Deeltjesfractie regelen in microporeuze gegloeide deeltjessteigers voor 3D-celcultuur
Summary
Het minimaliseren van de variabiliteit in de deeltjesfractie binnen korrelige steigers vergemakkelijkt reproduceerbare experimenten. Dit werk beschrijft methoden voor het genereren van granulaire steigers met gecontroleerde deeltjesfracties voor in vitro weefselmanipulatietoepassingen.
Abstract
Microgels zijn de bouwstenen van microporeuze gegloeide deeltjes (MAP) steigers, die dienen als een platform voor zowel in vitro celkweek als in vivo weefselherstel. In deze korrelige steigers maakt de aangeboren porositeit die wordt gegenereerd door de lege ruimte tussen microgels celinfiltratie en migratie mogelijk. Het regelen van de leegtefractie en deeltjesfractie is van cruciaal belang voor het ontwerp van map-steigers, omdat porositeit een bioactieve aanwijzing is voor cellen. Sferische microgels kunnen worden gegenereerd op een microfluïdisch apparaat voor gecontroleerde grootte en vorm en vervolgens gevriesdroogd met behulp van methoden die breuk van het polymeernetwerk voorkomen. Bij rehydratatie leiden de gelyofiliseerde microgels tot gecontroleerde deeltjesfracties in MAP-steigers. De implementatie van deze methoden voor microgellyofilisatie heeft geleid tot reproduceerbare studies die het effect van deeltjesfractie op macromolecuuldiffusie en celverspreiding aantonen. Het volgende protocol zal betrekking hebben op de fabricage, lyofilisatie en rehydratatie van microgels voor het beheersen van deeltjesfracties in MAP-steigers, evenals het gloeien van de microgels door middel van bio-orthogonale crosslinking voor 3D-celkweek in vitro.
Introduction
Microporeuze gegloeide deeltjes (MAP) steigers zijn een subklasse van korrelige materialen waarin de microgel (μgel) bouwstenen met elkaar verbonden zijn om een bulk, poreuze steiger te vormen. Met de unieke microarchitectuur van deze korrelige steigers ondersteunt de aangeboren porositeit die wordt gegenereerd door de lege ruimte tussen onderling verbonden bolvormige microgel versnelde celinfiltratie en migratie1. De microgel bouwstenen van MAP steigers kunnen worden vervaardigd uit zowel synthetische als natuurlijke polymeren met chemische modificaties2. De hier beschreven methoden benadrukken specifiek het gebruik van microgels bestaande uit een hyaluronzuur (HA) ruggengraat gemodificeerd met functionele norborneen (NB) handgrepen. De NB functionele handgreep op het HA-polymeer ondersteunt klikchemiereacties voor het vormen van microgels en het aan elkaar koppelen om MAP-steigers 3,4 te genereren. Er zijn talloze schema’s gebruikt om de microgels aan elkaar te koppelen (d.w.z. gloeien), zoals enzymatische1, op licht gebaseerde 5,6 en additiefvrije klikchemie 3,7-reacties. Additiefvrije klikchemie wordt in dit werk beschreven, met behulp van de tetrazine-norborneen inverse elektronenvraag Diels-Alder conjugatie voor het onderling verbinden van de HA-NB microgels.
