Summary
Se describe un protocolo para la detección sensible y cuantitativa de la actividad de la topoisomerasa 1 utilizando el ensayo de detección de actividad enzimática mejorada de círculo rodante. El método permite la detección de la actividad de la topoisomerasa 1 a partir de componentes purificados o extractos de células/tejidos. Este protocolo tiene amplias aplicaciones en cualquier campo que implique la detección de actividad enzimática.
Abstract
Las técnicas basadas en la amplificación isotérmica, como la amplificación del círculo rodante, se han empleado con éxito para la detección de ácidos nucleicos, cantidades de proteínas u otras moléculas relevantes. Estos métodos han demostrado ser alternativas sustanciales a la PCR o ELISA para aplicaciones clínicas y de investigación. Además, la detección de la cantidad de proteína (por Western blot o inmunohistoquímica) es a menudo insuficiente para proporcionar información para el diagnóstico del cáncer, mientras que la medición de la actividad enzimática representa un biomarcador valioso. La medición de la actividad enzimática también permite el diagnóstico y el tratamiento potencial de enfermedades transmitidas por patógenos. En todos los eucariotas, las topoisomerasas son las enzimas clave de unión al ADN involucradas en el control del estado topológico del ADN durante procesos celulares importantes y se encuentran entre los biomarcadores importantes para el pronóstico y el tratamiento del cáncer.
A lo largo de los años, las topoisomerasas se han investigado sustancialmente como un objetivo potencial de medicamentos antiparasitarios y contra el cáncer con bibliotecas de compuestos naturales y sintéticos de moléculas pequeñas que se investigan cada año. Aquí, se presenta el método de amplificación del círculo rodante, denominado ensayo de detección de actividad enzimática mejorada del círculo rodante (REEAD) que permite la medición cuantitativa de la actividad de la topoisomerasa 1 (TOP1) de una manera simple, rápida y sin gel. Al escindir y ligar un sustrato de ADN especialmente diseñado, TOP1 convierte un oligonucleótido de ADN en un círculo cerrado, que se convierte en la plantilla para la amplificación del círculo rodante, produciendo ~ 103 productos de círculo rodante repetido en tándem. Dependiendo de la incorporación de nucleótidos durante la amplificación, existe la posibilidad de diferentes métodos de lectura, desde fluorescencia hasta quimioluminiscencia y colorimétrica. Como cada ligadura de escisión mediada por TOP1 genera un círculo cerrado de ADN, el ensayo es altamente sensible y directamente cuantitativo.
Introduction
Las topoisomerasas pertenecen a la clase de enzimas modificadoras del ADN y muchas de ellas han demostrado ser útiles como biomarcadores para enfermedades humanas 1,2,3,4,5,6. TOP1 está involucrado en la resolución del estrés topológico asociado con procesos celulares como la replicación del ADN, la transcripción génica, la recombinación y la segregación cromosómica7. TOP1 puede resolver superbobinas negativas y positivas por un mecanismo que implica la formación de una ruptura monocatenaria transitoria en el ADN 8,9. Después de unirse al ADN, TOP1 posiciona el sitio activo tirosina (Tyr723) para realizar un ataque nucleofílico en la columna vertebral del fosfodiéster. Luego se genera un complejo de escisión de ADN TOP1 con la enzima unida covalentemente al extremo 3' de la cadena de ADN rota. Esto libera la tensión torsional al permitir que el extremo 5' de la hebra hendida gire alrededor de la hebra intacta. Finalmente, el grupo hidroxilo del extremo 5' realiza un ataque nucleofílico sobre el enlace 3'-fosfotirosil. Como resultado, se libera TOP1 y se restaura la columna vertebral del ADN8.
Se han desarrollado varios ensayos para investigar los pasos del ciclo catalítico TOP1, incluyendo el ensayo de relajación10, el ensayo de desplazamiento de movilidad electroforética (EMSA)11,12, los ensayos de ligadura de escisión suicida de ADN 13,14 y el ensayo in vivo complejo de enzimas (ICE) 15 . Sin embargo, estos ensayos tienen varias limitaciones, ya que dependen de la electroforesis en gel, que requiere agentes intercalantes de ADN, o requieren capacitación y equipo altamente especializados. Además, los ensayos requieren grandes cantidades de enzima TOP1 purificada (que van de 1 a 5 ng para el ensayo de relajación y de 50 a 200 ng para el EMSA y el ensayo de ligadura de escisión) o extractos de al menos 106 células para funcionar de manera óptima. Por lo tanto, se ha desarrollado un método altamente sensible que permite la detección específica de la actividad TOP1 en muestras biológicas crudas y a nivel de evento catalítico único, llamado ensayo REEAD16.
