Ex Vivo Análisis de transitorios de Ca2+ activados mecánicamente en células uroteliales
Summary
Este protocolo describe una metodología para evaluar la función de los canales iónicos activados mecánicamente en células uroteliales nativas utilizando el sensor fluorescente de Ca2+ GCaMP5G.
Abstract
Los canales iónicos activados mecánicamente son transductores biológicos que convierten estímulos mecánicos como las fuerzas de estiramiento o cizallamiento en señales eléctricas y bioquímicas. En los mamíferos, los canales activados mecánicamente son esenciales para la detección de estímulos externos e internos en procesos tan diversos como la sensación táctil, la audición, la regulación del volumen de glóbulos rojos, la regulación de la presión arterial basal y la sensación de plenitud de la vejiga urinaria. Si bien la función de los canales iónicos activados mecánicamente se ha estudiado ampliamente en el entorno in vitro utilizando la técnica patch-clamp, evaluar su función en su entorno nativo sigue siendo una tarea difícil, a menudo debido al acceso limitado a los sitios de expresión de estos canales (por ejemplo, terminales aferentes, células de Merkel, barorreceptores y túbulos renales) o dificultades para aplicar la técnica patch-clamp (p. ej., las superficies apicales de las células paraguas uroteliales). Este protocolo describe un procedimiento para evaluar transitorios de Ca 2+ evocados mecánicamente utilizando el sensor fluorescente GCaMP5G en una preparación urotelial ex vivo, una técnica que podría adaptarse fácilmente para el estudio de eventos de Ca2+ evocados mecánicamente en otras preparaciones de tejidos nativos.
Introduction
Las células epiteliales en el tracto urinario están sujetas a fuerzas mecánicas a medida que el filtrado urinario viaja a través de las nefronas, y la orina se bombea fuera de la pelvis renal y viaja a través de los uréteres para almacenarse en la vejiga urinaria. Se ha reconocido desde hace mucho tiempo que las fuerzas mecánicas (por ejemplo, esfuerzo cortante y estiramiento) ejercidas por los fluidos sobre las células epiteliales que recubren el tracto urinario regulan la reabsorción de proteínas en el túbulo proximal y de solutos en la nefrona distal 1,2,3,4,5,6,7,8,9,10,11, 12,13, así como el almacenamiento de orina en la vejiga urinaria y micción14,15,16,17.
La conversión de estímulos mecánicos en señales eléctricas y bioquímicas, proceso denominado mecanotransducción, está mediada por proteínas que responden a la deformación de las estructuras celulares o de la matriz extracelular asociada 18,19,20,21. Los canales iónicos activados mecánicamente son únicos en el sentido de que pasan de un estado cerrado a un estado permeable abierto en respuesta a cambios en la tensión de la membrana, la presión o el esfuerzo cortante 18,19,20,21,22. Además, los transitorios de Ca 2+ pueden iniciarse por mecanotransducción mediada por integrina o por activación de sistemas de adhesión mecanosensibles en las uniones célula-célula23,24,25,26. La función del canal iónico generalmente se evalúa con la técnica patch-clamp, que implica la formación de un sello gigaohm entre la membrana celular y la pipeta del parche27. Sin embargo, las células ubicadas en capas de tejido profundo con una matriz extracelular densa (por ejemplo, túbulos renales) o rodeadas por una barrera física (por ejemplo, glicocalix) son difíciles de acceder con una micropipeta de vidrio. Del mismo modo, las células incrustadas o que son partes integrales de tejidos con poca estabilidad mecánica (por ejemplo, el urotelio) no se pueden estudiar fácilmente con la técnica de parche-pinza. Debido a que muchos canales iónicos activados mecánicamente son permeables al Ca 2+, un enfoque alternativo es evaluar su actividad mediante microscopía fluorescente utilizando un colorante sensible al Ca2+ o indicadores de calcio codificados genéticamente (GECI) como GCaMP. Los esfuerzos recientes en ingeniería de proteínas han aumentado significativamente el rango dinámico, la sensibilidad y la respuesta de los GECI28,29,30, y los avances en genética han permitido su expresión en poblaciones celulares específicas, lo que las hace ideales para estudiar la mecanotransducción.
