Controllo della frazione di particelle in scaffold di particelle ricotto microporose per colture cellulari 3D
Summary
Ridurre al minimo la variabilità della frazione di particelle all’interno di scaffold granulari facilita la sperimentazione riproducibile. Questo lavoro descrive i metodi per generare scaffold granulari con frazioni di particelle controllate per applicazioni di ingegneria tissutale in vitro .
Abstract
I microgel sono gli elementi costitutivi degli scaffold di particelle ricotto microporose (MAP), che fungono da piattaforma sia per la coltura cellulare in vitro che per la riparazione dei tessuti in vivo . In questi scaffold granulari, la porosità innata generata dallo spazio vuoto tra i microgel consente l’infiltrazione e la migrazione cellulare. Il controllo della frazione di vuoto e della frazione di particelle è fondamentale per la progettazione dello scaffold MAP, poiché la porosità è un segnale bioattivo per le cellule. I microgel sferici possono essere generati su un dispositivo microfluidico per dimensioni e forma controllate e successivamente liofilizzati utilizzando metodi che impediscono la fratturazione della rete polimerica. Dopo la reidratazione, i microgel liofilizzati portano a frazioni di particelle controllate negli scaffold MAP. L’implementazione di questi metodi per la liofilizzazione dei microgel ha portato a studi riproducibili che mostrano l’effetto della frazione particellare sulla diffusione delle macromolecole e sulla diffusione cellulare. Il seguente protocollo coprirà la fabbricazione, la liofilizzazione e la reidratazione di microgel per il controllo della frazione di particelle negli scaffold MAP, nonché la ricottura dei microgel attraverso la reticolazione bio-ortogonale per la coltura cellulare 3D in vitro.
Introduction
Gli scaffold di particelle ricotto microporose (MAP) sono una sottoclasse di materiali granulari in cui i blocchi di costruzione del microgel (μgel) sono interconnessi per formare un’impalcatura porosa e di massa. Con la microarchitettura unica di questi scaffold granulari, la porosità innata generata dallo spazio vuoto tra microgel sferici interconnessi supporta l’infiltrazione e la migrazione accelerata delle cellule1. Gli elementi costitutivi in microgel degli scaffold MAP possono essere fabbricati da polimeri sia sintetici che naturali con modifiche chimiche2. I metodi qui descritti evidenziano specificamente l’uso di microgel costituiti da una spina dorsale di acido ialuronico (HA) modificata con maniglie funzionali di norbornene (NB). L’impugnatura funzionale NB sul polimero HA supporta le reazioni di chimica dei clic per formare microgel e collegarli insieme per generare scaffold MAP 3,4. Sono stati impiegati numerosi schemi per collegare insieme i microgel (cioè la ricottura), come l’enzima1, laluce 5,6 e le reazioni di chimica a scatto 3,7 senza additivo. La chimica dei clic senza additivi è descritta in questo lavoro, usando la coniugazione Diels-Alder della domanda inversa di elettroni tetrazina-norbornene per interconnettere i microgel HA-NB.