Aquí, se presenta un protocolo para la detección de la actividad TOP1 utilizando el ensayo REEAD16 . Una representación esquemática del ensayo se representa en la Figura 1. Una rejilla de silicona diseñada a medida se adjunta a un portaobjetos funcionalizado para crear una configuración de multipozo de diapositiva de vidrio, llamada wellmaker en lo siguiente (Figura 1A). Esto es seguido por el acoplamiento de un cebador modificado de 5'-amino a los grupos funcionales del NHS en los pocillos del portaobjetos (Figura 1B). La reacción de escisión y ligadura mediada por TOP1 convierte un sustrato de ADN específico en un círculo cerrado. El sustrato específico de TOP1 (Figura 1C) se pliega espontáneamente en forma de mancuerna que contiene un tallo de doble cadena y dos bucles de una sola cadena. Uno de los bucles es complementario a la imprimación anclada en superficie. La región del tallo contiene un sitio de escisión TOP1 favorecido tres bases aguas arriba del extremo 3' y un voladizo de 5'-hidroxilo. La circularización del sustrato se puede lograr utilizando extracto de célula/tejido (Figura 1C) o TOP1 purificado recombinante (Figura 1D).
Cuando el sustrato es escindido por TOP1, la enzima se une transitoriamente al extremo 3' y el fragmento de tres bases se difunde, permitiendo que el voladizo de 5' se reúna al sustrato y facilitando la ligadura mediada por TOP1. La ligadura da como resultado la circularización del sustrato y, posteriormente, la disociación de TOP1. El círculo cerrado se hibrida con el cebador anclado a la superficie (Figura 1E) y se utiliza como plantilla para la amplificación isotérmica del círculo rodante (RCA) mediada por la polimerasa phi29, que puede realizar RCA con desplazamiento de hebra, produciendo 103 productos repetidos en tándem. Durante el paso RCA, se pueden incorporar nucleótidos marcados con fluorescencia (Figura 1F) o acoplados a biotina (Figura 1G)17. La incorporación de nucleótidos marcados con fluorescencia permite la detección de los RCP utilizando un microscopio de fluorescencia o un escáner de fluorescencia. Alternativamente, un anticuerpo antibiotina acoplado a peroxidasa de rábano picante (HRP) (Figura 1H) puede unirse a los nucleótidos biotinilados, lo que permite la detección de los productos de círculo enrollado (RCP) utilizando quimioluminiscencia mejorada (ECL) o mediante la conversión de 3,3',5,5'-tetrametilbencidina (TMB) en un color detectable. El RCA sigue una cinética de reacción lineal, lo que hace que el ensayo REEAD sea directamente cuantitativo, ya que un RCP representa una sola reacción de ligadura de escisión mediada por TOP1. Aquí se demuestra que este ensayo se puede utilizar para detectar la actividad de TOP1 como una enzima recombinante purificada o extraída de muestras crudas y como una herramienta de detección de fármacos anti-TOP1.
Protocol
NOTA: Encuentre una lista de composiciones de búfer, equipos y otros materiales requeridos en la Tabla de materiales.
1. Cultivo celular
- Cultive las células preferidas en un medio adecuado y hágalas crecer de acuerdo con las instrucciones. Como ejemplo, cultive Caco2, células derivadas del adenocarcinoma colorrectal, en Medio Esencial Mínimo (MEM) suplementado con 20% de suero bovino fetal (FBS), 1% de aminoácidos no esenciales (NEAA), 100 unidades / ml de penicilina y 100 mg / ml de estreptomicina. Mantener los cultivos celulares en una incubadora humidificada (5% CO2/95% atmósfera de aire a 37 °C). Coloque las células en frascos de cultivo de tejidos y divida cada 3 días para mantener las células al 70% de confluencia.
- Recolectar las células de un matraz confluente al 70% mediante tratamiento con tripsina (0,25% tripsina, solución de EDTA al 0,02%) y lavar con solución salina tamponada con fosfato (PBS).
- Resuspender el pellet celular en PBS para ajustar la concentración celular a 0,5 × 106 células/tubo. Girar a 200 × g durante 5 min y aspirar cuidadosamente el sobrenadante.
NOTA: Las celdas utilizadas para REEAD deben usarse frescas y mantenerse en hielo. Los resultados obtenidos con células Caco2 han sido publicados recientemente17. El ensayo se ha probado con una variedad de líneas celulares, incluidas células derivadas del cáncer de colon, mama, pulmón y cuello uterino 18,19,20,21,22,23, pero se puede usar con todas las muestras biológicas crudas que contienen TOP1, como tejidos, sangre y saliva.
2. Preparación de diapositivas funcionalizadas
- Conecte la rejilla aislada de silicona diseñada a medida al portaobjetos funcionalizado, haciendo así el wellmaker. Presione la silicona para evitar la formación de burbujas de aire (ver Figura 1A).
- Prepare una mezcla de imprimación 5'-amino de 5 μM en 1x búfer de impresión. Añadir 4 μL de la mezcla a cada pocillo y poner el wellamker en una cámara de hibridación con NaCl saturado a temperaturas entre 15 °C y 25 °C, protegido de la luz.
NOTA: Una cámara de hibridación se puede hacer fácilmente utilizando una caja de punta de pipeta llena de NaCl saturado. La hibridación dura un mínimo de 16 h y un máximo de 72 h. Vea la secuencia del cebador de 5'-amino en la Figura 1B. Los portaobjetos se funcionalizan con grupos NHS para permitir la unión de oligonucleótidos aminomodificados.
3. Generación de sustratos circulares cerrados
- Preparación de sustratos circulares cerrados con TOP1 recombinante o extracto celular.
- Lise un pellet celular de 0,5 × 106 células en 500 μL de tampón de lisis para alcanzar una densidad celular de 1.000 células/μL. Incubar durante 10 min en hielo.
