Contrôle de la fraction de particules dans des échafaudages de particules microporeuses recuites pour culture cellulaire 3D
Summary
La minimisation de la variabilité de la fraction de particules dans les échafaudages granulaires facilite l’expérimentation reproductible. Ce travail décrit des méthodes de génération d’échafaudages granulaires avec des fractions de particules contrôlées pour des applications d’ingénierie tissulaire in vitro .
Abstract
Les microgels sont les éléments constitutifs des échafaudages de particules microporeuses recuites (MAP), qui servent de plate-forme à la fois pour la culture cellulaire in vitro et la réparation tissulaire in vivo . Dans ces échafaudages granulaires, la porosité innée générée par l’espace vide entre les microgels permet l’infiltration et la migration cellulaire. Le contrôle de la fraction vide et de la fraction particulaire est essentiel pour la conception d’échafaudages MAP, car la porosité est un signal bioactif pour les cellules. Les microgels sphériques peuvent être générés sur un dispositif microfluidique pour une taille et une forme contrôlées, puis lyophilisés à l’aide de méthodes empêchant la fracturation du réseau de polymères. Lors de la réhydratation, les microgels lyophilisés conduisent à des fractions de particules contrôlées dans les échafaudages MAP. La mise en œuvre de ces méthodes de lyophilisation sur microgel a conduit à des études reproductibles montrant l’effet de la fraction de particules sur la diffusion des macromolécules et la propagation cellulaire. Le protocole suivant couvrira la fabrication, la lyophilisation et la réhydratation de microgels pour contrôler la fraction de particules dans les échafaudages MAP, ainsi que le recuit des microgels par réticulation bio-orthogonale pour la culture cellulaire 3D in vitro.
Introduction
Les échafaudages à particules microporeuses recuites (MAP) sont une sous-classe de matériaux granulaires dans lesquels les blocs de construction en microgel (μgel) sont reliés entre eux pour former un échafaudage poreux en vrac. Avec la microarchitecture unique de ces échafaudages granulaires, la porosité innée générée par l’espace vide entre microgel sphérique interconnecté favorise l’infiltration cellulaire accélérée et la migration1. Les blocs de construction en microgel des échafaudages MAP peuvent être fabriqués à partir de polymères synthétiques et naturels avec des modifications chimiques2. Les méthodes décrites ici mettent spécifiquement en évidence l’utilisation de microgels composés d’un squelette d’acide hyaluronique (HA) modifié avec des poignées fonctionnelles de norbornène (NB). La poignée fonctionnelle NB sur le polymère HA supporte les réactions chimiques de clic pour former des microgels et les relier entre eux pour générer des échafaudages MAP 3,4. De nombreux schémas ont été utilisés pour relier les microgels entre eux (c’est-à-dire le recuit), tels que les réactions enzymatiques1, 5,6 à base de lumière et chimiques de clicsans additifs 3,7. La chimie du clic sans additif est décrite dans ce travail, en utilisant la conjugaison Diels-Alder à demande inverse tétrazine-norbornène pour interconnecter les microgels HA-NB.
