3D 세포 배양을 위한 미세 다공성 어닐링 입자 스캐폴드의 입자 분획 제어
Summary
입상 스캐폴드 내에서 입자 분획의 변동성을 최소화하면 재현 가능한 실험이 용이해집니다. 이 작업은 시험관 내 조직 공학 응용 분야를 위해 제어된 입자 분획으로 과립 스캐폴드를 생성하는 방법을 설명합니다.
Abstract
마이크로젤은 미세다공성 어닐링 입자(MAP) 스캐폴드의 빌딩 블록으로, 체외 세포 배양 및 생체 내 조직 복구를 위한 플랫폼 역할을 합니다. 이러한 입상 스캐폴드에서 마이크로젤 사이의 빈 공간에 의해 생성된 선천성 다공성은 세포 침윤 및 이동을 가능하게 합니다. 공극률과 입자 분획을 제어하는 것은 MAP 스캐폴드 설계에 매우 중요한데, 이는 다공성이 세포의 생리활성 신호이기 때문입니다. 구형 마이크로겔은 크기 및 형상을 제어하기 위해 마이크로유체 디바이스 상에서 생성될 수 있고, 후속적으로 중합체 네트워크의 파쇄를 방지하는 방법을 사용하여 동결건조될 수 있다. 재수화 시, 동결건조된 마이크로겔은 MAP 스캐폴드에서 제어된 입자 분획으로 이어진다. 마이크로겔 동결건조를 위한 이러한 방법의 구현은 입자 분획이 거대분자 확산 및 세포 확산에 미치는 영향을 보여주는 재현 가능한 연구로 이어졌습니다. 다음 프로토콜은 MAP 스캐폴드에서 입자 분획을 제어하기 위한 마이크로젤의 제조, 동결건조 및 재수화뿐만 아니라 시험관 내 3D 세포 배양을 위한 생체 직교 가교를 통해 마이크로젤을 어닐링하는 방법을 다룹니다.
Introduction
미세 다공성 어닐링 입자 (MAP) 스캐 폴드는 마이크로 겔 (μgel) 빌딩 블록이 상호 연결되어 벌크 다공성 스캐 폴드를 형성하는 입상 재료의 하위 클래스입니다. 이러한 입상 스캐폴드의 고유한 마이크로아키텍처를 통해 상호 연결된 구형 마이크로겔 사이의 빈 공간에 의해 생성된 타고난 다공성은 가속화된 세포 침투및 이동을 지원합니다1. MAP 스캐폴드의 마이크로겔 빌딩 블록은 화학적 변형2을 갖는 합성 및 천연 중합체 둘 다로부터 제조될 수 있다. 여기에 설명된 방법은 기능성 노르보르넨(NB) 핸들로 변형된 히알루론산(HA) 백본으로 구성된 마이크로젤의 사용을 구체적으로 강조합니다. HA 폴리머의 NB 기능적 핸들은 마이크로겔을 형성하고 이들을 함께 연결하여 MAP 스캐폴드 3,4를 생성하기 위한 클릭 화학 반응을 지원합니다. 마이크로겔을 함께 연결(즉, 어닐링)하기 위해 효소1, 광기반 5,6 및 무첨가 클릭 화학 3,7 반응과 같은 수많은 방식이 사용되었습니다. 무첨가 클릭 화학은 HA-NB 마이크로겔을 상호 결합시키기 위한 테트라진-노르보르넨 역전자 요구량 딜스-알더 컨쥬게이션을 사용하여 본 작업에 기술된다.