- Preparar una mezcla circular de 2 μL de sustrato específico TOP1 de 5 μM (la secuencia del sustrato es la siguiente: 5'-AGA AAA ATT TTT AAA AAA ACT GTG AAG ATC GCT TAT TTT TTT AAA AAT AAA TCT AAG TCT TTT AGA TCC CTC AAT GCA CAT GTT TGG CTC CGA TCT AAA AGA CTT AGA-3') y 2 μL de enzima TOP1 recombinante o 2 μL de extracto celular (ver paso 3.1.1) en 16 μL de 1x Tampón de reacción TOP1.
NOTA: La concentración de TOP1 recombinante utilizada depende del método de lectura elegido (ver Figura 2, Figura 3, Figura 4 y Figura 5). Vea la secuencia del sustrato específico de TOP1 en la Figura 1C. - Incubar durante 30 min a 37 °C (ver Figura 1C,D).
- Detenga la reacción agregando 2 μL de SDS al 1%.
- Preparación de sustratos circulares cerrados en presencia de fármacos.
- Preparar una mezcla circular de 2 μL de sustrato específico de TOP1 de 5 μM y 1 μL de DMSO al 100% o 1 μL de camptotecina (CPT) de 1,6 mM en 14 μL de 1x Tampón de reacción TOP1. Añadir 2 μL de 5 ng/μL de enzima TOP1 recombinante.
NOTA: Se pueden usar otros compuestos de moléculas pequeñas o medicamentos. En ese caso, se debe hacer una valoración del compuesto. Si el compuesto se disuelve en un disolvente distinto del DMSO, este debe utilizarse como control en lugar de DMSO. - Incubar durante 1 min a 37 °C.
- Detenga la reacción agregando 2 μL de SDS al 1%.
- Preparar una mezcla circular de 2 μL de sustrato específico de TOP1 de 5 μM y 1 μL de DMSO al 100% o 1 μL de camptotecina (CPT) de 1,6 mM en 14 μL de 1x Tampón de reacción TOP1. Añadir 2 μL de 5 ng/μL de enzima TOP1 recombinante.
NOTA: El paso 3 se puede iniciar en paralelo con el paso 2, y los círculos se pueden almacenar a 4 °C durante la noche. Alternativamente, los círculos de ADN se pueden preparar al mismo tiempo que el paso 4 y se pueden usar inmediatamente. Vea la secuencia del sustrato específico de TOP1 en la Figura 1C. El sustrato se pliega en forma de mancuerna con una región de tallo doble que contiene un sitio de escisión TOP1 preferido y dos bucles de una sola cadena. El sustrato abierto de mancuernas se convierte en un sustrato circular cerrado mediante escisión y ligadura mediadas por TOP1 y en lo sucesivo se denominará círculo. Como hay un exceso de imprimación 5'-amino, no habrá competencia entre sustratos abiertos y cerrados específicos de TOP1.
4. Bloqueo del fabricante de pozos
- Sumerja la potestad en una bandeja de 5 cm x 5 cm llena con el tampón 1 que se precalentó a 50 °C. Mediante el uso de una pipeta, empuje el líquido dentro de los pocillos para asegurarse de que no haya burbujas de aire. Incubar durante 30 min a 50 °C.
- Retirar el tampón 1 y lavar 2 x 1 min condH2O. Agitar vigorosamente a mano.
- Añadir el búfer 2 que se haya precalentado a 50 °C. Asegúrese de que no haya burbujas de aire en los pozos. Incubar durante 30 min a 50 °C.
- Lavar 2 x 1 min con dH2O. Agitar vigorosamente a mano.
- Lavar con EtOH al 70% durante 1 min. Agitar vigorosamente con la mano.
- Deje que la máquina de pozos se seque al aire.
NOTA: Utilice aire comprimido para secar los pozos. Alternativamente, es posible soplar aire con una pipeta Pasteur. Asegúrese de que los pozos estén secos antes de continuar.
5. Hibridación de los círculos al wellmaker
- Agregue 4 μL de los círculos (hechos en el paso 3) a cada pocillo correspondiente.
- Colocar la potabilizadora en una cámara de humedad durante 1 h condH2Oa 37 °C.
NOTA: Se puede hacer una cámara de humedad utilizando una caja para puntas de pipeta llenas de dH2O. Alternativamente, la hibridación se puede hacer durante la noche a 25 ° C en la cámara de humedad.
6. Lavado
- Lave la potabilizadora con el tampón 3.
- Elimine el búfer 3 y reemplácelo por el búfer 4.
- Retire el tampón 4 y lave con EtOH al 70%.
- Retire el EtOH y deje secar la máquina de pozos.
NOTA: Todos los pasos de lavado se realizan durante 1 minuto en una bandeja de 5 cm x 5 cm sumergiendo completamente la corredera. Siempre asegúrese de que no haya burbujas de aire dentro de los pozos.
