Isolierung regenerierender Hepatozyten nach partieller Hepatektomie bei Mäusen
Summary
Lipidbeladene Hepatozyten sind der Leberregeneration inhärent, gehen aber normalerweise bei der Zentrifugation mit Dichtegradienten verloren. Hier stellen wir ein optimiertes Zellisolationsprotokoll vor, das steatotische Hepatozyten beibehält, was repräsentative Populationen von regenerierenden Hepatozyten nach partieller Hepatektomie bei Mäusen ergibt.
Abstract
Die partielle Hepatektomie ist weit verbreitet, um die Leberregeneration bei Mäusen zu untersuchen, aber die Isolierung hoher Ausbeuten lebensfähiger Hepatozyten für nachgeschaltete Einzelzellanwendungen ist eine Herausforderung. Eine deutliche Akkumulation von Lipiden in regenerierenden Hepatozyten wird während der ersten 2 Tage der normalen Leberregeneration bei Mäusen beobachtet. Diese sogenannte transiente regenerationsassoziierte Steatose (TRAS) ist temporär, überschneidet sich aber teilweise mit der Hauptproliferationsphase. Die Dichtegradientenreinigung ist das Rückgrat der meisten existierenden Protokolle zur Isolierung von primären Hepatozyten. Da die Gradientenreinigung auf der Dichte und Größe der Zellen beruht, trennt sie nicht-steatotische von steatotischen Hepatozytenpopulationen. Daher gehen Fetthepatozyten häufig verloren, was zu nicht repräsentativen Hepatozytenfraktionen führt.
Das vorgestellte Protokoll beschreibt eine einfache und zuverlässige Methode zur in vivo Isolierung von regenerierenden Hepatozyten unabhängig von ihrem Lipidgehalt. Hepatozyten von männlichen C57BL/6-Mäusen werden 24-48 h nach der Hepatektomie durch einen klassischen zweistufigen Kollagenase-Perfusionsansatz isoliert. Eine Standard-Peristaltikpumpe treibt die erwärmten Lösungen über die katheterisierte untere Hohlvene in den Rest, wobei eine retrograde Perfusionstechnik mit Abfluss durch die Pfortader verwendet wird. Hepatozyten werden durch Kollagenase dissoziiert, um sie aus der Glisson-Kapsel freizusetzen. Nach dem Waschen und sorgfältigen Zentrifugieren können die Hepatozyten für beliebige nachgeschaltete Analysen verwendet werden. Zusammenfassend beschreibt diese Arbeit eine einfache und reproduzierbare Technik zur Isolierung einer repräsentativen Population regenerierender Hepatozyten nach partieller Hepatektomie bei Mäusen. Die Methode kann auch bei der Untersuchung von Fettlebererkrankungen helfen.
Introduction
Die Leber kann sich auch nach einem größeren Gewebeverlust selbst regenerieren. Diese einzigartige Regenerationsfähigkeit wird explizit durch das experimentelle Modell der partiellen (70%) Hepatektomie veranschaulicht, das erstmals 1931 von Higgins und Anderson an Ratten beschrieben wurde1. In diesem Modell werden 70% der Leber operativ von Tieren entfernt, indem größere Leberlappen abgeschnitten werden. Die verbleibenden Lappen wachsen dann durch kompensatorische Hypertrophie, um die ursprüngliche Lebermasse innerhalb von etwa 1 Woche nach der Operation wiederherzustellen, wenn auch ohne Wiederherstellung der ursprünglichen Leberarchitektur 2,3. Es wurden zusätzliche Hepatektomien mit unterschiedlichen Mengen an Gewebeentfernung entwickelt, wie z. B. eine 86% erweiterte Hepatektomie, bei der der Leberrest zu klein ist, um sich zu erholen, was schließlich zu Leberversagen nach Hepatektomie (PHLF) und anschließendem Tod bei 30%-50% der Tiere führt 4,5,6. Diese Modelle ermöglichen die Untersuchung der normalen und fehlgeschlagenen Leberregeneration, abhängig von der Menge des resezierten Gewebes (Abbildung 1).
