שליטה בשבר חלקיקים בפיגומי חלקיקים מחושלים מיקרו-נקבוביים עבור תרבית תאים תלת-ממדית
Summary
מזעור השונות בשבר החלקיקים בתוך פיגומים גרעיניים מקל על ניסויים הניתנים לשחזור. עבודה זו מתארת שיטות ליצירת פיגומים גרעיניים עם שברי חלקיקים מבוקרים עבור יישומים של הנדסת רקמות במבחנה .
Abstract
מיקרו-ג’לים הם אבני הבניין של פיגומי חלקיקים חישוליים מיקרו-נקבוביים (MAP), המשמשים הן לתרבית תאים במבחנה והן לתיקון רקמות in vivo . בפיגומים גרעיניים אלה, הנקבוביות המולדת הנוצרת על ידי החלל הריק בין המיקרו-ג’לים מאפשרת חדירה ונדידה של תאים. שליטה בשבר הריק ובשבר החלקיקים היא קריטית לתכנון פיגומי MAP, שכן נקבוביות היא רמז ביו-אקטיבי לתאים. מיקרוג’לים כדוריים יכולים להיווצר על מכשיר מיקרופלואידי לגודל וצורה מבוקרים ולאחר מכן מיובשים בהקפאה בשיטות המונעות שבירה של רשת הפולימרים. עם התייבשות, המיקרו-ג’לים הליופיליים מובילים לשברי חלקיקים מבוקרים בפיגומי MAP. היישום של שיטות אלה עבור ליופיליזציה של מיקרוג’ל הוביל למחקרים הניתנים לשחזור המראים את ההשפעה של שבר חלקיקים על דיפוזיה של מקרומולקולות והתפשטות תאים. הפרוטוקול הבא יכסה ייצור, ליופיליזציה והתייבשות של מיקרוג’לים לשליטה בשבר חלקיקים בפיגומי MAP, כמו גם חישול המיקרוג’לים באמצעות הצלבה ביו-אורתוגונלית עבור תרבית תאים תלת-ממדית במבחנה.
Introduction
פיגומי חלקיקים חישוליים מיקרו-נקבוביים (MAP) הם תת-מחלקה של חומרים גרגיריים שבהם אבני הבניין של המיקרוג’ל (μgel) קשורות זו בזו ליצירת פיגום נקבובי בתפזורת. עם המיקרו-ארכיטקטורה הייחודית של פיגומים גרעיניים אלה, הנקבוביות המולדת שנוצרת על ידי החלל הריק בין מיקרוג’ל כדורי מקושר תומכת בחדירה מואצת של תאים ובנדידה1. ניתן לייצר את אבני הבניין של מיקרוג’ל של פיגומי MAP מפולימרים סינתטיים וטבעיים עם שינויים כימיים2. השיטות המתוארות כאן מדגישות באופן ספציפי את השימוש במיקרוג’לים המורכבים מעמוד שדרה של חומצה היאלורונית (HA) המותאם עם ידיות נורבורן פונקציונליות (NB). הידית הפונקציונלית NB בפולימר HA תומכת בתגובות כימיה של קליקים ליצירת מיקרו-ג’לים וקישורם יחד ליצירת פיגומי MAP 3,4. נעשה שימוש בסכמות רבות לקישור המיקרו-ג’לים זה לזה (כלומר, חישול), כגון תגובות אנזימטיות1, 5,6 מבוססות אור וכימיה של קליקים ללא תוספים 3,7 תגובות. כימיה של קליקים ללא תוספים מתוארת בעבודה זו, תוך שימוש בדרישת האלקטרונים ההופכית טטרזין-נורבורן Diels-Alder לחיבור המיקרו-ג’לים של HA-NB.