7. Amplificación del círculo rodante
- Prepare una mezcla RCA de 1x tampón de reacción Phi29 suplementado con 0,2 μg/μL BSA, 1 unidad de polimerasa Phi29 y 0,25 mM dNTP y 0,0125 mM ATTO-488-dUTP para lectura de fluorescencia, o 0,1 mM dATP, 0,1 mM DTTP, 0,1 mM dGTP, 0,09 mM dCTP y 0,01 mM Biotin-dCTP para lectura colorimétrica/quimioluminiscencia. Agregue 4 μL a cada pocillo. Ver Figura 1E.
NOTA: La preparación de la mezcla RCA debe hacerse en hielo. Al incorporar nucleótidos fluorescentes en el RCA, evite la luz directa de este paso para proteger los fluoróforos. - Incubar durante 2 h a 37 °C en la cámara de humedad. En el caso de los nucleótidos fluorescentes utilizados, coloque la cámara de humedad en la oscuridad. Ver Figura 1F,G.
8. Lavado
- Para los protocolos de quimioluminiscencia o lectura colorimétrica, lave el pozo como en el paso 6 y luego continúe con el paso 11.
- Para el protocolo de lectura de fluorescencia, retire la rejilla de silicona con pinzas antes de lavar como se indica en los siguientes pasos.
- Lave el tobogán durante 10 minutos en el búfer 3.
- Elimine el búfer 3 y reemplácelo por el búfer 4. Lavar durante 5 min.
- Retire el tampón 4 y lave durante 1 minuto en 70% de EtOH.
- Retire el EtOH y deje secar la máquina de pozos.
9. Visualización de productos fluorescentes de círculo rodante utilizando un escáner de fluorescencia
- Escanee la diapositiva en un escáner de fluorescencia utilizando los filtros correspondientes al fluoróforo utilizado. Utilice el máximo fotomultiplicador posible que no dé saturación.
NOTA: El escáner fluorescente utilizado para la adquisición de imágenes en este protocolo está equipado con un láser de 473 nm y un filtro de excitación FAM de 490 nm, emisión de 520 nm. - Importe la imagen a ImageJ y cambie el tipo de imagen a 8 bits (Imagen | Tipo | 8 bits). Para medir las bandas por separado, limite el área medida mediante la herramienta de dibujo rectangular de la barra de herramientas. Dibujar el área deseada y medir la intensidad (Analizar | Medida). A continuación, mueva el área dibujada originalmente a la siguiente banda y mida.
- Trazar los datos en el software deseado. Las imágenes representativas, incluida la cuantificación extraída de ImageJ, se representan en la Figura 2.
10. Visualización de productos fluorescentes de círculo rodante utilizando un microscopio de fluorescencia
- Con una pluma resistente a EtOH, dibuje la posición de los pocillos antes de retirar la rejilla de silicona y lave la corredera como en el paso 8.2. Después de los pasos de lavado, monte la corredera con 1 μL de medio de montaje sin 4',6-diamidino-2-fenilindol (DAPI) y agregue un vidrio de cobertura. Para permitir la visualización en la cámara, pegue la diapositiva en un portaobjetos de microscopio de 76 mm x 26 mm.
- Analice utilizando un microscopio de fluorescencia equipado con un objetivo de inmersión en aceite de 60x y una cámara. Tome 12-15 imágenes de cada muestra / pozo.
- Importar las imágenes a ImageJ y apilarlas (Imagen | Pilas | Imagen para apilar). Cambie el tipo de imagen a 8 bits (Imagen | Tipo | 8 bits).
- Establecer el umbral (Imagen | Ajustar | Umbral).
- Establezca el umbral de la siguiente manera: establezca la barra inferior y ajuste la barra superior para que solo las señales correctas sean rojas y el fondo sea negro. Asegúrese de que el umbral sea lo más bajo posible antes de que las señales reales comiencen a desaparecer.
- Barra las imágenes individuales y asegúrate de que corresponden a las imágenes antes de establecer el umbral. Tenga en cuenta que el umbral puede cambiar de un experimento a otro.
- Contar las señales (Analizar | Analizar partículas). Asegúrese de que el campo resumido en la configuración de ImageJ esté marcado.
- Exporte los resultados a una hoja de cálculo u otro software para su posterior procesamiento de datos. Las imágenes representativas, incluida la cuantificación extraída de ImageJ, se representan en la Figura 3.
11. Acoplamiento del anticuerpo antibiotina conjugado con HRP a los productos de círculo rodante marcados con biotina
- Agregue 4 μL de anticuerpo antibiotina conjugado con HRP diluido 1:300 en Buffer 5 suplementado con 5% de leche desnatada sin grasa y 5% de BSA a cada pocillo.
- Incubar durante 50 min a 15-25 °C en la cámara de humedad (ver Figura 1H).
- Lavar 3 x 3 min con Buffer 5.
- Seque la potrera.
12. Visualización de los productos de círculo rodante etiquetados con biotina
- Visualización con ECL
- Mezclar 40 μL de ECL Luminol y 40 μL deH2O2inmediatamente antes de usar. Agregue 2 μL a cada pocillo.
- Visualice la diapositiva con una cámara CCD o con películas de rayos X.
- Visualización con TMB
- Después del paso 11.4, retire la rejilla de silicona. Luego, agregue 400 μL de TMB encima de todo el portaobjetos y coloque el portaobjetos en una cámara de humedad. Espere ~ 5-10 minutos para el desarrollo del color. Después del desarrollo del color, lave la diapositiva con 70% de EtOH.
