1.据推测,导致微生物群落失衡(生态失调)的微生物组破坏与许多慢性疾病的发病机制有关,例如肥胖、炎症性肠病和结直肠癌,甚至神经退行性疾病,例如帕金森病 2,3。
尽管人类肠道微生物组与神经系统疾病有关,但目前尚不清楚肠道微生物组如何与肠道神经系统沟通并影响肠道神经系统。由于人类肠道神经系统不容易立即进行研究,因此迄今为止已将动物模型用于实验4。然而,鉴于动物模型和人类之间的明显差异5,开发模拟人类肠道的体外模型是立即感兴趣的。在此背景下,人类诱导多能干细胞 (iPSC) 领域的蓬勃发展使我们能够获得具有代表性的肠神经元 (ENs)6。iPSC 衍生的 EN 允许在体外培养模型中研究肠神经系统,例如细胞培养插入物、类器官或器官芯片 7,8。
人类-微生物串扰 (HuMiX) 模型是一种模拟人类肠道9 的肠道芯片模型。初始HuMiX模型(以下称为初始装置)容纳上皮细胞(Caco-2)和细菌细胞10,11。然而,为了研究肠道微生物组-神经系统的联系,iPSC衍生的ENs6也被引入到系统中(图1)。神经元、上皮细胞和细菌细胞的近端共培养允许单独分析不同的细胞类型,并研究模拟人类肠道环境中不同细胞类型之间的相互作用。
近年来,通过使用器官芯片(例如,肠道芯片)模型,以更具生理学代表性的方式研究器官的模型开发取得了进展。这些模型更能代表人类肠道环境,因为持续的营养供应和废物清除,以及实时监测,例如氧气水平或屏障完整性8,12。这些模型专门用于研究肠道细菌对宿主细胞的影响。然而,为了能够使用器官芯片来研究肠道微生物组和神经系统之间的相互关系,需要将神经元细胞整合到这些系统中。因此,进一步开发HuMiX和建立neuroHuMiX系统(以下简称设备)的目的是开发一种肠道芯片模型,该模型包括肠道神经元细胞与肠道上皮细胞和细菌近端共培养。
现在已经确定,人类肠道微生物组会影响宿主的健康和疾病。尽管知识表明我们的微生物组很重要,特别是在阿尔茨海默氏症或帕金森氏病等神经系统疾病中 3,13,但肠道微生物组如何与肠道神经系统相互作用,随后与大脑相互作用,在很大程度上仍然未知。
迄今为止,还没有一个代表性的模型来研究肠道微生物组和神经系统之间的相互作用。传统上,有关肠脑轴的研究是使用小鼠模型进行的 13.小鼠和人类共享 85% 的基因组序列14,但在将小鼠与人类进行比较时需要考虑显着差异。关于肠道,需要注意的是,与人类相比,小鼠完全是食草动物。因此,他们的胃肠道在长度和特征上有所不同,例如“胃排空”14。小鼠的大脑也显示出重要的差异,因此小鼠和人类之间的整体结构是不同的15。重要的是,人类的神经祖细胞周期更长15。因此,开发包括人源性细胞(包括肠道和神经元细胞)的代表性模型非常重要5。在这种情况下, 通过体外 模型开发更具可重复性的研究减少了使用动物模型的需求并提高了可重复性。
neuroHuMiX是之前的HuMiX模型9的高级版本。HuMiX是一种肠道芯片模型,允许上皮细胞和细菌细胞的近端和代表性共培养。通过分泌因子和代谢物 通过半透 膜的近端共培养和扩散,可以实现细胞间通讯。然而,为了扩大初始设备研究人类肠道环境的效用,需要引入额外的细胞类型。为了解决这个问题,随着iPSC衍生EN的引入而开发的neuroHuMiX能够实现细菌、肠上皮细胞和EN的近端共培养。由此产生的 体外 模型使我们能够解决有关人类肠道微生物组与人类神经系统相关的问题。共培养不同的细胞类型,尤其是哺乳动物细胞和细菌的共培养,存在一些挑战,包括活力丧失、粘附性差和汇合度的整体损失 16。在这里,我们已经证明,在该设备中,我们能够在同一系统中共培养三种不同的细胞类型,同时保持高细胞活力。