Om MAP-steigers te fabriceren, genereren gebruikers eerst de microgel-bouwstenen met behulp van omgekeerde emulsies in batchsystemen of in microfluïdische apparaten, evenals met elektrohydrodynamisch spuiten, lithografie of mechanische fragmentatie2. De productie van bolvormige HA-NB microgels is goed beschreven en eerder gerapporteerd met behulp van zowel batch-emulsie2 als microfluïdische druppelgeneratietechnieken 8,9,10,11. In dit werk werden bolvormige HA-NB microgels gegenereerd op een flow-focussend microfluïdisch platform voor gecontroleerde grootte en vorm, zoals eerder beschreven 8,9,10. Na zuivering bestaan de microgels in een waterige suspensie en moeten ze worden geconcentreerd om een vastgelopen toestand te induceren. Wanneer ze vastzitten, vertonen microgels afschuifverdunnende eigenschappen, waardoor ze kunnen functioneren als injecteerbare, ruimtevullende materialen1. Een methode om een vastgelopen toestand te induceren, is om de microgels te drogen via lyofilisatie of vriesdrogen en vervolgens het gedroogde product opnieuw te hydrateren in een gecontroleerd volume12. Als alternatief kan overtollige buffer uit de microgel-slurry worden verwijderd via centrifugatie over een zeef of met handmatige verwijdering van de buffer uit de microgelpellet, hetzij door aspiratie of met behulp van een absorberend materiaal. Het gebruik van centrifugatie om de microgels te drogen kan echter een zeer variabel bereik van deeltjesfracties en lege fracties genereren bij het maken van korrelige steigers12. Technieken voor het lyofiliseren van microgels zijn beschreven met behulp van 70% IPA voor polyethyleenglycol (PEG) microgels13, gefluoreerde oliën voor gelatine methacryloyl (GelMa) microgels14 en 70% ethanol voor HA-microgels12. Dit protocol belicht methoden voor het vriesdrogen van bolvormige HA-microgels met behulp van 70% ethanol, een standaard laboratoriumreagens, om de oorspronkelijke microgel-eigenschappen tijdens het droogproces te behouden. De gevriesdroogde HA-microgels kunnen worden gewogen en gerehydrateerd met door de gebruiker gedefinieerde gewichtspercentages om de uiteindelijke deeltjesfracties in MAP-steigerste regelen 12.
De laatste stap in map-steigervorming is afhankelijk van het gloeien van de microgels om een bulk, poreuze steiger te creëren1. Door gebruik te maken van inheemse extracellulaire matrixcomponenten en bio-orthogonale gloeischema’s te gebruiken, dienen MAP-steigers als een biocompatibel platform voor zowel in vitro celkweek als in vivo weefselherstel3. Door deze benaderingen kunnen MAP-steigers worden vervaardigd uit HA-NB-bouwstenen met door de gebruiker gedefinieerde deeltjesfracties voor hun gebruik in tissue engineering-toepassingen12. Het volgende protocol beschrijft de microfluïdische productie van HA-NB microgels gevolgd door lyofilisatie en rehydratatie voor het regelen van deeltjesfracties in MAP-steigers. Ten slotte worden stappen voor het gloeien van de microgels beschreven met behulp van bio-orthogonale chemie voor in vitro 3D-celkweekexperimenten.
Protocol
Representative Results
Discussion
Van microfluïdische productie van HA-NB-microgels is aangetoond dat microgels worden gegenereerd met een smallere grootteverdeling dan emulsiebatchproductie 3,9. De microgels die in dit protocol worden beschreven, zijn geformuleerd met behulp van een MMP-splitsbare crosslinker (Ac-GCRDGPQGIWGQDRCG-NH2) om materiaaldegradatie te ondersteunen. HA-NB microgels kunnen echter ook worden verknoopt met behulp van een alternatieve di-thiol linker zoals dithi…
Divulgazioni
The authors have nothing to disclose.
Acknowledgements
De auteurs willen de National Institutes of Health, de National Institutes of Neurological Disorders and Stroke (1R01NS112940, 1R01NS079691, R01NS094599) en het National Institute of Allergy and Infectious Disease (1R01AI152568) bedanken. Dit werk werd gedeeltelijk uitgevoerd in de Duke University Shared Materials Instrumentation Facility (SMIF), een lid van het North Carolina Research Triangle Nanotechnology Network (RTNN), dat wordt ondersteund door de National Science Foundation (awardnummer ECCS-2025064) als onderdeel van de National Nanotechnology Coordinated Infrastructure (NNCI). De auteurs willen de voormalige postdoc van het lab, Dr. Lucas Schirmer, evenals Ethan Nicklow bedanken voor hun hulp bij het genereren van het 3D-geprinte apparaat voor celkweekexperimenten.