- Visualiza el desarrollo del color a simple vista. Tome una fotografía de la diapositiva con una cámara de fotos o un teléfono móvil.
- Importe la imagen a ImageJ y cambie el tipo de imagen a 8 bits (Imagen | Tipo | 8 bits). Para medir las bandas por separado, limite el área medida mediante la herramienta de dibujo rectangular de la barra de herramientas. Dibujar el área deseada y medir la intensidad (Analizar | Medida). A continuación, mueva el área dibujada originalmente a la siguiente banda y mida.
- Trazar los datos en el software deseado. Las imágenes representativas, incluida la cuantificación extraída de ImageJ, se representan en la Figura 4, la Figura 5 y la Figura 6.
Representative Results
Aquí, se presenta un protocolo para la detección de la actividad TOP1 utilizando el ensayo REEAD16. El protocolo se utilizó para detectar la actividad recombinante de TOP1 utilizando cuatro métodos de lectura diferentes: escáner de fluorescencia, microscopio de fluorescencia, quimioluminiscencia y colorimétrico. El protocolo también se utilizó para detectar la actividad de TOP1 extraída de células Caco2, como ejemplo de extracto crudo, con quimioluminiscencia o lectura de TMB. Además, el protocolo se utilizó como una herramienta de detección de fármacos, para detectar la inhibición de la actividad recombinante de TOP1 por CPT, como un ejemplo de un inhibidor específico de TOP1, utilizando el método de lectura de quimioluminiscencia.
Los resultados obtenidos al analizar la actividad TOP1 utilizando la lectura de fluorescencia se representan en la Figura 2 y la Figura 3. En la Figura 2 se muestra un escaneo representativo del portaobjetos fluorescente y la cuantificación resultante. Como se desprende de la cuantificación, esta lectura tiene un límite de detección de 12,5 ng de TOP1. Las imágenes representativas y la cuantificación resultante obtenida al utilizar la lectura del microscopio fluorescente se muestran en la Figura 3. Usando este método de lectura, el límite de detección es tan pequeño como 0.1 ng de TOP1. Los resultados obtenidos al analizar la actividad TOP1 utilizando la lectura de quimioluminiscencia se representan en la Figura 4, y los resultados de la lectura colorimétrica se representan en la Figura 5. El límite de detección de estos métodos de lectura es de 6 ng de TOP1 o como TOP1 extraído de 312 células Caco2. La Figura 6 muestra las mediciones de la actividad TOP1 en presencia de 80 μM CPT o DMSO como ejemplo de aplicación de cribado de fármacos. La imagen representativa y la cuantificación resultante de tres experimentos independientes muestran que CPT inhibe la circularización mediada por TOP1 del sustrato como se esperaba24,25.
Figura 1: Representación esquemática del protocolo REEAD. (A,B) Preparación de las diapositivas funcionalizadas. La rejilla de silicona está unida al portaobjetos funcionalizado. Luego, el imprimador de 5'-amino se acopla al portaobjetos, lo que permite la amplificación del sustrato específico de TOP1. (C,D) Generación de sustratos circulares cerrados. El sustrato específico de TOP1 se pliega en forma de mancuerna con un sitio de escisión TOP1 preferido en el tallo de doble cadena y una secuencia de unión de imprimación en uno de los dos bucles de cadena simple. (C) TOP1 se libera tras la lisis de las células. Tras la escisión y ligadura mediada por TOP1, el sustrato se convierte en un círculo cerrado; (D) se utiliza TOP1 purificado y recombinante. (E) Amplificación del círculo rodante. Los sustratos circulares cerrados se hibridan con el cebador anclado a la superficie y se amplifican mediante RCA utilizando polimerasa Phi29. El RCA se puede lograr mediante la incorporación de nucleótidos fluorescentes como en F o nucleótidos biotinilados como en G. Los productos fluorescentes de círculo rodante se visualizan utilizando un microscopio de fluorescencia o un escáner de fluorescencia. (H) Acoplamiento del anticuerpo anti-biotina conjugado con HRP. Los productos de círculo rodante biotinilados se incuban con el anticuerpo antibiotina conjugado con HRP. El desarrollo de la señal está mediado por la enzima HRP, y las señales se visualizan mediante ECL y se detectan utilizando una cámara CCD o mediante TMB generando una visualización colorimétrica. Abreviaturas: REEAD = detección de actividad enzimática mejorada de círculo rodante; RCA = amplificación del círculo rodante; TOP1 = topoisomerasa 1; HRP = peroxidasa de rábano picante; ECL = quimioluminiscencia mejorada; TMB = 3,3',5,5'-tetrametilbencidina. Haga clic aquí para ver una versión más grande de esta figura.
Figura 2: Mediciones de la actividad TOP1 utilizando el escáner de fluorescencia. El panel izquierdo muestra una imagen representativa de la diapositiva al analizar la actividad de 3-50 ng de TOP1 utilizando el protocolo de lectura del escáner de fluorescencia. El panel derecho muestra la cuantificación resultante. prueba t con corrección de Welch, p = 0,0064, n = 4. Abreviatura: TOP1 = topoisomerasa 1. Haga clic aquí para ver una versión más grande de esta figura.