该方案的一个关键步骤是在接种到设备之前确保神经元细胞的汇合度 – 80%-90%的细胞汇合度和活力。由于在运行过程中无法评估细胞生长,因此在将细胞引入模型之前,确保细胞汇合且生长良好至关重要。虽然这可能是一个限制因素,但在设备内观察到的整体活力和汇合度通常很高。
该装置 通过 管道连接到蠕动泵。每个细胞室都有其特定的管路。该管路包括允许使用蠕动泵灌注介质的泵管,以及将泵管连接到设备的管路和将装置连接到流出/废液瓶的管路。设备前后均有采样口,可对流出培养基进行接种和采样。每个腔室可以连接到不同的培养基,从而为每种细胞类型提供最佳培养条件。每个腔室都可以根据介质供应的具体需求打开或关闭。在该装置中,神经元腔室在实验的大部分时间里保持关闭状态,而细菌和上皮室始终处于打开状态,这意味着它们在整个实验运行过程中都会获得新鲜的培养基。为确保介质不间断地流动,管道、连接器或设备中不得有任何空气,这一点至关重要。因此,首先让设备在启动步骤中运行几分钟是很重要的。这通常可以解决问题。如果没有,可以通过关闭流出的三通旋塞阀在短时间内关闭其他一条正在下降的管线。这会将介质重定向到带有气泡的管路,从而通过将气泡向外推过管道来解决问题。
对于任何细胞培养实验,培养基都是关键成分,每种细胞类型都有其各自的培养基。在共培养装置中,培养基不仅需要与其中生长的细胞类型兼容,还需要与共培养中的其他细胞类型兼容。对于该设备来说,这没有什么不同,这带来了额外的挑战,因为我们有三个不同的隔室,里面有三种不同的细胞类型——细菌、上皮细胞和神经元细胞。然而,我们已经证明,通过修饰细菌培养基 – 将 5% MRS 添加到具有 10% FBS 的 RPMI 1640 中 – 所有细胞类型,特别是细菌和上皮细胞,都可以在系统内成功共培养。然而,在设备中,不同的细胞类型在附近共培养,因此彼此不直接接触。尽管这不能完全代表人体肠道中细胞之间的直接接触,因此存在局限性,但近端和代表性的共培养条件是下游分析的优势。可溶性因子在不同腔室和细胞类型之间交换;因此,细胞仍在相互作用。此外,细胞类型可以单独收获和分析,这一事实使我们能够研究健康和/或患病微生物组对不同细胞类型(包括神经元细胞)的影响,从而确定/检索细胞类型特异性读数。另一个限制是,在实验运行期间无法跟踪细胞的形态,因为只能在每次实验结束时打开设备并检查细胞。
据我们所知,neuroHuMiX是第一个包含EN的肠道芯片模型。这是阐明肠道微生物群和肠道神经系统之间交流的一步。该模型允许研究细菌种类、上皮层和EN之间的相互作用。它的设计使我们能够研究不同细胞类型分泌的可溶性因子的交换及其相互影响。展望未来,重要的是不仅要有iPSC衍生的EN,还要有iPSC衍生的上皮细胞在设备内部,以便将设备转变为个性化模型。重要的是,这种个性化模型可用于测试前生元、前生元和合生元 10,11,并可能开发个性化筛选和治疗方法17。个性化的neuroHuMiX最终可以揭示人类肠道微生物组的“暗物质”及其与肠道微生物组-神经系统轴线的神经系统的相互作用,为治疗评估和干预铺平道路。
我们可以得出结论,能够拥有包括肠道神经元系统在内的肠道芯片对于研究和理解肠道微生物组-神经系统轴的相互作用至关重要。NeuroHuMiX使我们能够研究细菌物种对宿主细胞的影响,并为我们提供了一个良好的基础,以更具生理学代表性的方式进一步改进模型。
The authors have nothing to disclose.