Materials
| 1 mL Luer-Lok syringe sterile, single use, polycarbonate | BD | 309628 | |
| 5 mL Luer-Lok syringe sterile, single use, polycarbonate | BD | 309646 | |
| Alexa Fluor 488 C5 maleimide | Invitrogen | A10254 | For synthesis of fluorescently-labeled tetrazine |
| Alexa Fluor 647 Phalloidin | Invitrogen | A22287 | For staining cell culture samples |
| Aluminum foil | VWR | 89107-726 | |
| Biopsy punch with plunger, 1.0 mm | Integra Miltex | 69031-01 | |
| Biopsy punch, 4 mm | Integra Miltex | 33-34 | |
| Blunt needle, 23 G 0.5", Non-Sterile, Capped | SAI Infusion Technologies | B23-50 | |
| Bottle-top vacuum filter, 0.22 μm | Corning | CLS430521 | |
| Calcium chloride | VWR | 1B1110 | For microgel washing buffer |
| Capillary-piston assemblies for positive-displacement pipettes, 1000 μL max. volume | Rainin | 17008609 | |
| Capillary-piston assemblies for positive-displacement pipettes, 25 μL max. volume | Rainin | 17008605 | |
| Capillary-piston assemblies for positive-displacement pipettes, 250 μL max. volume | Rainin | 17008608 | |
| Countess Cell Counting Chamber Slides | Invitrogen | C10228 | |
| Countess II FL Automated Cell Counter | Invitrogen | AMQAF1000 | |
| Centrifuge tube, 15 mL | CELLTREAT | 667015B | |
| Centrifuge tube, 50 mL | CELLTREAT | 229421 | |
| Chloroform, ACS grade, Glass Bottle | Stellar Scientific | CP-C7304 | For synthesis of fluorescently-labeled tetrazine |
| Corona plasma gun, BD-10A High Frequency Generator | ETP | 11011 | |
| CryoTube Vials, Polypropylene, Internal Thread with Screw Cap | Nunc | 368632 | |
| D1 mouse mesenchymal cells | ATCC | CRL-12424 | Example cell line for culture in MAP gels |
| DAPI | Sigma-Aldrich | D9542 | For staining cell culture samples |
| Deuterium oxide, 99.9 atom% D | Sigma-Aldrich | 151882 | For NMR spectroscopy |
| Dialysis tubing, regenerated cellulose membrane, 12-14 kDa molecular weight cut-off | Spectra/Por | 132703 | For purifying HA-NB and HA-Tet |
| Diethyl ether | VWR | BDH1121-4LPC | For synthesis of fluorescently-labeled tetrazine |
| Dimethylformamide | Sigma-Aldrich | 277056 | For synthesis of fluorescently-labeled tetrazine |
| 4-(4,6-dimethoxy-1,3,5-triazin-2-yl)-4-methylmorpholinium chloride (DMTMM) | TCI-Chemicals | D2919 | For modifying HA |
| Dithiothreitol (DTT) | Thermo Scientific | R0861 | Non-degradable dithiol linker (substitute for MMP-cleavable peptide) |
| Dulbecco's Modified Eagle's Medium (DMEM), high glucose, w/ 4500 mg/L glucose, L-glutamine, sodium pyruvate, and sodium bicarbonate, liquid, sterile-filtered, suitable for cell culture | Sigma-Aldrich | D6429-500ML | For D1 cell culture |
| EMS Paraformaldehyde, Granular | VWR | 100504-162 | For making 4% PFA |
| Ethanol absolute (200 proof) | KOPTEC | 89234-850 | |
| Fetal bovine serum (FBS) | ATCC | 30-2020 | For D1 cell culture |
| Heating Plate | Kopf Instruments | HP-4M | |
| Hemacytometer with coverglass | Daigger Scientific | EF16034F | |
| 2-[4-(2-hydroxyethyl)piperazin-1-yl]ethanesulfonic acid (HEPES) | Sigma-Aldrich | H3375 | |
| Sodium hyaluronate, 79 kDa average molecular weight, produced in bacteria Streptococcus zooepidemicus, pharmaceutical grade, microbial contamination <100 CFU/g, bacterial endotoxins <0.050 IU/mg | Contipro | N/A | 79 kDa average molecular weight was used for HA-Tet synthesis, but these methods could be adapted for other molecular weights. |
| IMARIS Essentials software package | Oxford Instruments | N/A | Microscopy image analysis software |
| Infusion pump, dual syringe | Chemyx | N/A | |
| Kimwipe | Kimberly-Clark | 34120 | |
| Laboratory stand with support lab clamp | Geyer | 212100 | |
| Liquid nitrogen | Airgas | NI 180LT22 | |
| Lithium Phenyl(2,4,6-trimethylbenzoyl)phosphinate | TCI-Chemicals | L0290 | |