MAP 스캐폴드를 제조하기 위해 사용자는 먼저 배치 시스템 또는 미세유체 장치 내에서 역에멀젼을 사용하고 전기유체역학 스프레이, 리소그래피 또는 기계적단편화2를 사용하여 마이크로겔 빌딩 블록을 생성합니다. 구형 HA-NB 마이크로겔의 제조는 배치 에멀젼2 및 마이크로유체 액적 생성 기술 8,9,10,11 둘 다를 사용하여 잘 기술되고 이전에 보고되었다. 이 작업에서, 구형 HA-NB 마이크로겔은 앞서 설명한바와 같이 제어된 크기 및 형상을 위해 유동 집속 마이크로유체 플랫폼 상에서 생성되었다 8,9,10. 정제 후, 마이크로겔은 수성 현탁액에 존재하며 걸림 상태를 유도하기 위해 농축되어야 합니다. 걸림이 있을 때, 마이크로젤은 전단 박화 특성을 나타내어 주사 가능한 공간 채우기 물질1로 기능할 수 있습니다. 걸림 상태를 유도하는 한 가지 방법은 동결건조 또는 동결건조를 통해 마이크로겔을 건조시킨 다음, 건조된 생성물을 제어된 부피(12)에서 후속적으로 재수화시키는 것이다. 대안적으로, 과량의 완충액은 스트레이너를 통한 원심분리를 통해 또는 흡인 또는 흡수성 물질을 사용하여 마이크로겔 펠릿으로부터 완충액을 수동으로 제거함으로써 마이크로겔 슬러리로부터 제거될 수 있다. 그러나, 마이크로겔을 건조시키기 위해 원심분리를 사용하는 것은 과립형 스캐폴드(12)를 제조할 때 매우 다양한 범위의 입자 분획 및 공극 분획을 생성할 수 있다. 마이크로겔을 동결건조하기 위한 기술은 폴리에틸렌 글리콜 (PEG) 마이크로겔13에 대해 70% IPA, 젤라틴 메타크릴로일 (GelMa) 마이크로겔 14에 대한 불소화 오일, 및 HA 마이크로겔12에 대해 70% 에탄올을 사용하여 설명되었다. 이 프로토콜은 건조 공정 중에 원래의 마이크로젤 특성을 유지하기 위해 표준 실험실 시약인 70% 에탄올을 사용하여 구형 HA 마이크로젤을 동결 건조하는 방법을 강조합니다. 동결건조된 HA 마이크로겔은 MAP 스캐폴드12에서 최종 입자 분획을 제어하기 위해 사용자 정의된 중량 백분율로 칭량 및 재수화될 수 있습니다.
MAP 스캐폴드 형성의 마지막 단계는 마이크로겔을 어닐링하여 벌크, 다공성 스캐폴드(1)를 생성하는 것에 의존한다. 천연 세포외 매트릭스 성분을 활용하고 생체 직교 어닐링 방식을 사용함으로써 MAP 스캐폴드는 시험관 내 세포 배양 및 생체 내 조직 복구3 모두를 위한 생체 적합성 플랫폼 역할을 합니다. 이러한 접근법을 통해, MAP 스캐폴드는 조직 공학 애플리케이션(12)에서의 사용을 위해 사용자 정의된 입자 분획을 갖는 HA-NB 빌딩 블록으로부터 제조될 수 있다. 하기 프로토콜은 MAP 스캐폴드에서 입자 분획을 제어하기 위한 동결건조 및 재수화에 따른 HA-NB 마이크로겔의 미세유체 생산을 설명합니다. 마지막으로, 마이크로젤을 어닐링하는 단계는 시험관 내 3D 세포 배양 실험을 위해 생체 직교 화학을 사용하여 설명됩니다.
Protocol
Representative Results
Discussion
HA-NB 마이크로젤의 미세유체 생산은 에멀젼 배치 생산보다 더 좁은 범위의 크기 분포를 갖는 마이크로겔을 생성하는 것으로 나타났다 3,9. 이 프로토콜에 기재된 마이크로겔은 물질 분해를 지지하기 위해 MMP-절단가능한 가교결합제 (Ac-GCRDGPQGIWGQDRCG-NH2)를 사용하여 제형화하였다. 그러나, HA-NB 마이크로겔은 또한 비분해성인 디티오트레이톨 (DTT)?…
Divulgazioni
The authors have nothing to disclose.
Acknowledgements
저자는 국립 보건원, 국립 신경 장애 및 뇌졸중 연구소 (1R01NS112940, 1R01NS079691, R01NS094599) 및 국립 알레르기 및 전염병 연구소 (1R01AI152568)에 감사드립니다. 이 작업은 노스 캐롤라이나 연구 삼각형 나노 기술 네트워크 (RTNN)의 회원 인 듀크 대학교 공유 재료 계측 시설 (SMIF)에서 부분적으로 수행되었으며, 이는 국립 나노 기술 조정 인프라 (NNCI)의 일환으로 국립 과학 재단 (수상 번호 ECCS-2025064)이 지원합니다. 저자들은 실험실의 전 박사후 연구원인 Lucas Schirmer 박사와 세포 배양 실험을 위한 3D 인쇄 장치를 생성하는 데 도움을 준 Ethan Nicklow에게 감사드립니다.
