Hier beschrijven we een methode voor de bacteriële co-expressie van differentieel gelabelde eiwitten met behulp van een reeks compatibele vectoren, gevolgd door de conventionele pulldown-technieken om eiwitcomplexen te bestuderen die niet in vitro kunnen worden samengevoegd.
Pulldown is een eenvoudige en veelgebruikte eiwit-eiwit interactie assay. Het heeft echter beperkingen bij het bestuderen van eiwitcomplexen die niet effectief in vitro assembleren. Dergelijke complexen kunnen co-translationele assemblage en de aanwezigheid van moleculaire chaperonnes vereisen; ofwel vormen ze stabiele oligomeren die in vitro niet kunnen dissociëren en opnieuw associëren, ofwel zijn ze instabiel zonder bindende partner. Om deze problemen te overwinnen, is het mogelijk om een methode te gebruiken die is gebaseerd op de bacteriële co-expressie van differentieel gelabelde eiwitten met behulp van een reeks compatibele vectoren gevolgd door de conventionele pulldown-technieken. De workflow is tijdsefficiënter in vergelijking met traditionele pulldown omdat het de tijdrovende stappen van afzonderlijke zuivering van interagerende eiwitten en hun daaropvolgende incubatie mist. Een ander voordeel is een hogere reproduceerbaarheid door een aanzienlijk kleiner aantal stappen en een kortere periode waarin eiwitten die in de in vitro omgeving voorkomen worden blootgesteld aan proteolyse en oxidatie. De methode werd met succes toegepast voor het bestuderen van een aantal eiwit-eiwitinteracties wanneer andere in vitro technieken ongeschikt bleken te zijn. De methode kan worden gebruikt voor het batchgewijs testen van eiwit-eiwitinteracties. Representatieve resultaten worden getoond voor studies van interacties tussen BTB-domein en intrinsiek ongeordende eiwitten, en van heterodimeren van zinkvinger-geassocieerde domeinen.
Conventionele pulldown wordt veel gebruikt om eiwit-eiwitinteracties te bestuderen1. Gezuiverde eiwitten interageren echter vaak niet effectief in vitro2,3, en sommige zijn onoplosbaar zonder hun bindingspartner 4,5. Dergelijke eiwitten kunnen co-translationele assemblage of de aanwezigheid van moleculaire chaperonnes 5,6,7,8,9 vereisen. Een andere beperking van conventionele pulldown is het testen van mogelijke heteromultimerisatieactiviteit tussen domeinen die kunnen bestaan als stabiele homo-oligomeren die co-translationeel zijn geassembleerd 8,10, omdat velen van hen niet in vitro kunnen dissociëren en opnieuw associëren tijdens de incubatietijd. Co-expressie bleek nuttig te zijn bij het overwinnen van dergelijke problemen 3,11. Co-expressie met behulp van compatibele vectoren in bacteriën werd met succes gebruikt om grote multi-subunit macromoleculaire complexen te zuiveren, waaronder polycomb repressief complex PRC212, RNA polymerase II mediator head module13, bacteriofaag T4 basisplaat 14, SAGA complex deubiquitinylase module 15,16 en ferritine 17. Replicatiebronnen die vaak worden gebruikt voor co-expressie zijn ColE1, p15A18, CloDF1319 en RSF20. In het in de handel verkrijgbare Duet-expressiesysteem worden deze oorsprongen gecombineerd met verschillende antibioticaresistentiegenen en handige meerdere kloonsites om polycistronische vectoren te produceren, waardoor de expressie van maximaal acht eiwitten mogelijk is. Deze oorsprongen hebben verschillende kopienummers en kunnen in verschillende combinaties worden gebruikt om evenwichtige expressieniveaus van doeleiwittente bereiken 21. Om eiwit-eiwitinteracties te testen, worden verschillende affiniteitstags gebruikt; de meest voorkomende zijn 6xHistidine, glutathion-S-transferase (GST) en maltose-bindend eiwit (MBP), die elk een specifieke affiniteit hebben met de overeenkomstige hars. GST en MBP verbeteren ook de oplosbaarheid en stabiliteit van gelabelde eiwitten22.