Obwohl Mausmodelle der Hepatektomie seit vielen Jahren erfolgreich eingesetzt werden, ermöglichen erst in jüngster Zeit fortschrittlichere Analysemethoden einen tieferen Einblick auf Einzelzellebene. Für die meisten dieser Methoden ist jedoch das Vorhandensein einzelner Hepatozyten eine Grundvoraussetzung. Die meisten Protokolle für die Isolierung von primären Hepatozyten basieren auf einer zweistufigen Kollagenase-Perfusionstechnik und einer anschließenden Dichtegradientenreinigung, um lebensfähige Hepatozyten von Trümmern und nicht-parenchymalen sowie toten Zellen zu trennen 7,8,9. Diese Methode wurde erstmals 1969 von Berry und Friend beschrieben10 und 1972 von Seglen und Kollegen angepasst11,12. Da die Gradientenzentrifugation jedoch von der Dichte und Größe der Zellen abhängt, gehen lipidbeladene Hepatozyten während der Standardreinigung häufig verloren. Während ein solcher Verlust für viele Forschungsfragen vernachlässigbar sein kann, ist er ein entscheidender Aspekt für die frühe Leberregeneration. Während der ersten 2 Tage akkumulieren Hepatozyten in der sich regenerierenden Mausleber Lipide, wodurch sie an Größe zunehmen und an Dichte verlieren. Diese transiente regenerationsassoziierte Steatose (TRAS) dient der Bereitstellung von regenerativem Brennstoff und ist vorübergehend, überlappt jedoch teilweise die Hauptproliferationsphase und ist ungleichmäßig in den Leberläppchen – den Funktionseinheiten der Leber– verteilt 13,14. Nach längerer 86%-Hepatektomie tritt jedoch auch eine TRAS auf, die jedoch bestehen bleibt, da die Regeneration ins Stocken geraten ist und die Lipide nicht oxidiert werden14. Daher führt die Gradientenreinigung von Hepatozyten nach 70%- oder 86%-Hepatektomien zu nicht repräsentativen Fraktionen, da die meisten lipidbeladenen Hepatozyten aufgrund ihrer geringen Dichte verloren gehen15.
In diesem modifizierten Isolationsprotokoll werden Hepatozyten von C57BL/6-Mäusen 24-48 h nach der Hepatektomie durch einen klassischen zweistufigen Kollagenase-Perfusionsansatz isoliert. In der Regel erfolgt die Kanülierung und Perfusion des Restes zur Zellisolierung über die Pfortader. Der portovaskuläre Widerstand in kleinen Überresten, die nach einer größeren Resektion zurückbleiben, ist jedoch hoch16, und daher ist die Perfusion empfindlich. Da die Hohlvene von Hepatektomien unberührt bleibt, kann die Perfusion durch Kanülierung der Hohlvene leicht in retrograder Richtung durchgeführt werden. Eine Standard-Peristaltikpumpe treibt die erwärmten Lösungen über die katheterisierte untere Hohlvene in den Leberrest, wobei eine retrograde Perfusion mit Abfluss durch die Pfortader verwendet wird (Ergänzende Abbildung S1). Hepatozyten werden durch Kollagenasen dissoziiert und aus der Glisson-Kapsel freigesetzt. Nach dem Waschen und der sorgfältigen Verarbeitung lebensfähiger Hepatozyten durch schrittweise Isolierung mit einem langsamen Zentrifugationsansatz können die Hepatozyten für beliebige nachgeschaltete Analysen verwendet werden.
Protocol
Representative Results
Discussion
Das veröffentlichte Protokoll bietet eine zuverlässige und unkomplizierte Methode zur Isolierung einer hohen Ausbeute an normalen und steatotischen murinen Hepatozyten für Einzelzell-Downstream-Analysen oder Massenanalysen von Zellen nach FACS-Sortierung. Der entscheidende Vorteil gegenüber der Dichtegradientenreinigung besteht darin, dass der zelluläre Lipidgehalt im Wesentlichen keinen Einfluss auf die effektive Ausbeute an Hepatozyten hat. So bleibt der Anteil der steatotischen Hepatozyten erhalten und wird in na…
Divulgazioni
The authors have nothing to disclose.
Acknowledgements
Diese Studie wurde vom Schweizerischen Nationalfonds unterstützt (Projektbeitrag 310030_189262).