| Lyophilizer | Labconco | N/A | Labconco FreeZone 6 plus has been discontinued, but other lab grade console freeze dryers could be used for this protocol. |
| Methyltetrazine-PEG4-maleimide | Kerafast | FCC210 | For synthesis of fluorescently-labeled tetrazine |
| 2-(4-Morpholino)ethane Sulfonic Acid (MES) | Fisher Scientific | BP300-100 | For modifying HA |
| Micro cover glass, 24 x 60 mm No. 1 | VWR | 48393-106 | |
| Microfluidic device SU8 master wafer | FlowJem | Custom design made either in-house in clean room or outsourced | |
| Mineral oil, heavy | Sigma-Aldrich | 330760 | |
| MMP-cleavable dithiol crosslinker peptide (Ac-GCRDGPQGIWGQDRCG-NH2) | GenScript | N/A | |
| 5-Norbornene-2-methylamine | TCI-Chemicals | 95-10-3 | For HA-NB synthesis |
| Packing tape | Scotch | 3M 1426 | |
| Parafilm | Bemis | PM996 | |
| PEG(thiol)2 | JenKem Technology USA | A4001-1 | For synthesis of fluorescently-labeled tetrazine |
| Penicillin-Streptomycin, 10,000 units/mL | Thermo Fisher Scientific | 15140122 | For D1 cell culture |
| Petri dish, polystyrene, disposable, Dia. x H=150 x 15 mm | Corning | 351058 | |
| Pluronic F-127 | Sigma-Aldrich | P2443 | For washing HMPs |
| Phosphate buffered saline (PBS) 1x | Gibco | 10010023 | |
| RainX water repellent glass treatment | Grainger | 465D20 | Synthetic hydrophobic treatment solution for microfluidic device treatment |
| RGD peptide (Ac-RGDSPGERCG-NH2) | GenScript | N/A | |
| Rubber bands | Staples | 112417 | |
| Sodium chloride | Chem-Impex | 30070 | For dialysis |
| Span 80 for synthesis | Sigma-Aldrich | 1338-43-8 | |
| Sylgard 184 Silicone Elastomer | Electron Microscopy Science | 4019862 | polydimethylsiloxane (PDMS) elastomer for making microfluidic devices and tissue culture devices |
| Syringe filter, Whatman Uniflo, 0.2 μm PES, 13 mm diameter | Cytvia | 09-928-066 | |
| Tetraview LCD digital microscope | Celestron | 44347 | |
| Tetrazine-amine HCl salt | Chem-Impex | 35098 | For HA-Tet synthesis |
| Triethylamine | Sigma-Aldrich | 471283 | For synthesis of fluorescently-labeled tetrazine |
| Tris(2-carboxyethyl)phosphine (TCEP) | Millipore Sigma | 51805-45-9 | |
| Triton X-100 | VWR | 97063-864 | |
| Trypan blue solution, 0.4% | Thermo Fisher Scientific | 15250061 | |
| Trypsin EDTA (0.25%), Phenol red | Fisher Scientific | 25-200-056 | For lifting adherent cells to seed in MAP gels |
| Tygon ND-100-80 Non-DEHP Medical Tubing, Needle Gauge=23, Wall Thickness=0.020 in, Internal diameter = 0.020, Outer diameter = 0.060 in | Thomas Scientific | 1204G82 | |
| UV curing system controller, LX500 LED | OmniCure | 010-00369R | |
| UV curing head, LED spot UV | OmniCure | N/A | |
| UV light meter, Traceable | VWR | 61161-386 | |
| Vacuum dessicator | Bel-Art | 08-594-15C | |
| X-Acto Z Series Precision Utility Knife | Elmer's | XZ3601W |
Riferimenti
- Griffin, D. R., Weaver, W. M., Scumpia, P. O., Di Carlo, D., Segura, T. Accelerated wound healing by injectable microporous gel scaffolds assembled from annealed building blocks. Nature Materials. 14 (7), 737-744 (2015).
- Daly, A. C., Riley, L., Segura, T., Burdick, J. A. Hydrogel microparticles for biomedical applications. Nature Reviews Materials. 5 (1), 20-43 (2020).
- Darling, N. J., et al. Click by click Microporous Annealed Particle (MAP) scaffolds. Advanced Healthcare Materials. 9 (10), 1901391 (2020).
- Truong, N. F., et al. Microporous annealed particle hydrogel stiffness, void space size, and adhesion properties impact cell proliferation, cell spreading, and gene transfer. Acta Biomaterialia. 94, 160-172 (2020).
- Pfaff, B. N., et al. Selective and improved photoannealing of Microporous Annealed Particle (MAP) scaffolds. ACS Biomaterials Science & Engineering. 7 (2), 422-427 (2021).