Figura 3: Mediciones de la actividad TOP1 utilizando el microscopio de fluorescencia. El panel izquierdo muestra imágenes representativas de la diapositiva al analizar la actividad de 0.1-12.5 ng de TOP1 utilizando el protocolo de lectura de microscopio de fluorescencia. Tenga en cuenta que las imágenes son versiones recortadas para mostrar correctamente los puntos. Por esta razón, no se parecen al número de señales en la cuantificación que se muestra en el panel derecho. prueba t con corrección de Welch, p = 0,0136, n = 3. Abreviatura: TOP1 = topoisomerasa 1. Haga clic aquí para ver una versión más grande de esta figura.
Figura 4: Mediciones de la actividad de TOP1 utilizando la lectura de quimioluminiscencia. (A) El panel izquierdo muestra una imagen representativa de la diapositiva al analizar la actividad de 3-50 ng de TOP1 utilizando el protocolo de lectura de quimioluminiscencia. El panel derecho muestra la cuantificación resultante. prueba t con corrección de Welch, p < 0,0001, n = 4. (B) El panel izquierdo muestra una imagen representativa de la diapositiva al analizar la actividad de TOP1 extraída de 156-40,000 células Caco2 utilizando el protocolo de lectura de quimioluminiscencia. El panel derecho muestra la cuantificación resultante. prueba t con corrección de Welch, p = 0,0224, n = 3. Abreviaturas: TOP1 = topoisomerasa 1. Haga clic aquí para ver una versión más grande de esta figura.
Figura 5: Mediciones de la actividad TOP1 utilizando la lectura colorimétrica. (A) El panel izquierdo muestra una imagen representativa de la diapositiva al analizar 3-50 ng de TOP1 utilizando el protocolo de lectura colorimétrica. El panel derecho muestra la cuantificación resultante. prueba t con corrección de Welch, p = 0,0012, n = 4. (B) El panel izquierdo muestra una imagen representativa de la diapositiva al analizar la actividad de TOP1 extraída de 156-40,000 celdas Caco2 utilizando el protocolo de lectura colorimétrica. El panel derecho muestra la cuantificación resultante. prueba t con corrección de Welch, p = 0,0117, n = 3. Abreviaturas: TOP1 = topoisomerasa 1; TMB = 3,3',5,5'-tetrametilbencidina. Haga clic aquí para ver una versión más grande de esta figura.
Figura 6: Mediciones de la actividad de TOP1 después del tratamiento farmacológico utilizando los protocolos de lectura de quimioluminiscencia. El panel izquierdo muestra una imagen representativa de la diapositiva al analizar 10 ng de TOP1 en presencia de 5% DMSO o CPT de 80 μM durante 1 min. El panel derecho muestra la cuantificación resultante. prueba t con corrección de Welch, p = 0,0017, n = 3. Abreviaturas: TOP1 = topoisomerasa 1; CPT = camptotecina; DMSO = dimetilsulfóxido; Neg = control negativo. Haga clic aquí para ver una versión más grande de esta figura.
Discussion
Las topoisomerasas representan una clase de enzimas modificadoras del ADN que atraen un alto interés clínico y de investigación, siendo el objetivo de compuestos de moléculas pequeñas con efecto potencial en el tratamiento contra el cáncer o en el combate de enfermedades infecciosas. Además, la actividad del TOP1 humano ha demostrado ser un biomarcador eficaz del pronóstico y tratamiento del cáncer18,19,23. Aunque es la actividad TOP1 la que influye en la eficacia de un inhibidor quimioterapéutico26, con frecuencia es la cantidad de ADN-ARN o la cantidad de TOP1 la que se evalúa en entornos clínicos. Esto se debe a la falta de herramientas gratuitas rápidas, fáciles y basadas en gel que puedan proporcionar una cuantificación exacta y precisa de la actividad de la topoisomerasa en todos los entornos de laboratorio.
Aquí, se describe un protocolo para el ensayo REEAD que permite la medición de la actividad TOP1 de una manera libre de gel. En este protocolo, el TOP1 purificado o extracto crudo de las células se incuba con un sustrato en forma de mancuerna de ADN especialmente diseñado que, tras la escisión / ligadura mediada por TOP1, se convierte en una molécula circular cerrada. Los círculos se hibridan sobre una superficie de vidrio y se amplifican mediante RCA. Para permitir la facilidad de uso en la realización de las reacciones que ocurren en el portaobjetos, se adjunta una rejilla de silicona al vidrio, formando pozos individuales donde tienen lugar las reacciones. De esta manera, el protocolo aprovecha un sistema multipozo, una rejilla de silicona, llamada wellmaker.
El protocolo se utilizó para detectar la actividad de TOP1 y TOP1 recombinantes extraídos de células de adenocarcinoma colorrectal Caco2, utilizando como ejemplo. Además, como ejemplo de REEAD para ser utilizado como herramienta de cribado de fármacos, el protocolo se utilizó para detectar la inhibición de la actividad de TOP1 por el conocido inhibidor de TOP1 CPT24,25. El ensayo se acopló con diferentes métodos de lectura: microscopía de fluorescencia, que proporciona una alta sensibilidad, y un escáner de fluorescencia, quimioluminiscencia o colorimétrico, que requieren menos equipo especializado y capacitación. La lectura del microscopio de fluorescencia altamente sensible tiene las limitaciones de la necesidad de un ajuste de microscopio de fluorescencia de buena calidad, personal calificado y adquisición y análisis de imágenes que consumen mucho tiempo.