Pour fabriquer des échafaudages MAP, les utilisateurs génèrent d’abord les blocs de construction de microgel en utilisant des émulsions inverses dans des systèmes discontinus ou dans des dispositifs microfluidiques, ainsi qu’avec la pulvérisation électrohydrodynamique, la lithographie ou la fragmentation mécanique2. La production de microgels sphériques HA-NB a été bien décrite et a déjà été rapportée à l’aide des techniques d’émulsiondiscontinue 2 et de génération de gouttelettes microfluidiques 8,9,10,11. Dans ce travail, des microgels sphériques HA-NB ont été générés sur une plate-forme microfluidique focalisant l’écoulement pour une taille et une forme contrôlées, comme décrit précédemment 8,9,10. Après purification, les microgels existent dans une suspension aqueuse et doivent être concentrés pour induire un état de coincement. Lorsqu’ils sont coincés, les microgels présentent des propriétés d’amincissement par cisaillement, ce qui leur permet de fonctionner comme des matériaux injectables qui remplissent l’espace1. Une méthode pour induire un état de bourrage consiste à sécher les microgels par lyophilisation, ou lyophilisation, puis à réhydrater ensuite le produit séché dans un volume contrôlé12. Alternativement, l’excès de tampon peut être éliminé de la boue de microgel par centrifugation sur une passoire ou par retrait manuel du tampon de la pastille de microgel, soit par aspiration, soit à l’aide d’un matériau absorbant. Cependant, l’utilisation de la centrifugation pour sécher les microgels peut générer une gamme très variable de fractions de particules et de fractions de vide lors de la fabrication d’échafaudages granulaires12. Des techniques de lyophilisation des microgels ont été décrites en utilisant 70% d’IPA pour les microgels de polyéthylène glycol (PEG)13, des huiles fluorées pour les microgels méthacryloyl (GelMa) 14 et 70% d’éthanol pour les microgels HA12. Ce protocole met en évidence des méthodes de lyophilisation de microgels HA sphériques utilisant de l’éthanol à 70%, un réactif de laboratoire standard, afin de conserver les propriétés originales du microgel pendant le processus de séchage. Les microgels HA lyophilisés peuvent être pesés et réhydratés à des pourcentages pondéraux définis par l’utilisateur pour contrôler les fractions de particules finales dans les échafaudages MAP12.
La dernière étape de la formation de l’échafaudage MAP repose sur le recuit des microgels pour créer un échafaudage poreux en vrac1. En utilisant des composants de matrice extracellulaire natifs et en utilisant des schémas de recuit bio-orthogonaux, les échafaudages MAP servent de plate-forme biocompatible pour la culture cellulaire in vitro et la réparation tissulaire in vivo 3. Grâce à ces approches, les échafaudages MAP peuvent être fabriqués à partir de blocs de construction HA-NB avec des fractions de particules définies par l’utilisateur pour leur utilisation dans des applications d’ingénierie tissulaire12. Le protocole suivant décrit la production microfluidique de microgels HA-NB suivie d’une lyophilisation et d’une réhydratation pour contrôler la fraction de particules dans les échafaudages MAP. Enfin, les étapes de recuit des microgels sont décrites à l’aide de la chimie bio-orthogonale pour des expériences de culture cellulaire 3D in vitro .
Protocol
Representative Results
Discussion
Il a été démontré que la production microfluidique de microgels HA-NB génère des microgels avec une gamme de distribution granulométrique plus étroite que la production par lots d’émulsion 3,9. Les microgels décrits dans ce protocole ont été formulés à l’aide d’un agent de réticulation clivable MMP (Ac-GCRDGPQGIWGQDRCG-NH2) pour soutenir la dégradation des matériaux. Cependant, les microgels HA-NB peuvent également être rétic…
Divulgazioni
The authors have nothing to disclose.
Acknowledgements
Les auteurs tiennent à remercier les National Institutes of Health, les National Institutes of Neurological Disorders and Stroke (1R01NS112940, 1R01NS079691, R01NS094599) et le National Institute of Allergy and Infectious Disease (1R01AI152568). Ce travail a été réalisé en partie au Duke University Shared Materials Instrumentation Facility (SMIF), membre du North Carolina Research Triangle Nanotechnology Network (RTNN), qui est soutenu par la National Science Foundation (numéro de prix ECCS-2025064) dans le cadre de la National Nanotechnology Coordinated Infrastructure (NNCI). Les auteurs tiennent à remercier l’ancien post-doctorant du laboratoire, le Dr Lucas Schirmer, ainsi qu’Ethan Nicklow, pour leur aide dans la génération du dispositif imprimé en 3D pour les expériences de culture cellulaire.