Er zijn ook een aantal methoden ontwikkeld waarbij eiwitten co-expressie in eukaryote cellen gebruiken, waarvan de meest prominente gist twee-hybride assay (Y2H)23 is. Y2H-test is goedkoop, gemakkelijk en maakt het testen van meerdere interacties mogelijk; De workflow duurt echter meer dan 1 week om te voltooien. Er zijn ook een paar minder vaak gebruikte zoogdiercel-gebaseerde assays, bijvoorbeeld fluorescent two-hybrid assay (F2H)24 en cell array protein-protein interaction assay (CAPPIA)25. F2H-assay is relatief snel, waardoor eiwitinteracties in hun oorspronkelijke cellulaire omgeving kunnen worden waargenomen, maar omvat het gebruik van dure beeldvormingsapparatuur. Al deze methoden hebben een voordeel ten opzichte van prokaryote expressie die de oorspronkelijke eukaryote vertaal- en vouwomgeving biedt; Ze detecteren echter indirect interactie, hetzij door transcriptionele activering of door fluorescerende energieoverdracht, die vaak artefacten produceert. Ook kunnen eukaryote cellen andere interactiepartners van eiwitten van belang bevatten, die het testen van binaire interacties tussen eiwitten van hogere eukaryoten kunnen verstoren.
De huidige studie beschrijft een methode voor de bacteriële co-expressie van differentieel gelabelde eiwitten gevolgd door conventionele pulldown-technieken. De methode maakt het mogelijk om interacties tussen doeleiwitten te bestuderen die co-expressie vereisen. Het is tijdsefficiënter in vergelijking met traditionele pulldown, waardoor batchtests van meerdere doelen mogelijk zijn, waardoor het in de meeste gevallen voordelig is. Co-expressie met behulp van compatibele vectoren is handiger dan polycistronische co-expressie, omdat het geen moeizame kloonstap vereist.
De beschreven methode maakt het testen van eiwit-eiwitinteracties mogelijk die niet efficiënt in vitro kunnen worden geassembleerd en co-expressie vereisen. De methode is een van de weinige geschikte benaderingen voor het bestuderen van heterodimeriserende eiwitten, die ook in staat zijn tot homodimerisatie, omdat dergelijke eiwitten, wanneer ze afzonderlijk worden gezuiverd, stabiele homodimeren vormen die meestal niet kunnen dissociëren en opnieuw associëren tijdens het experiment <s…
The authors have nothing to disclose.
Dit werk werd ondersteund door de projecten 19-74-30026 (methodeontwikkeling en -validatie) en 19-74-10099 (eiwit-eiwitinteractietests); en door het ministerie van Wetenschap en Hoger Onderwijs van de Russische Federatie-subsidie 075-15-2019-1661 (analyse van representatieve eiwit-eiwitinteracties).
8-ELEMENT probe | Sonics | 630-0586 | The high throughput 8-element sonicator probes |
Agar | AppliChem | A0949 | |
Amylose resin | New England Biolabs | E8021 | Resin for purification of MBP-tagged proteins |
Antibiotics | AppliChem | A4789 (kanamycin); A0839 (ampicillin) | |
Beta-mercaptoethanol | AppliChem | A1108 | |
BL21(DE3) | Novagen | 69450-M | |
CaCl2 | AppliChem | A4689 | |
Centrifuge | Eppendorf | 5415R (Z605212) | |
Glutathione | AppliChem | A9782 | |
Glutathione agarose | Pierce | 16100 | Resin for purification of GST-tagged proteins |
Glycerol | AppliChem | A2926 | |
HEPES | AppliChem | A3724 | |
HisPur Ni-NTA Superflow Agarose | Thermo Scientific | 25214 | Resin for purification of 6xHis-tagged proteins |
Imidazole | AppliChem | A1378 | |
IPTG | AppliChem | A4773 | |
KCl | AppliChem | A2939 | |
LB | AppliChem | 414753 | |
Maltose | AppliChem | A3891 | |
MOPS | AppliChem | A2947 | |
NaCl | AppliChem | A2942 | |
NP40 | Roche | 11754599001 | |
pACYCDuet-1 | Sigma-Aldrich | 71147 | Vector for co-expression of proteins with p15A replication origin |
pCDFDuet-1 | Sigma-Aldrich | 71340 | Vector for co-expression of proteins with CloDF13 replication origin |
PMSF | AppliChem | A0999 | |
Protease Inhibitor Cocktail VII | Calbiochem | 539138 | Protease Inhibitor Cocktail |
pRSFDuet-1 | Sigma-Aldrich | 71341 | Vector for co-expression of proteins with RSF replication origin |
SDS | AppliChem | A2263 | |
Tris | AppliChem | A2264 | |
VC505 sonicator | Sonics | CV334 | Ultrasonic liquid processor |
ZnCl2 | AppliChem | A6285 |