- Sideris, E., et al. Particle hydrogels based on hyaluronic acid building blocks. ACS Biomaterials Science & Engineering. 2 (11), 2034-2041 (2016).
- Caldwell, A. S., Campbell, G. T., Shekiro, K. M. T., Anseth, K. S. Clickable microgel scaffolds as platforms for 3D cell encapsulation. Advanced Healthcare Materials. 6 (15), 1700254 (2017).
- Qazi, T. H., et al. Anisotropic rod-shaped particles influence injectable granular hydrogel properties and cell invasion. Advanced Materials. 34 (12), 2109194 (2022).
- Wilson, K. L., et al. Stoichiometric post modification of hydrogel microparticles dictates neural stem cell fate in microporous annealed particle scaffolds. Advanced Materials. 34 (33), 2201921 (2022).
- Muir, V. G., Qazi, T. H., Shan, J., Groll, J., Burdick, J. A. Influence of microgel fabrication technique on granular hydrogel properties. ACS Biomaterials Science & Engineering. 7 (9), 4269-4281 (2021).
- Highley, C. B., Song, K. H., Daly, A. C., Burdick, J. A. Jammed microgel inks for 3D printing applications. Advanced Science. 6 (1), 1801076 (2018).
- Anderson, A. R., Nicklow, E., Segura, T. Particle fraction as a bioactive cue in granular scaffolds. Acta Biomaterialia. 150, 111-127 (2022).
- Pruett, L., Ellis, R., McDermott, M., Roosa, C., Griffin, D. R. Spatially heterogeneous epidermal growth factor release from microporous annealed particle (MAP) hydrogel for improved wound closure. Journal of Materials Chemistry B. 9 (35), 7132-7139 (2021).
- Sheikhi, A., et al. Microengineered emulsion-to-powder technology for the high-fidelity preservation of molecular, colloidal, and bulk properties of hydrogel suspensions. ACS Applied Polymer Materials. 1 (8), 1935-1941 (2019).
- Brower, K., White, A. K., Fordyce, P. M. Multi-step variable height photolithography for valved multilayer microfluidic devices. Journal of Visualized Experiments. (119), e55276 (2017).
- JoVE. Nuclear Magnetic Resonance (NMR) Spectroscopy. JoVE Science Education Database. Organic Chemistry. JoVE. , (2022).
- Roosa, C., et al. Microfluidic synthesis of microgel building blocks for microporous annealed particle scaffold. Journal of Visualized Experiments. (184), e64119 (2022).
- Zhang, H., Dicker, K. T., Xu, X., Jia, X., Fox, J. M. Interfacial bioorthogonal crosslinking. ACS Macro Letters. 3 (8), 727-731 (2014).
- Welzel, P. B., et al. Cryogel micromechanics unraveled by atomic force microscopy-based nanoindentation. Advanced Healthcare Materials. 3 (11), 1849-1853 (2014).
- Plieva, F., Huiting, X., Galaev, I. Y., Bergenståhl, B., Mattiasson, B. Macroporous elastic polyacrylamide gels prepared at subzero temperatures: control of porous structure. Journal of Materials Chemistry. 16 (41), 4065-4073 (2006).
- Rommel, D., et al. Functionalized microgel rods interlinked into soft macroporous structures for 3D cell culture. Advanced Science. 9 (10), 2103554 (2022).
- Kurt, E., Segura, T. Nucleic acid delivery from granular hydrogels. Advanced Healthcare Materials. 11 (3), 2101867 (2021).
- Isaac, A., et al. Microporous bio-orthogonally annealed particle hydrogels for tissue engineering and regenerative medicine. ACS Biomaterials Science & Engineering. 5 (12), 6395-6404 (2019).
- Truong, N. F., Lesher-Pérez, S. C., Kurt, E., Segura, T. Pathways governing polyethylenimine polyplex transfection in Microporous Annealed Particle scaffolds. Bioconjugate Chemistry. 30 (2), 476-486 (2019).
- Koh, J., et al. Enhanced in vivo delivery of stem cells using microporous annealed particle scaffolds. Small. 15 (39), 1903147 (2019).
- Li, F., et al. Cartilage tissue formation through assembly of microgels containing mesenchymal stem cells. Acta Biomaterialia. 77, 48-62 (2018).