Materials
| 1 mL Luer-Lok syringe sterile, single use, polycarbonate | BD | 309628 | |
| 5 mL Luer-Lok syringe sterile, single use, polycarbonate | BD | 309646 | |
| Alexa Fluor 488 C5 maleimide | Invitrogen | A10254 | For synthesis of fluorescently-labeled tetrazine |
| Alexa Fluor 647 Phalloidin | Invitrogen | A22287 | For staining cell culture samples |
| Aluminum foil | VWR | 89107-726 | |
| Biopsy punch with plunger, 1.0 mm | Integra Miltex | 69031-01 | |
| Biopsy punch, 4 mm | Integra Miltex | 33-34 | |
| Blunt needle, 23 G 0.5", Non-Sterile, Capped | SAI Infusion Technologies | B23-50 | |
| Bottle-top vacuum filter, 0.22 μm | Corning | CLS430521 | |
| Calcium chloride | VWR | 1B1110 | For microgel washing buffer |
| Capillary-piston assemblies for positive-displacement pipettes, 1000 μL max. volume | Rainin | 17008609 | |
| Capillary-piston assemblies for positive-displacement pipettes, 25 μL max. volume | Rainin | 17008605 | |
| Capillary-piston assemblies for positive-displacement pipettes, 250 μL max. volume | Rainin | 17008608 | |
| Countess Cell Counting Chamber Slides | Invitrogen | C10228 | |
| Countess II FL Automated Cell Counter | Invitrogen | AMQAF1000 | |
| Centrifuge tube, 15 mL | CELLTREAT | 667015B | |
| Centrifuge tube, 50 mL | CELLTREAT | 229421 | |
| Chloroform, ACS grade, Glass Bottle | Stellar Scientific | CP-C7304 | For synthesis of fluorescently-labeled tetrazine |
| Corona plasma gun, BD-10A High Frequency Generator | ETP | 11011 | |
| CryoTube Vials, Polypropylene, Internal Thread with Screw Cap | Nunc | 368632 | |
| D1 mouse mesenchymal cells | ATCC | CRL-12424 | Example cell line for culture in MAP gels |
| DAPI | Sigma-Aldrich | D9542 | For staining cell culture samples |
| Deuterium oxide, 99.9 atom% D | Sigma-Aldrich | 151882 | For NMR spectroscopy |
| Dialysis tubing, regenerated cellulose membrane, 12-14 kDa molecular weight cut-off | Spectra/Por | 132703 | For purifying HA-NB and HA-Tet |
| Diethyl ether | VWR | BDH1121-4LPC | For synthesis of fluorescently-labeled tetrazine |
| Dimethylformamide | Sigma-Aldrich | 277056 | For synthesis of fluorescently-labeled tetrazine |
| 4-(4,6-dimethoxy-1,3,5-triazin-2-yl)-4-methylmorpholinium chloride (DMTMM) | TCI-Chemicals | D2919 | For modifying HA |
| Dithiothreitol (DTT) | Thermo Scientific | R0861 | Non-degradable dithiol linker (substitute for MMP-cleavable peptide) |
| Dulbecco's Modified Eagle's Medium (DMEM), high glucose, w/ 4500 mg/L glucose, L-glutamine, sodium pyruvate, and sodium bicarbonate, liquid, sterile-filtered, suitable for cell culture | Sigma-Aldrich | D6429-500ML | For D1 cell culture |
| EMS Paraformaldehyde, Granular | VWR | 100504-162 | For making 4% PFA |
| Ethanol absolute (200 proof) | KOPTEC | 89234-850 | |
| Fetal bovine serum (FBS) | ATCC | 30-2020 | For D1 cell culture |
| Heating Plate | Kopf Instruments | HP-4M | |
| Hemacytometer with coverglass | Daigger Scientific | EF16034F | |
| 2-[4-(2-hydroxyethyl)piperazin-1-yl]ethanesulfonic acid (HEPES) | Sigma-Aldrich | H3375 | |
| Sodium hyaluronate, 79 kDa average molecular weight, produced in bacteria Streptococcus zooepidemicus, pharmaceutical grade, microbial contamination <100 CFU/g, bacterial endotoxins <0.050 IU/mg | Contipro | N/A | 79 kDa average molecular weight was used for HA-Tet synthesis, but these methods could be adapted for other molecular weights. |