作者要感谢 Jared Sterneckert 博士为我们提供了 K7 系的细胞。我们还要感谢长期合作者,来自亚利桑那大学的 Frederic Zenhausern 博士和 Matthew W. Barret 在工程方面的帮助。我们还要感谢 Valentina Galata 博士在设计 neuroHuMiX 示意图方面的帮助。该项目已根据欧盟地平线 2020 研究和创新计划(赠款协议 863664)获得了欧洲研究委员会 (ERC) 的资助。 图 1 部分是使用 Biorender.com 创建的。
2-Mercaptoethanol | Sigma Aldrich | 10712 | |
Aeration cannula (length: 1.10 diameter: 30 mm) | VWR (B.Braun) | BRAU4190050 | |
Agar-agar | Merck Millipore | 1.01614.1000 | |
Aluminium Crimp | Glasgerätebau Ochs | 102050 | |
Ascorbic acid | Sigma Aldrich | A4544 | |
B-27 Supplement Minus Vitamin A (50x) | Gibco | 12587-010 | |
Bacterial Cell Membrane, pore size: 1 µm | VWR (Whatman) | 515-2084 | |
Caco-2 cells | DSMZ | ACC169 | |
Cell Counter & Analyzer CASY | OMNI Life Sceince | ||
CHIR | Axon Mechem BV | CT99021 | |
Collagen I, Rat Tail | Invitrogen | A1048301 | |
Costar 6-well Clear Flat Bottom Ultra-Low Attachment Plates | Corning | 3471 | |
Difco Lactobacilli MRS Broth | BD Biosciences | 288130 | |
Discofix 3-way stopcock | B. Braun | BRAU40951111 | |
DMEM/F12, no glutamine | Thermofisher Scientific | 21331020 | |
Dulbecco's Phosphate-Buffered Saline, D-PBS | Sigma Aldrich | 14190-169 | |
Essential 6 Medium | Thermofisher Scientific | A1516401 | |
Essential 8 Medium | Thermofisher Scientific | A1517001 | |
Female Luer Lock to Barb Connector | Qosina | 11733 | |
FGF2 | R&D Systems | 233-FB | |
Fibronectin | Sigma Aldrich | F1141 | |
Foetal Bovine Serum, FBS | Thermofisher Scientific | 10500-064 | |
GDNF | PeproTech | 450-10 | |
Human Cell Membrane, pore size: 50 nm | Sigma Aldrich (GE Healthcare) | WHA111703 | |
HuMiX Gasket Collagen | Auer Precision | 216891-003 | |
HuMiX Gasket Sandwich Bottom | Auer Precision | 216891-002 | |
HuMiX Gasket Sandwich Top | Auer Precision | 216891-001 | |
iPSC | Max Planck Institute for Molecular Biomedicine | K7 line | |
L-Glutamine (200 mM) | Gibco | 25030081 | |
Laminin from Engelbreth-Holmswarm | Sigma Aldrich | L2020 | |
LDN193189 | Sigma Aldrich | SML0559 | |
Limosilactobacillus reuteri | ATCC | 23272 | |
Live/Dead BacLight Bacterial Viability kit | Thermofisher Scientific | L7012 | |
Male Luer with Spin Lock to Barb | Qosina | 11735 | |
Marprene tubing (0.8 mm x 1.6 mm) | Watson-Marlow | 902.0008.J16 | |
Matrigel hESC-qualified matrix | Corning | 354277 | |
Mucin, from porcine stomach | Sigma Aldrich | T3924 | |
N2 Supplement (100x) | Gibco | 17502048 | |
NEAA | Thermofisher Scientific | 11140050 | |
Needle (length: 120 mm; diameter: 0.80 mm) | B.Braun (color code: green) | 466 5643 | |
Needle (length: 40 mm; diameter: 0.70 mm) | Henke Sass Wolf (color code: black) | 4710007040 | |
Needle (length: 80 mm; diameter: 0.60 mm) | B.Braun (color code: blue) | 466 5635 | |
Neurobasal Medium | Gibco | 21103049 | |
PE/Cy7 anti-human CD49d antibody | Biolegend | 304314 | |
Penicillin-Streptomycin | Sigma Aldrich | P0781 | |
Peristaltic pump | Watson-Marlow | 205CA | |
Poly-L-ornithine Hydrobromide | Sigma Aldrich | P3655 | |
Polycarbonate lids (HuMiX) | University of Arizona | HuMiX 1.0 / 2.0 | |
Retinoic Acid | Sigma Aldrich | R2625 | |
RLT Buffer (RNeasy Minikit) | Qiagen | 74104 | |
RPMI 1640 Medium | Thermofisher Scientific | 72400-021 | |
SB431542, ALK inhibitor | Abcam | ab120163 | |
Serum bottles | Glasgerätebau Ochs | 102091 | |
Syringe | BD Biosciences | 309110 | |
Trypsin-EDTA solution | Sigma Aldrich | T3924 | |
Y-27632 Dihydrochloride | R&D Systems | 1254 |