Materials
| 1 mL Luer-Lok syringe sterile, single use, polycarbonate | BD | 309628 | |
| 5 mL Luer-Lok syringe sterile, single use, polycarbonate | BD | 309646 | |
| Alexa Fluor 488 C5 maleimide | Invitrogen | A10254 | For synthesis of fluorescently-labeled tetrazine |
| Alexa Fluor 647 Phalloidin | Invitrogen | A22287 | For staining cell culture samples |
| Aluminum foil | VWR | 89107-726 | |
| Biopsy punch with plunger, 1.0 mm | Integra Miltex | 69031-01 | |
| Biopsy punch, 4 mm | Integra Miltex | 33-34 | |
| Blunt needle, 23 G 0.5", Non-Sterile, Capped | SAI Infusion Technologies | B23-50 | |
| Bottle-top vacuum filter, 0.22 μm | Corning | CLS430521 | |
| Calcium chloride | VWR | 1B1110 | For microgel washing buffer |
| Capillary-piston assemblies for positive-displacement pipettes, 1000 μL max. volume | Rainin | 17008609 | |
| Capillary-piston assemblies for positive-displacement pipettes, 25 μL max. volume | Rainin | 17008605 | |
| Capillary-piston assemblies for positive-displacement pipettes, 250 μL max. volume | Rainin | 17008608 | |
| Countess Cell Counting Chamber Slides | Invitrogen | C10228 | |
| Countess II FL Automated Cell Counter | Invitrogen | AMQAF1000 | |
| Centrifuge tube, 15 mL | CELLTREAT | 667015B | |
| Centrifuge tube, 50 mL | CELLTREAT | 229421 | |
| Chloroform, ACS grade, Glass Bottle | Stellar Scientific | CP-C7304 | For synthesis of fluorescently-labeled tetrazine |
| Corona plasma gun, BD-10A High Frequency Generator | ETP | 11011 | |
| CryoTube Vials, Polypropylene, Internal Thread with Screw Cap | Nunc | 368632 | |
| D1 mouse mesenchymal cells | ATCC | CRL-12424 | Example cell line for culture in MAP gels |
| DAPI | Sigma-Aldrich | D9542 | For staining cell culture samples |
| Deuterium oxide, 99.9 atom% D | Sigma-Aldrich | 151882 | For NMR spectroscopy |
| Dialysis tubing, regenerated cellulose membrane, 12-14 kDa molecular weight cut-off | Spectra/Por | 132703 | For purifying HA-NB and HA-Tet |
| Diethyl ether | VWR | BDH1121-4LPC | For synthesis of fluorescently-labeled tetrazine |
| Dimethylformamide | Sigma-Aldrich | 277056 | For synthesis of fluorescently-labeled tetrazine |
| 4-(4,6-dimethoxy-1,3,5-triazin-2-yl)-4-methylmorpholinium chloride (DMTMM) | TCI-Chemicals | D2919 | For modifying HA |
| Dithiothreitol (DTT) | Thermo Scientific | R0861 | Non-degradable dithiol linker (substitute for MMP-cleavable peptide) |
| Dulbecco's Modified Eagle's Medium (DMEM), high glucose, w/ 4500 mg/L glucose, L-glutamine, sodium pyruvate, and sodium bicarbonate, liquid, sterile-filtered, suitable for cell culture | Sigma-Aldrich | D6429-500ML | For D1 cell culture |
| EMS Paraformaldehyde, Granular | VWR | 100504-162 | For making 4% PFA |
| Ethanol absolute (200 proof) | KOPTEC | 89234-850 | |
| Fetal bovine serum (FBS) | ATCC | 30-2020 | For D1 cell culture |
| Heating Plate | Kopf Instruments | HP-4M | |
| Hemacytometer with coverglass | Daigger Scientific | EF16034F | |
| 2-[4-(2-hydroxyethyl)piperazin-1-yl]ethanesulfonic acid (HEPES) | Sigma-Aldrich | H3375 | |
| Sodium hyaluronate, 79 kDa average molecular weight, produced in bacteria Streptococcus zooepidemicus, pharmaceutical grade, microbial contamination <100 CFU/g, bacterial endotoxins <0.050 IU/mg | Contipro | N/A | 79 kDa average molecular weight was used for HA-Tet synthesis, but these methods could be adapted for other molecular weights. |
