Ex Vivo Analisi di transitori di Ca2+ attivati meccanicamente in cellule uroteliali
Summary
Questo protocollo descrive una metodologia per valutare la funzione dei canali ionici attivati meccanicamente nelle cellule uroteliali native utilizzando il sensore fluorescente Ca2+ GCaMP5G.
Abstract
I canali ionici attivati meccanicamente sono trasduttori biologici che convertono stimoli meccanici come forze di allungamento o taglio in segnali elettrici e biochimici. Nei mammiferi, i canali attivati meccanicamente sono essenziali per la rilevazione di stimoli esterni e interni in processi diversi come la sensazione tattile, l’udito, la regolazione del volume dei globuli rossi, la regolazione della pressione sanguigna basale e la sensazione di pienezza della vescica urinaria. Mentre la funzione dei canali ionici attivati meccanicamente è stata ampiamente studiata in vitro utilizzando la tecnica patch-clamp, valutare la loro funzione nel loro ambiente nativo rimane un compito difficile, spesso a causa dell’accesso limitato ai siti di espressione di questi canali (ad esempio, terminali afferenti, cellule di Merkel, barocettori e tubuli renali) o difficoltà nell’applicare la tecnica patch-clamp (ad esempio, le superfici apicali delle cellule ombrello uroteliali). Questo protocollo descrive una procedura per valutare i transitori Ca 2+ evocati meccanicamente utilizzando il sensore fluorescente GCaMP5G in una preparazione uroteliale ex vivo, una tecnica che potrebbe essere facilmente adattata per lo studio di eventi di Ca2+ evocati meccanicamente in altre preparazioni tissutali native.
Introduction
Le cellule epiteliali nel tratto urinario sono soggette a forze meccaniche mentre il filtrato urinario viaggia attraverso i nefroni e l’urina viene pompata fuori dalla pelvi renale e viaggia attraverso gli ureteri per essere immagazzinata nella vescica urinaria. È stato a lungo riconosciuto che le forze meccaniche (ad esempio, sforzo di taglio e stiramento) esercitate dai fluidi sulle cellule epiteliali che rivestono le vie urinarie regolano il riassorbimento delle proteine nel tubulo prossimale e dei soluti nel nefrone distale 1,2,3,4,5,6,7,8,9,10,11, 12,13, così come la conservazione delle urine nella vescica urinaria e la minzione14,15,16,17.
La conversione di stimoli meccanici in segnali elettrici e biochimici, un processo denominato meccanotrasduzione, è mediata da proteine che rispondono alla deformazione delle strutture cellulari o della matrice extracellulare associata 18,19,20,21. I canali ionici attivati meccanicamente sono unici nel senso che passano da uno stato chiuso a uno stato permeabile aperto in risposta a cambiamenti nella tensione della membrana, nella pressione o nello sforzo di taglio 18,19,20,21,22. Inoltre, i transitori di Ca 2+ possono essere iniziati mediante meccanotrasduzione integrina-mediata o mediante attivazione di sistemi di adesione meccano-responsivi alle giunzioni cellula-cellula23,24,25,26. La funzione del canale ionico viene solitamente valutata con la tecnica patch-mord, che comporta la formazione di un sigillo gigaohm tra la membrana cellulare e la pipetta patch27. Tuttavia, le cellule situate in strati di tessuto profondo con una matrice extracellulare densa (ad esempio, tubuli renali) o circondate da una barriera fisica (ad esempio, glicocalice) sono difficili da accedere con una micropipetta di vetro. Allo stesso modo, le cellule incorporate o che sono parti integranti di tessuti con scarsa stabilità meccanica (ad esempio, l’urotelio) non possono essere facilmente studiate con la tecnica patch-clamp. Poiché molti canali ionici attivati meccanicamente sono permeabili al Ca 2+, un approccio alternativo consiste nel valutare la loro attività mediante microscopia fluorescente utilizzando un colorante sensibile al Ca2+ o indicatori di calcio geneticamente codificati (GECI) come GCaMP. I recenti sforzi nell’ingegneria proteica hanno aumentato significativamente la gamma dinamica, la sensibilità e la risposta dei GECI28,29,30, e i progressi nella genetica hanno permesso la loro espressione in specifiche popolazioni cellulari, rendendoli ideali per studiare la meccanotrasduzione.