| IMARIS Essentials software package | Oxford Instruments | N/A | Microscopy image analysis software |
| Infusion pump, dual syringe | Chemyx | N/A | |
| Kimwipe | Kimberly-Clark | 34120 | |
| Laboratory stand with support lab clamp | Geyer | 212100 | |
| Liquid nitrogen | Airgas | NI 180LT22 | |
| Lithium Phenyl(2,4,6-trimethylbenzoyl)phosphinate | TCI-Chemicals | L0290 | |
| Lyophilizer | Labconco | N/A | Labconco FreeZone 6 plus has been discontinued, but other lab grade console freeze dryers could be used for this protocol. |
| Methyltetrazine-PEG4-maleimide | Kerafast | FCC210 | For synthesis of fluorescently-labeled tetrazine |
| 2-(4-Morpholino)ethane Sulfonic Acid (MES) | Fisher Scientific | BP300-100 | For modifying HA |
| Micro cover glass, 24 x 60 mm No. 1 | VWR | 48393-106 | |
| Microfluidic device SU8 master wafer | FlowJem | Custom design made either in-house in clean room or outsourced | |
| Mineral oil, heavy | Sigma-Aldrich | 330760 | |
| MMP-cleavable dithiol crosslinker peptide (Ac-GCRDGPQGIWGQDRCG-NH2) | GenScript | N/A | |
| 5-Norbornene-2-methylamine | TCI-Chemicals | 95-10-3 | For HA-NB synthesis |
| Packing tape | Scotch | 3M 1426 | |
| Parafilm | Bemis | PM996 | |
| PEG(thiol)2 | JenKem Technology USA | A4001-1 | For synthesis of fluorescently-labeled tetrazine |
| Penicillin-Streptomycin, 10,000 units/mL | Thermo Fisher Scientific | 15140122 | For D1 cell culture |
| Petri dish, polystyrene, disposable, Dia. x H=150 x 15 mm | Corning | 351058 | |
| Pluronic F-127 | Sigma-Aldrich | P2443 | For washing HMPs |
| Phosphate buffered saline (PBS) 1x | Gibco | 10010023 | |
| RainX water repellent glass treatment | Grainger | 465D20 | Synthetic hydrophobic treatment solution for microfluidic device treatment |
| RGD peptide (Ac-RGDSPGERCG-NH2) | GenScript | N/A | |
| Rubber bands | Staples | 112417 | |
| Sodium chloride | Chem-Impex | 30070 | For dialysis |
| Span 80 for synthesis | Sigma-Aldrich | 1338-43-8 | |
| Sylgard 184 Silicone Elastomer | Electron Microscopy Science | 4019862 | polydimethylsiloxane (PDMS) elastomer for making microfluidic devices and tissue culture devices |
| Syringe filter, Whatman Uniflo, 0.2 μm PES, 13 mm diameter | Cytvia | 09-928-066 | |
| Tetraview LCD digital microscope | Celestron | 44347 | |
| Tetrazine-amine HCl salt | Chem-Impex | 35098 | For HA-Tet synthesis |
| Triethylamine | Sigma-Aldrich | 471283 | For synthesis of fluorescently-labeled tetrazine |
| Tris(2-carboxyethyl)phosphine (TCEP) | Millipore Sigma | 51805-45-9 | |
| Triton X-100 | VWR | 97063-864 | |
| Trypan blue solution, 0.4% | Thermo Fisher Scientific | 15250061 | |
| Trypsin EDTA (0.25%), Phenol red | Fisher Scientific | 25-200-056 | For lifting adherent cells to seed in MAP gels |
| Tygon ND-100-80 Non-DEHP Medical Tubing, Needle Gauge=23, Wall Thickness=0.020 in, Internal diameter = 0.020, Outer diameter = 0.060 in | Thomas Scientific | 1204G82 | |
| UV curing system controller, LX500 LED | OmniCure | 010-00369R | |
| UV curing head, LED spot UV | OmniCure | N/A | |
| UV light meter, Traceable | VWR | 61161-386 | |
| Vacuum dessicator | Bel-Art | 08-594-15C | |
| X-Acto Z Series Precision Utility Knife | Elmer's | XZ3601W |
Riferimenti
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