Materials
| Reagents | |||
| Alexa Fluor 488 Zombie green | BioLegend | 423111 | Amine-reactive viability dye |
| Attane Isoflurane ad us. vet. 99.9% | Provet AG | QN01AB06 | CAUTION: needs ventilation |
| EDTA solution | Sigma-Aldrich | E8008-100ML | – |
| Ethanol | Sigma-Aldrich | V001229 | Dilute with water to 70% |
| Fetal bovine serum (FCS) | Gibco | A5256701 | – |
| Hanks' Balanced Salt Solution (HBSS), Ca2+, Mg2+, phenol red | Sigma-Aldrich | H9269-6x600ML | For digestion/preservation |
| Hanks' Balanced Salt solution (HBSS), w/o Ca2+, w/o Mg2+, no phenol red | Sigma-Aldrich | H6648-6x500ML | For perfusion buffer |
| HEPES solution, 1 M | Sigma-Aldrich | 83264-100ML-F | – |
| Histoacryl tissue adhesive (butyl-2-cyanoacrylate) | B. Braun | 1050052 | For stabilization of cannulation site |
| Hoechst 33258 Staining Dye Solution | Abcam | ab228550 | – |
| Liberase Research Grade | Roche | 5401119001 | Lyophilized collagenases I/II |
| NaCl 0.9% 500 mL Ecotainer | B. Braun | 123 | – |
| Paralube Vet Ointment | Dechra | 17033-211-38 | – |
| Phosphate buffered saline (PBS) | Gibco | A1286301 | – |
| Sudan IV – Lipid staining | Sigma-Aldrich | V001423 | – |
| Temgesic (Buprenorphine hydrochloride), Solution for Injection 0.3 mg/mL | Indivior Europe Ltd. | 345928 | Narcotics. Store securely. |
| Trypan blue, 0.4%, sterile-filtered | Sigma-Aldrich | T8154 | For cell counting |
| Williams’ Medium E | Sigma-Aldrich | W4128-500ML | – |
| Materials | |||
| 25 mL serological pipette, Greiner Cellstar | Merck | P7865 | – |
| 50 mL Falcon tubes | TPP | – | – |
| BD Neoflon, Pro IV Catheter 26 G | BD Falcon | 391349 | – |
| Cell scraper, rotating blade width 25 mm | TPP | 99004 | – |
| Falcon Cell Strainer 100 µm Nylon | BD Falcon | 352360 | – |
| Fenestrated sterile surgical drape | – | – | Reusable cloth material |
| Filling nozzle for size 16# tubing (ID 3.1 mm) | Drifton | FILLINGNOZZLE#16 | To go into the tubes |
| Flow cytometry tubes, 5 mL | BD Falcon | 352008 | – |
| Male Luer to Barb, Tubing ID 3.2 mm | Drifton | LM41 | Connection tube to syringe |
| Petri dishes, 96 x 21 mm | TPP | 93100 | – |
| Prolene 5-0 | Ethicon | 8614H | To retract the sternum |
| Prolene 6-0 | Ethicon | 8695H | For skin suture |
| Prolene 8-0 | Ethicon | EH7470E | Ligature gall bladder |
| Tube 16#, WT 1.6 mm, ID 3.2 mm, OD 6.4 mm | Drifton | SC0374T | Perfusion tube |
| Equipment | |||
| BD LSRFortessa Cell Analyzer Flow Cytometer | BD | – | – |
| Isis rodent shaver | Aesculap | GT421 | – |
| Isofluran station | Provet | – | – |
| Low-speed centrifuge – Scanspeed 416 | Labogene | – | – |
| Neubauer-improved counting chamber | Marienfeld | – | – |
| Oxygen concentrator – EverFlo | Philips | 1020007 | 0 – 5 L/min |
| Pipetboy – Pipettor Turbo-Fix | TPP | 94700 | – |
| Shenchen perfusion pump – YZ1515x | Shenchen | YZ1515x | – |
| Surgical microscope – SZX9 | Olympus | – | – |
| ThermoLux warming mat | Thermo Lux | – | – |
| Vortex Genie 2, 2700 UpM | NeoLab | 7-0092 | – |
| Water bath – Precision GP 02 | Thermo scientific | – | Adjust to 42 °C |
Riferimenti
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