Por estas razones, se presenta la lectura del escáner de fluorescencia que permite una adquisición y análisis más rápidos, incluso si a expensas de la sensibilidad. En caso de falta de un escáner de fluorescencia, se pueden considerar dos excelentes alternativas, quimioluminiscencia y métodos de lectura colorimétrica. Ambos métodos son rápidos y simples, y no requieren equipos costosos ni capacitación especializada. En todos los formatos de lectura, REEAD tiene muchas ventajas en comparación con los ensayos de última generación, que consumen más tiempo, se basan en geles (con los requisitos de agentes intercalantes) y menos directamente cuantitativos. Sin embargo, hay algunos pasos críticos en el protocolo presentado. Al manejar el cribado del fármaco, los puntos de tiempo, la concentración del fármaco y la relación entre la cantidad TOP1/sustrato de ADN deben optimizarse en comparación con los ajustes descritos optimizados para CPT. El fármaco se puede investigar realizando una preincubación con el sustrato de ADN o una preincubación con la enzima TOP1. Esto puede proporcionar información valiosa sobre la capacidad de la molécula para inhibir TOP1 y ofrecer información sobre el mecanismo de acción del fármaco.
Además, si experimenta señales bajas o ausentes, lo más probable es que esto se deba a una lisis ineficiente de la muestra cruda o a una degradación de TOP1 en el extracto debido al uso inadecuado de inhibidores de la proteasa. Además, esto también puede deberse al almacenamiento inadecuado de los componentes importantes del ensayo, como TOP1 recombinante, polimerasa phi29, nucleótidos, sustrato e imprimación. Finalmente, se deben evitar los ciclos repetidos de congelación-descongelación de los oligonucleótidos, ya que esto afecta dramáticamente el rendimiento del ensayo. Cuando se utiliza extracto crudo, la eficiencia de extracción de la muestra biológica específica debe optimizarse y la cantidad y la actividad de TOP1 pueden variar del ejemplo reportado aquí. Por esta razón, cada extracto crudo que se pruebe requerirá una titulación para la identificación del límite de detección del ensayo y el rango de sensibilidad cuando se utiliza esa muestra en particular. El protocolo ha sido optimizado para la detección de TOP1 humano. Se puede medir la actividad de otros TOP1 eucariotas, pero es posible que sea necesario optimizar la concentración de NaCl y el tiempo de incubación de acuerdo con el método de purificación de la enzima y la actividad enzimática óptima. Sustratos más circularizados resultarán de la incubación prolongada, mientras que menos sustratos circularizados resultarán de la incubación acortada.
Además de las aplicaciones presentadas, REEAD permite medir la actividad TOP1 en extractos crudos de pequeñas biopsias de pacientes con cáncer18, la predicción del efecto citotóxico anticancerígeno de CPT en líneas celulares cancerosas 20,21,22, e incluso la detección de la actividad enzimática en células individuales20,21 . Además, la configuración REEAD presentada utilizando el fabricante de pozos permite la detección de drogas basadas en múltiples pozos de bibliotecas de compuestos sintéticos o naturales. Además de esto, se ha desarrollado una versión modificada del ensayo REEAD, llamada REEAD C / L. Esta configuración permite investigaciones separadas de los pasos de escisión y ligadura de la reacción TOP127. Con el REEAD C/L, es posible determinar el mecanismo de acción de los inhibidores de moléculas pequeñas y caracterizarlos como inhibidores catalíticos TOP1 con posibles efectos antiparasitarios28 o como venenos TOP1 para ser utilizados para el tratamiento contra el cáncer24,25. Finalmente, con un rediseño específico de los sustratos de ADN para que coincidan con los diferentes requisitos (de unión al ADN o ligadura de escisión) de otras enzimas TOP1, REEAD también se ha utilizado para la detección de enfermedades infecciosas (como en el caso de Plasmodium falciparum, causante de malaria29), o Leishmania donovani y virus de la viruela símica (datos no mostrados). O bien, se puede utilizar para identificar compuestos de moléculas pequeñas con efectos antipatógenos. El protocolo presentado proporciona a los científicos en el campo TOP1 un método fácil para detectar la actividad enzimática con poca o ninguna optimización y con la posibilidad de adaptarse a aplicaciones aún más amplias en el futuro.
Disclosures
Los autores C.T. y K.M. son empleados de VPCIR biosciences ApS. C.T., B.R.K. y M.S. son accionistas y/o titulares de opciones sobre acciones. C.T., B.R.K. y M.S. declaran que son inventores nombrados inventores de la patente EP2022/057172 presentada en nombre de VPCIR biosciences ApS. Los otros autores declaran que no tienen intereses contrapuestos.
Acknowledgments
Los autores desean agradecer a la técnica de laboratorio Noriko Y. Hansen, del Departamento de Biología Molecular y Genética de la Universidad de Aarhus, por la asistencia técnica en relación con las purificaciones de enzimas Phi29 y TOP1.