כדי לייצר פיגומי MAP, המשתמשים מייצרים תחילה את אבני הבניין של המיקרוג’ל באמצעות אמולסיות הפוכות במערכות אצווה או בתוך התקנים מיקרופלואידיים, כמו גם עם ריסוס אלקטרוהידרודינמי, ליתוגרפיה או פיצול מכני2. הייצור של מיקרוג’לים כדוריים HA-NB תואר היטב ודווח בעבר באמצעות תחליב אצווה2 וטכניקות יצירת טיפות מיקרופלואידיות 8,9,10,11. בעבודה זו, מיקרו-ג’לים כדוריים של HA-NB נוצרו על פלטפורמה מיקרופלואידית ממוקדת זרימה עבור גודל וצורה מבוקרים, כפי שתואר קודם לכן 8,9,10. לאחר הטיהור, המיקרוג’לים קיימים בתרחיף מימי ויש לרכז אותם כדי לגרום למצב תקוע. כאשר הם תקועים, מיקרו-ג’לים מפגינים תכונות של דילול גזירה, המאפשרות להם לתפקד כחומרים הניתנים להזרקה וממלאי חלל1. אחת השיטות להשראת מצב תקוע היא לייבש את המיקרוג’לים באמצעות ליופיליזציה, או ייבוש בהקפאה, ולאחר מכן לייבש מחדש את המוצר המיובש בנפחמבוקר 12. לחלופין, ניתן להסיר את עודפי החיץ מהמיקרוג’ל באמצעות צנטריפוגה מעל מסננת או עם הסרה ידנית של החיץ מכדור המיקרוג’ל על ידי שאיפה או באמצעות חומר סופג. עם זאת, שימוש בצנטריפוגה לייבוש המיקרוג’לים יכול ליצור טווח משתנה מאוד של שברי חלקיקים ושברים ריקים בעת יצירת פיגומים גרעיניים12. טכניקות לליופיליזציה של מיקרוג’לים תוארו באמצעות 70% IPA עבור מיקרו-ג’לים מפוליאתילן גליקול (PEG)13, שמנים פלואורים עבור מיקרו-ג’ל ג’לטין מתקרילויל (GelMa) 14, ו-70% אתנול עבור מיקרו-ג’לים מסוג HA12. פרוטוקול זה מדגיש שיטות לייבוש מיקרו-ג’ל HA כדורי בייבוש בהקפאה באמצעות 70% אתנול, מגיב מעבדה סטנדרטי, כדי לשמור על תכונות המיקרוג’ל המקוריות במהלך תהליך הייבוש. ניתן לשקול ולייבש את המיקרו-ג’לים של HA המיובשים בהקפאה ולייבש אותם מחדש באחוזי משקל המוגדרים על-ידי המשתמש כדי לשלוט בשברי החלקיקים הסופיים בפיגומי MAP12.
השלב האחרון ביצירת פיגומים MAP מסתמך על חישול המיקרוג’לים ליצירת פיגום נקבוביבתפזורת 1. על ידי שימוש ברכיבי מטריצה חוץ-תאית מקוריים ושימוש בסכמות חישול ביו-אורתוגונליות, פיגומי MAP משמשים כפלטפורמה תואמת ביולוגית הן לתרבית תאים במבחנה והן לתיקון רקמות in vivo 3. באמצעות גישות אלה, ניתן לייצר פיגומי MAP מאבני בניין HA-NB עם שברי חלקיקים המוגדרים על ידי המשתמש לצורך העסקתם ביישומי הנדסת רקמות12. הפרוטוקול הבא מתאר את הייצור המיקרופלואידי של מיקרו-ג’לים HA-NB ולאחר מכן ליופיליזציה והתייבשות לשליטה בשבר חלקיקים בפיגומי MAP. לבסוף, שלבים לחישול המיקרוג’לים מתוארים באמצעות כימיה ביו-אורתוגונלית לניסויים בתרביות תאים תלת-ממדיות במבחנה .
Protocol
Representative Results
Discussion
ייצור מיקרופלואידי של מיקרו-ג’לים HA-NB הוכח כמייצר מיקרו-ג’לים עם טווח צר יותר של התפלגות גודל מאשר ייצור אצווה תחליב 3,9. המיקרו-ג’לים המתוארים בפרוטוקול זה פותחו באמצעות קרוסלינקר הניתן לחיתוך MMP (Ac-GCRDGPQGIWGQDRCG-NH2) כדי לתמוך בפירוק חומרים. עם זאת, מיקרו-ג’לי?…
Divulgazioni
The authors have nothing to disclose.
Acknowledgements
המחברים רוצים להודות למכונים הלאומיים לבריאות, למכונים הלאומיים להפרעות נוירולוגיות ושבץ (1R01NS112940, 1R01NS079691, R01NS094599), ולמכון הלאומי לאלרגיה ומחלות זיהומיות (1R01AI152568). עבודה זו בוצעה בחלקה במתקן מכשור החומרים המשותפים של אוניברסיטת דיוק (SMIF), חבר ברשת הננוטכנולוגיה משולשת המחקר של צפון קרוליינה (RTNN), הנתמכת על ידי הקרן הלאומית למדע (מספר פרס ECCS-2025064) כחלק מהתשתית הלאומית המתואמת לננוטכנולוגיה (NNCI). המחברים רוצים להודות לפוסט-דוקטורנט לשעבר של המעבדה, ד”ר לוקאס שירמר, כמו גם לאית’ן ניקלו על עזרתם ביצירת המכשיר המודפס בתלת-ממד לניסויים בתרביות תאים.