El urotelio, el epitelio estratificado que cubre el interior de la vejiga urinaria, funciona como una barrera, evitando la difusión de solutos urinarios en el intersticio de la vejiga, pero también funciona como un transductor, detectando la plenitud de la vejiga y comunicando estos eventos a los nervios y la musculatura subyacentes16. Estudios previos han demostrado que la comunicación entre el urotelio y los tejidos subyacentes requiere los canales iónicos activados mecánicamente Piezo1 y Piezo231. Para evaluar los transitorios de Ca 2+ inducidos mecánicamente en células uroteliales, se desarrolló una nueva técnica descrita que utiliza la transferencia de genes adenovirales para expresar el sensor de Ca2+ GCaMP5G en células uroteliales. Esta técnica emplea una preparación de lámina mucosa que proporciona un fácil acceso a la capa celular paraguas más externa y un sistema asistido por computadora para la estimulación mecánica simultánea de células individuales con una micropipeta de vidrio cerrada y el registro de los cambios en la fluorescencia a lo largo del tiempo.
Protocol
Representative Results
Discussion
Todos los organismos, y aparentemente la mayoría de los tipos de células, expresan canales iónicos que responden a estímulos mecánicos 20,33,34,35,36,37. La función de estos canales activados mecánicamente se ha evaluado predominantemente con la técnica patch-clamp. Sin embargo, debido a problemas de accesibilidad, lo…
Divulgazioni
The authors have nothing to disclose.
Acknowledgements
Este trabajo fue apoyado por las subvenciones de los NIH R01DK119183 (a G.A. y M.D.C.) y S10OD028596 (a G.A.) y por los Cell Physiology and Model Organisms Kidney Imaging Cores del Pittsburgh Center for Kidney Research (P30DK079307).
Materials
| 20x Objective | Olympus | UMPlanFL N | |
| 24 G ¾” catheter | Medline | Suresite IV slide | |
| 4x Objective | Olympus | UPlanFL N | |
| Analog/digital converter | Molecular Devices | Digidata 1440A | |
| Anti-GFP antibody | Abcam | Ab6556 | |
| Beam splitter | Chroma | T495lpxr | |
| Bipolar temperature controller | Warner Instruments | TC-344B | |
| CaCl2 | Fluka | 21114-1L | 1 M solution |
| cellSens software | Olympus | Imaging software | |
| CMOS camera | Hamamatsu | ORCA fusion | |
| Donkey anti-rabbit conjugated to Alexa Fluor 488 | Jackson ImmunoResearch | 711-545-152 | |
| Excel | Microsoft Corporation | ||
| Filter | Chroma | ET470/40X | |
| Glass capillaries Corning 8250 glass | Warner Instruments | G85150T-4 | |
| Glucose | Sigma | G8270 | |
| HEPES | Sigma | H4034 | |
| Inline heater | Warner Instruments | SH-27B | |
| KCl | Sigma | 793590 | |
| Light source | Sutter Instruments | Lambda XL | |
| Manifold pump tubing | Fisherbrand | 14-190-510 | ID 1.52 mm |
| Manifold pump tubing | Fisherbrand | 14-190-533 | ID 2.79 mm |
| MgCl2 | Sigma | M9272 | |
| Mice | Jackson Lab | 664 | 2-4 months old female C57BL/6J |
| Microforge | Narishige | MF-830 | |
| Micromanipulator | Sutter Instruments | MP-285 | |
| Microscope | Olympus | BX51W | |
| Mounting media with DAPI | Invitrogen | S36964 | Slowfade Diamond Antifade with DAPI |
| NaCl | Sigma | S7653 | |
| pClamp software | Molecular Devices | Version 10.4 | Patch-clamp electrophysiology data acquisition and analysis software |
| Peristaltic pump | Gilson | Minipuls 3 | |
| Piezoelectric actuator | Thorlabs | PAS005 | |
| Pipette holder | World Precision Instruments | ||
| Pipette puller | Narishige | PP-830 | |
| Quick exchange heated base with perfusion and adapter ring kit | Warner Instruments | QE-1 | Quick exchange platform fits 35 mm dish |
| Rhodamine-phalloidin | Invitrogen | R415 | |
| Sigma-Plot | Systat Software Inc | Version 14.0 | Scientific graphing and data analysis software |
| Silicone elastomer | Dow | Sylgard 184 | |
| Single channel open-loop piezo controller | Thorlabs | MDT694B | |
| Square grid holder pad | Ted Pella | 10520 | |
| Suture | AD Surgical | S-S618R13 | 6-0 Sylk |
| Teflon mounting rod | Custom made | Use to mount the piezoelectric actuator in the micromanipulator | |
| Tubing | Fisher Scientific | 14171129 | Tygon S3 ID 1/16 IN, OD 1/8 IN |
| USB Digital I/O device | National Instruments | NI USB-6501 |
Riferimenti
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