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| Equipment | |||
| Camera for fluorescence image analysis | |||
| CCD camera | For chemiluninescence image analysis | ||
| Fluorescence microscope | Olympus | Equipped with 60x oil immersion objective and a GFP filter ( https://www.edmundoptics.com/p/gfp-filter-cube-set-olympus/21527/) | |
| Fluorescence scanner | Typhoon | FLA 9500 | Equipped with 473 laser and FAM filter |
| Humidity chamber with dH2O | |||
| Hybridization chamber with saturated NaCl | |||
| ImageJ software | Fiji | Download at: https://imagej.net/software/fiji/downloads | |
| Materials | |||
| Cell culture | |||
| Cell growth medium appropiate for the chosen cell line | |||
| Trypsin | Sigma | #T4174 | |
| Pen strep | Sigma | #P4300 | |
| Tissue culture flasks | ThermoFisher | #178983 | |
| FBS | Gibco | #10270106 | |
| NEEA | Sigma | #M7145 | |
| PBS | ThermoFisher | #10010023 | |
| Functionalized slides | |||
| 5'-amine anti-TOP1 primer | Sigma | 5’-/5AmMC6/CCA ACC AAC CAA CCA AAT AAG-3’ | |
| Activated Codelink HD slides | SurModics | #DHD1-0023 | |
| Silicon grid | Grace-biolabs | Custom made | |
| Pertex glue | Histolabs | #00801 | |
| Microscope slide 76 x 26 mm | Hounisen | #2510 1201BL | Other microscope slide of same dimension can be used |
| DNA circles and rolling circle amplification | |||
| TOP1 specific substrate | Sigma | 5’-AGA AAA ATT TTT AAA AAA ACT GTG AAG ATC GCT TAT TTT TTT AAA AAT AAA TCT AAG TCT TTT AGA TCC CTC AAT GCA CAT GTT TGG CTC CGA TCT AAA AGA CTT AGA-3’ | |
| ATTO-488-dUTP | Jena Biosciences | #95387 | |
| Biotin-dCTP | Jena Biosciences | #NU-809-BIO16L | |
| dNTP | ThermoFisher | #R0181 | |
| Phi29 polymerase | VPCIR Biosciences | #10010041 | |
| Recombinant TOP1 | VPCIR Biosciences | #10010001 | |
| Detection of rolling circle products | |||
| BioFX TMB | SurModics | #ESPM-0100-01 | |
| Cover glass | |||
| ECL mixture | Cytiva | #RPN2236 | |
| HRP conjugated anti-biotin antibody | Merck | #A4541 | |
| Mounting medium (vectachield) | Vector laboratories | #H-1000 | |
| Buffer list | |||
| 1x PE Buffer | 1 mM EDTA, 8.12 mM Na2HPO4·2H2O, 1.88 mM NaH2PO4·H2O | ||
| 6x Print Buffer | 300 mM Na3PO4, pH 8.5 | ||
| Blocking solution | Buffer 5 supplemented with 5% non-fat milk and 5% BSA pH 9 | ||
| Lysis Buffer | 10 mM Tris-HCl pH 7.5, 1 mM EDTA + protease inhibitors | ||
| 10x TOP1 Reaction Buffer | 50 mM CaCl2, 50 mM MgCl2, 100 mM Tris-HCl pH 7.5 | ||
| 10x Phi29 Reaction Buffer | 330 mM Tris-acetate pH 7.5, 100 mM Mg-acetate, 660 mM K-acetate, 1% Tween20, 200 mM DTT | ||
| Buffer 1 | 50 mM Tris, 50 mM Tris-HCl, 32 mM ethanolamine. NB: stored at 50 °C. | ||
| Buffer 2 | 4x SSC, 0.1% SDS. NB: stored at 50 °C. | ||
| Buffer 3 | 100 mM Tris-HCl pH 7.5, 150 mM NaCl, 0.3% SDS | ||
| Buffer 4 | 100 mM Tris-HCl pH 7.5, 150 mM NaCl, 0.05% Tween20 | ||
| Buffer 5 | 20 mM Tris-HCl pH 7.5, 150 mM NaCl, 0.05% Tween20 | ||
| Chemicals for buffers | |||
| Tris | Sigma | #T1506 | |
| HCl | Sigma | #1.00317.2011 | |
| EDTA | Sigma | #1.08418.1000 | |
| PMSF | Sigma | #05056489001 | |
| SDS | Applichem | #436143 | |
| Na2HPO4 | Sigma | #1.06580.1000 | |
| NaH2PO4 | Sigma | #1.06346.1000 | |
| Ethanolamine | Sigma | #411000 | |
| SSC | Invitrogen | #15557-036 | |
| Tris-acetate | Sigma | #T1258 | |
| Mg-acetate | Sigma | #M0631 | |
| K-acetate | Sigma | #1.04820.1000 | |
| Tween20 | Sigma | #8.22184.0500 | |
| DTT | Sigma | #D0632 | |
| CaCl2 | Sigma | #1.02382.1000 | |
| MgCl2 | Sigma | #M2670 | |
| NaCl | Sigma | #1.06404.5000 | |
| Skimmed milk powder | Sigma | #70166 | |
| BSA | Sigma | #A4503 |
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