Materials
| 1 mL Luer-Lok syringe sterile, single use, polycarbonate | BD | 309628 | |
| 5 mL Luer-Lok syringe sterile, single use, polycarbonate | BD | 309646 | |
| Alexa Fluor 488 C5 maleimide | Invitrogen | A10254 | For synthesis of fluorescently-labeled tetrazine |
| Alexa Fluor 647 Phalloidin | Invitrogen | A22287 | For staining cell culture samples |
| Aluminum foil | VWR | 89107-726 | |
| Biopsy punch with plunger, 1.0 mm | Integra Miltex | 69031-01 | |
| Biopsy punch, 4 mm | Integra Miltex | 33-34 | |
| Blunt needle, 23 G 0.5", Non-Sterile, Capped | SAI Infusion Technologies | B23-50 | |
| Bottle-top vacuum filter, 0.22 μm | Corning | CLS430521 | |
| Calcium chloride | VWR | 1B1110 | For microgel washing buffer |
| Capillary-piston assemblies for positive-displacement pipettes, 1000 μL max. volume | Rainin | 17008609 | |
| Capillary-piston assemblies for positive-displacement pipettes, 25 μL max. volume | Rainin | 17008605 | |
| Capillary-piston assemblies for positive-displacement pipettes, 250 μL max. volume | Rainin | 17008608 | |
| Countess Cell Counting Chamber Slides | Invitrogen | C10228 | |
| Countess II FL Automated Cell Counter | Invitrogen | AMQAF1000 | |
| Centrifuge tube, 15 mL | CELLTREAT | 667015B | |
| Centrifuge tube, 50 mL | CELLTREAT | 229421 | |
| Chloroform, ACS grade, Glass Bottle | Stellar Scientific | CP-C7304 | For synthesis of fluorescently-labeled tetrazine |
| Corona plasma gun, BD-10A High Frequency Generator | ETP | 11011 | |
| CryoTube Vials, Polypropylene, Internal Thread with Screw Cap | Nunc | 368632 | |
| D1 mouse mesenchymal cells | ATCC | CRL-12424 | Example cell line for culture in MAP gels |
| DAPI | Sigma-Aldrich | D9542 | For staining cell culture samples |
| Deuterium oxide, 99.9 atom% D | Sigma-Aldrich | 151882 | For NMR spectroscopy |
| Dialysis tubing, regenerated cellulose membrane, 12-14 kDa molecular weight cut-off | Spectra/Por | 132703 | For purifying HA-NB and HA-Tet |
| Diethyl ether | VWR | BDH1121-4LPC | For synthesis of fluorescently-labeled tetrazine |
| Dimethylformamide | Sigma-Aldrich | 277056 | For synthesis of fluorescently-labeled tetrazine |
| 4-(4,6-dimethoxy-1,3,5-triazin-2-yl)-4-methylmorpholinium chloride (DMTMM) | TCI-Chemicals | D2919 | For modifying HA |
| Dithiothreitol (DTT) | Thermo Scientific | R0861 | Non-degradable dithiol linker (substitute for MMP-cleavable peptide) |
| Dulbecco's Modified Eagle's Medium (DMEM), high glucose, w/ 4500 mg/L glucose, L-glutamine, sodium pyruvate, and sodium bicarbonate, liquid, sterile-filtered, suitable for cell culture | Sigma-Aldrich | D6429-500ML | For D1 cell culture |
| EMS Paraformaldehyde, Granular | VWR | 100504-162 | For making 4% PFA |
| Ethanol absolute (200 proof) | KOPTEC | 89234-850 | |
| Fetal bovine serum (FBS) | ATCC | 30-2020 | For D1 cell culture |
| Heating Plate | Kopf Instruments | HP-4M | |
| Hemacytometer with coverglass | Daigger Scientific | EF16034F | |
| 2-[4-(2-hydroxyethyl)piperazin-1-yl]ethanesulfonic acid (HEPES) | Sigma-Aldrich | H3375 | |
| Sodium hyaluronate, 79 kDa average molecular weight, produced in bacteria Streptococcus zooepidemicus, pharmaceutical grade, microbial contamination <100 CFU/g, bacterial endotoxins <0.050 IU/mg | Contipro | N/A | 79 kDa average molecular weight was used for HA-Tet synthesis, but these methods could be adapted for other molecular weights. |
| IMARIS Essentials software package | Oxford Instruments | N/A | Microscopy image analysis software |
| Infusion pump, dual syringe | Chemyx | N/A | |
| Kimwipe | Kimberly-Clark | 34120 | |