L’urotelio, l’epitelio stratificato che ricopre l’interno della vescica urinaria, funge da barriera, impedendo la diffusione di soluti urinari nell’interstizio della vescica, ma funziona anche come trasduttore, rilevando la pienezza della vescica e comunicando questi eventi ai nervi e alla muscolatura sottostanti16. Studi precedenti hanno dimostrato che la comunicazione tra l’urotelio e i tessuti sottostanti richiede i canali ionici attivati meccanicamente Piezo1 e Piezo231. Per valutare i transitori di Ca 2+ indotti meccanicamente nelle cellule uroteliali, è stata sviluppata una nuova tecnica descritta che utilizza il trasferimento genico adenovirale per esprimere il sensore Ca2+ GCaMP5G nelle cellule uroteliali. Questa tecnica impiega una preparazione del foglio di mucosa che fornisce un facile accesso allo strato più esterno della cellula dell’ombrello e un sistema assistito da computer per la stimolazione meccanica simultanea delle singole cellule con una micropipetta di vetro chiusa e la registrazione delle variazioni di fluorescenza nel tempo.
Protocol
Representative Results
Discussion
Tutti gli organismi, e apparentemente la maggior parte dei tipi di cellule, esprimono canali ionici che rispondono agli stimoli meccanici 20,33,34,35,36,37. La funzione di questi canali attivati meccanicamente è stata valutata prevalentemente con la tecnica patch-mors. Tuttavia, a causa di problemi di accessibilità, gli stu…
Divulgazioni
The authors have nothing to disclose.
Acknowledgements
Questo lavoro è stato sostenuto dalle sovvenzioni NIH R01DK119183 (a G.A. e M.D.C.) e S10OD028596 (a G.A.) e dal Cell Physiology and Model Organisms Kidney Imaging Cores del Pittsburgh Center for Kidney Research (P30DK079307).
Materials
| 20x Objective | Olympus | UMPlanFL N | |
| 24 G ¾” catheter | Medline | Suresite IV slide | |
| 4x Objective | Olympus | UPlanFL N | |
| Analog/digital converter | Molecular Devices | Digidata 1440A | |
| Anti-GFP antibody | Abcam | Ab6556 | |
| Beam splitter | Chroma | T495lpxr | |
| Bipolar temperature controller | Warner Instruments | TC-344B | |
| CaCl2 | Fluka | 21114-1L | 1 M solution |
| cellSens software | Olympus | Imaging software | |
| CMOS camera | Hamamatsu | ORCA fusion | |
| Donkey anti-rabbit conjugated to Alexa Fluor 488 | Jackson ImmunoResearch | 711-545-152 | |
| Excel | Microsoft Corporation | ||
| Filter | Chroma | ET470/40X | |
| Glass capillaries Corning 8250 glass | Warner Instruments | G85150T-4 | |
| Glucose | Sigma | G8270 | |
| HEPES | Sigma | H4034 | |
| Inline heater | Warner Instruments | SH-27B | |
| KCl | Sigma | 793590 | |
| Light source | Sutter Instruments | Lambda XL | |
| Manifold pump tubing | Fisherbrand | 14-190-510 | ID 1.52 mm |
| Manifold pump tubing | Fisherbrand | 14-190-533 | ID 2.79 mm |
| MgCl2 | Sigma | M9272 | |
| Mice | Jackson Lab | 664 | 2-4 months old female C57BL/6J |
| Microforge | Narishige | MF-830 | |
| Micromanipulator | Sutter Instruments | MP-285 | |
| Microscope | Olympus | BX51W | |
| Mounting media with DAPI | Invitrogen | S36964 | Slowfade Diamond Antifade with DAPI |
| NaCl | Sigma | S7653 | |
| pClamp software | Molecular Devices | Version 10.4 | Patch-clamp electrophysiology data acquisition and analysis software |
| Peristaltic pump | Gilson | Minipuls 3 | |
| Piezoelectric actuator | Thorlabs | PAS005 | |
| Pipette holder | World Precision Instruments | ||
| Pipette puller | Narishige | PP-830 | |
| Quick exchange heated base with perfusion and adapter ring kit | Warner Instruments | QE-1 | Quick exchange platform fits 35 mm dish |
| Rhodamine-phalloidin | Invitrogen | R415 | |
| Sigma-Plot | Systat Software Inc | Version 14.0 | Scientific graphing and data analysis software |
| Silicone elastomer | Dow | Sylgard 184 | |
| Single channel open-loop piezo controller | Thorlabs | MDT694B | |
| Square grid holder pad | Ted Pella | 10520 | |
| Suture | AD Surgical | S-S618R13 | 6-0 Sylk |
| Teflon mounting rod | Custom made | Use to mount the piezoelectric actuator in the micromanipulator | |
| Tubing | Fisher Scientific | 14171129 | Tygon S3 ID 1/16 IN, OD 1/8 IN |
| USB Digital I/O device | National Instruments | NI USB-6501 |
Riferimenti
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