| IMARIS Essentials software package | Oxford Instruments | N/A | Microscopy image analysis software |
| Infusion pump, dual syringe | Chemyx | N/A | |
| Kimwipe | Kimberly-Clark | 34120 | |
| Laboratory stand with support lab clamp | Geyer | 212100 | |
| Liquid nitrogen | Airgas | NI 180LT22 | |
| Lithium Phenyl(2,4,6-trimethylbenzoyl)phosphinate | TCI-Chemicals | L0290 | |
| Lyophilizer | Labconco | N/A | Labconco FreeZone 6 plus has been discontinued, but other lab grade console freeze dryers could be used for this protocol. |
| Methyltetrazine-PEG4-maleimide | Kerafast | FCC210 | For synthesis of fluorescently-labeled tetrazine |
| 2-(4-Morpholino)ethane Sulfonic Acid (MES) | Fisher Scientific | BP300-100 | For modifying HA |
| Micro cover glass, 24 x 60 mm No. 1 | VWR | 48393-106 | |
| Microfluidic device SU8 master wafer | FlowJem | Custom design made either in-house in clean room or outsourced | |
| Mineral oil, heavy | Sigma-Aldrich | 330760 | |
| MMP-cleavable dithiol crosslinker peptide (Ac-GCRDGPQGIWGQDRCG-NH2) | GenScript | N/A | |
| 5-Norbornene-2-methylamine | TCI-Chemicals | 95-10-3 | For HA-NB synthesis |
| Packing tape | Scotch | 3M 1426 | |
| Parafilm | Bemis | PM996 | |
| PEG(thiol)2 | JenKem Technology USA | A4001-1 | For synthesis of fluorescently-labeled tetrazine |
| Penicillin-Streptomycin, 10,000 units/mL | Thermo Fisher Scientific | 15140122 | For D1 cell culture |
| Petri dish, polystyrene, disposable, Dia. x H=150 x 15 mm | Corning | 351058 | |
| Pluronic F-127 | Sigma-Aldrich | P2443 | For washing HMPs |
| Phosphate buffered saline (PBS) 1x | Gibco | 10010023 | |
| RainX water repellent glass treatment | Grainger | 465D20 | Synthetic hydrophobic treatment solution for microfluidic device treatment |
| RGD peptide (Ac-RGDSPGERCG-NH2) | GenScript | N/A | |
| Rubber bands | Staples | 112417 | |
| Sodium chloride | Chem-Impex | 30070 | For dialysis |
| Span 80 for synthesis | Sigma-Aldrich | 1338-43-8 | |
| Sylgard 184 Silicone Elastomer | Electron Microscopy Science | 4019862 | polydimethylsiloxane (PDMS) elastomer for making microfluidic devices and tissue culture devices |
| Syringe filter, Whatman Uniflo, 0.2 μm PES, 13 mm diameter | Cytvia | 09-928-066 | |
| Tetraview LCD digital microscope | Celestron | 44347 | |
| Tetrazine-amine HCl salt | Chem-Impex | 35098 | For HA-Tet synthesis |
| Triethylamine | Sigma-Aldrich | 471283 | For synthesis of fluorescently-labeled tetrazine |
| Tris(2-carboxyethyl)phosphine (TCEP) | Millipore Sigma | 51805-45-9 | |
| Triton X-100 | VWR | 97063-864 | |
| Trypan blue solution, 0.4% | Thermo Fisher Scientific | 15250061 | |
| Trypsin EDTA (0.25%), Phenol red | Fisher Scientific | 25-200-056 | For lifting adherent cells to seed in MAP gels |
| Tygon ND-100-80 Non-DEHP Medical Tubing, Needle Gauge=23, Wall Thickness=0.020 in, Internal diameter = 0.020, Outer diameter = 0.060 in | Thomas Scientific | 1204G82 | |
| UV curing system controller, LX500 LED | OmniCure | 010-00369R | |
| UV curing head, LED spot UV | OmniCure | N/A | |
| UV light meter, Traceable | VWR | 61161-386 | |
| Vacuum dessicator | Bel-Art | 08-594-15C | |
| X-Acto Z Series Precision Utility Knife | Elmer's | XZ3601W |
Riferimenti
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