| Laboratory stand with support lab clamp | Geyer | 212100 | |
| Liquid nitrogen | Airgas | NI 180LT22 | |
| Lithium Phenyl(2,4,6-trimethylbenzoyl)phosphinate | TCI-Chemicals | L0290 | |
| Lyophilizer | Labconco | N/A | Labconco FreeZone 6 plus has been discontinued, but other lab grade console freeze dryers could be used for this protocol. |
| Methyltetrazine-PEG4-maleimide | Kerafast | FCC210 | For synthesis of fluorescently-labeled tetrazine |
| 2-(4-Morpholino)ethane Sulfonic Acid (MES) | Fisher Scientific | BP300-100 | For modifying HA |
| Micro cover glass, 24 x 60 mm No. 1 | VWR | 48393-106 | |
| Microfluidic device SU8 master wafer | FlowJem | Custom design made either in-house in clean room or outsourced | |
| Mineral oil, heavy | Sigma-Aldrich | 330760 | |
| MMP-cleavable dithiol crosslinker peptide (Ac-GCRDGPQGIWGQDRCG-NH2) | GenScript | N/A | |
| 5-Norbornene-2-methylamine | TCI-Chemicals | 95-10-3 | For HA-NB synthesis |
| Packing tape | Scotch | 3M 1426 | |
| Parafilm | Bemis | PM996 | |
| PEG(thiol)2 | JenKem Technology USA | A4001-1 | For synthesis of fluorescently-labeled tetrazine |
| Penicillin-Streptomycin, 10,000 units/mL | Thermo Fisher Scientific | 15140122 | For D1 cell culture |
| Petri dish, polystyrene, disposable, Dia. x H=150 x 15 mm | Corning | 351058 | |
| Pluronic F-127 | Sigma-Aldrich | P2443 | For washing HMPs |
| Phosphate buffered saline (PBS) 1x | Gibco | 10010023 | |
| RainX water repellent glass treatment | Grainger | 465D20 | Synthetic hydrophobic treatment solution for microfluidic device treatment |
| RGD peptide (Ac-RGDSPGERCG-NH2) | GenScript | N/A | |
| Rubber bands | Staples | 112417 | |
| Sodium chloride | Chem-Impex | 30070 | For dialysis |
| Span 80 for synthesis | Sigma-Aldrich | 1338-43-8 | |
| Sylgard 184 Silicone Elastomer | Electron Microscopy Science | 4019862 | polydimethylsiloxane (PDMS) elastomer for making microfluidic devices and tissue culture devices |
| Syringe filter, Whatman Uniflo, 0.2 μm PES, 13 mm diameter | Cytvia | 09-928-066 | |
| Tetraview LCD digital microscope | Celestron | 44347 | |
| Tetrazine-amine HCl salt | Chem-Impex | 35098 | For HA-Tet synthesis |
| Triethylamine | Sigma-Aldrich | 471283 | For synthesis of fluorescently-labeled tetrazine |
| Tris(2-carboxyethyl)phosphine (TCEP) | Millipore Sigma | 51805-45-9 | |
| Triton X-100 | VWR | 97063-864 | |
| Trypan blue solution, 0.4% | Thermo Fisher Scientific | 15250061 | |
| Trypsin EDTA (0.25%), Phenol red | Fisher Scientific | 25-200-056 | For lifting adherent cells to seed in MAP gels |
| Tygon ND-100-80 Non-DEHP Medical Tubing, Needle Gauge=23, Wall Thickness=0.020 in, Internal diameter = 0.020, Outer diameter = 0.060 in | Thomas Scientific | 1204G82 | |
| UV curing system controller, LX500 LED | OmniCure | 010-00369R | |
| UV curing head, LED spot UV | OmniCure | N/A | |
| UV light meter, Traceable | VWR | 61161-386 | |
| Vacuum dessicator | Bel-Art | 08-594-15C | |
| X-Acto Z Series Precision Utility Knife | Elmer's | XZ3601W |
Riferimenti
- Griffin, D. R., Weaver, W. M., Scumpia, P. O., Di Carlo, D., Segura, T. Accelerated wound healing by injectable microporous gel scaffolds assembled from annealed building blocks. Nature Materials. 14 (7), 737-744 (2015).
- Daly, A. C., Riley, L., Segura, T., Burdick, J. A. Hydrogel microparticles for biomedical applications. Nature Reviews Materials. 5 (1), 20-43 (2020).
- Darling, N. J., et al. Click by click Microporous Annealed Particle (MAP) scaffolds. Advanced Healthcare Materials. 9 (10), 1901391 (2020).
- Truong, N. F., et al. Microporous annealed particle hydrogel stiffness, void space size, and adhesion properties impact cell proliferation, cell spreading, and gene transfer. Acta Biomaterialia. 94, 160-172 (2020).
- Pfaff, B. N., et al. Selective and improved photoannealing of Microporous Annealed Particle (MAP) scaffolds. ACS Biomaterials Science & Engineering. 7 (2), 422-427 (2021).
- Sideris, E., et al. Particle hydrogels based on hyaluronic acid building blocks. ACS Biomaterials Science & Engineering. 2 (11), 2034-2041 (2016).
- Caldwell, A. S., Campbell, G. T., Shekiro, K. M. T., Anseth, K. S. Clickable microgel scaffolds as platforms for 3D cell encapsulation. Advanced Healthcare Materials. 6 (15), 1700254 (2017).
- Qazi, T. H., et al. Anisotropic rod-shaped particles influence injectable granular hydrogel properties and cell invasion. Advanced Materials. 34 (12), 2109194 (2022).
- Wilson, K. L., et al. Stoichiometric post modification of hydrogel microparticles dictates neural stem cell fate in microporous annealed particle scaffolds. Advanced Materials. 34 (33), 2201921 (2022).
- Muir, V. G., Qazi, T. H., Shan, J., Groll, J., Burdick, J. A. Influence of microgel fabrication technique on granular hydrogel properties. ACS Biomaterials Science & Engineering. 7 (9), 4269-4281 (2021).
- Highley, C. B., Song, K. H., Daly, A. C., Burdick, J. A. Jammed microgel inks for 3D printing applications. Advanced Science. 6 (1), 1801076 (2018).
- Anderson, A. R., Nicklow, E., Segura, T. Particle fraction as a bioactive cue in granular scaffolds. Acta Biomaterialia. 150, 111-127 (2022).
- Pruett, L., Ellis, R., McDermott, M., Roosa, C., Griffin, D. R. Spatially heterogeneous epidermal growth factor release from microporous annealed particle (MAP) hydrogel for improved wound closure. Journal of Materials Chemistry B. 9 (35), 7132-7139 (2021).
- Sheikhi, A., et al. Microengineered emulsion-to-powder technology for the high-fidelity preservation of molecular, colloidal, and bulk properties of hydrogel suspensions. ACS Applied Polymer Materials. 1 (8), 1935-1941 (2019).
- Brower, K., White, A. K., Fordyce, P. M. Multi-step variable height photolithography for valved multilayer microfluidic devices. Journal of Visualized Experiments. (119), e55276 (2017).
- JoVE. Nuclear Magnetic Resonance (NMR) Spectroscopy. JoVE Science Education Database. Organic Chemistry. JoVE. , (2022).
- Roosa, C., et al. Microfluidic synthesis of microgel building blocks for microporous annealed particle scaffold. Journal of Visualized Experiments. (184), e64119 (2022).
- Zhang, H., Dicker, K. T., Xu, X., Jia, X., Fox, J. M. Interfacial bioorthogonal crosslinking. ACS Macro Letters. 3 (8), 727-731 (2014).
- Welzel, P. B., et al. Cryogel micromechanics unraveled by atomic force microscopy-based nanoindentation. Advanced Healthcare Materials. 3 (11), 1849-1853 (2014).
- Plieva, F., Huiting, X., Galaev, I. Y., Bergenståhl, B., Mattiasson, B. Macroporous elastic polyacrylamide gels prepared at subzero temperatures: control of porous structure. Journal of Materials Chemistry. 16 (41), 4065-4073 (2006).
- Rommel, D., et al. Functionalized microgel rods interlinked into soft macroporous structures for 3D cell culture. Advanced Science. 9 (10), 2103554 (2022).
- Kurt, E., Segura, T. Nucleic acid delivery from granular hydrogels. Advanced Healthcare Materials. 11 (3), 2101867 (2021).
- Isaac, A., et al. Microporous bio-orthogonally annealed particle hydrogels for tissue engineering and regenerative medicine. ACS Biomaterials Science & Engineering. 5 (12), 6395-6404 (2019).
- Truong, N. F., Lesher-Pérez, S. C., Kurt, E., Segura, T. Pathways governing polyethylenimine polyplex transfection in Microporous Annealed Particle scaffolds. Bioconjugate Chemistry. 30 (2), 476-486 (2019).
- Koh, J., et al. Enhanced in vivo delivery of stem cells using microporous annealed particle scaffolds. Small. 15 (39), 1903147 (2019).
- Li, F., et al. Cartilage tissue formation through assembly of microgels containing mesenchymal stem cells. Acta Biomaterialia. 77, 48-62 (2018).