Per fabbricare scaffold MAP, gli utenti generano prima i mattoni del microgel utilizzando emulsioni inverse in sistemi batch o all’interno di dispositivi microfluidici, nonché con spruzzatura elettroidrodinamica, litografia o frammentazione meccanica2. La produzione di microgel sferici HA-NB è stata ben descritta e precedentemente riportata utilizzando sia l’emulsione batch2 che le tecniche di generazione di goccioline microfluidiche 8,9,10,11. In questo lavoro, microgel sferici HA-NB sono stati generati su una piattaforma microfluidica focalizzata sul flusso per dimensioni e forma controllate, come precedentemente descritto 8,9,10. Dopo la purificazione, i microgel esistono in sospensione acquosa e devono essere concentrati per indurre uno stato di inceppamento. Quando sono bloccati, i microgel presentano proprietà di assottigliamento del taglio, che consentono loro di funzionare come materiali iniettabili che riempiono lo spazio1. Un metodo per indurre uno stato inceppato è quello di asciugare i microgel tramite liofilizzazione o liofilizzazione, quindi successivamente reidratare il prodotto essiccato in un volume controllato12. In alternativa, il tampone in eccesso può essere rimosso dal liquame di microgel tramite centrifugazione su un filtro o con rimozione manuale del tampone dal pellet di microgel mediante aspirazione o utilizzando un materiale assorbente. Tuttavia, l’uso della centrifugazione per asciugare i microgel può generare una gamma altamente variabile di frazioni di particelle e frazioni vuote quando si effettuano scaffold granulari12. Sono state descritte tecniche per la liofilizzazione dei microgel utilizzando il 70% di IPA per microgel di polietilenglicole (PEG)13, oli fluorurati per microgel di gelatina metacriloile (GelMa) 14 e etanolo al 70% per microgel HA12. Questo protocollo evidenzia i metodi per la liofilizzazione dei microgel sferici HA utilizzando il 70% di etanolo, un reagente di laboratorio standard, per mantenere le proprietà originali del microgel durante il processo di essiccazione. I microgel di HA liofilizzati possono essere pesati e reidratati a percentuali di peso definite dall’utente per controllare le frazioni finali di particelle negli scaffold MAP12.
La fase finale nella formazione dello scaffold MAP si basa sulla ricottura dei microgel per creare un’impalcatura massiccia e porosa1. Utilizzando componenti nativi della matrice extracellulare e impiegando schemi di ricottura bio-ortogonale, gli scaffold MAP fungono da piattaforma biocompatibile sia per la coltura cellulare in vitro che per la riparazione tissutale in vivo 3. Attraverso questi approcci, gli scaffold MAP possono essere fabbricati da blocchi di costruzione HA-NB con frazioni di particelle definite dall’utente per il loro impiego in applicazioni di ingegneria tissutale12. Il seguente protocollo descrive la produzione microfluidica di microgel HA-NB seguita da liofilizzazione e reidratazione per il controllo della frazione di particelle negli scaffold MAP. Infine, i passaggi per la ricottura dei microgel sono descritti utilizzando la chimica bio-ortogonale per esperimenti di coltura cellulare 3D in vitro .
Protocol
Representative Results
Discussion
È stato dimostrato che la produzione microfluidica di microgel HA-NB genera microgel con una gamma più ristretta di distribuzione dimensionale rispetto alla produzione di lotti di emulsione 3,9. I microgel descritti in questo protocollo sono stati formulati utilizzando un reticolante con scissione MMP (AC-GGRDGPQGIWGQDRCG-NH2) per supportare la degradazione del materiale. Tuttavia, i microgel HA-NB possono anche essere reticolati utilizzando un link…
Divulgazioni
The authors have nothing to disclose.
Acknowledgements
Gli autori desiderano ringraziare il National Institutes of Health, il National Institutes of Neurological Disorders and Stroke (1R01NS112940, 1R01NS079691, R01NS094599) e il National Institute of Allergy and Infectious Disease (1R01AI152568). Questo lavoro è stato eseguito in parte presso la Duke University Shared Materials Instrumentation Facility (SMIF), membro del North Carolina Research Triangle Nanotechnology Network (RTNN), che è supportato dalla National Science Foundation (numero di premio ECCS-2025064) come parte della National Nanotechnology Coordinated Infrastructure (NNCI). Gli autori desiderano ringraziare l’ex post-doc del laboratorio Dr. Lucas Schirmer e Ethan Nicklow per la loro assistenza nella generazione del dispositivo stampato in 3D per esperimenti di coltura cellulare.
Materials
| 1 mL Luer-Lok syringe sterile, single use, polycarbonate | BD | 309628 | |
| 5 mL Luer-Lok syringe sterile, single use, polycarbonate | BD | 309646 | |
| Alexa Fluor 488 C5 maleimide | Invitrogen | A10254 | For synthesis of fluorescently-labeled tetrazine |
| Alexa Fluor 647 Phalloidin | Invitrogen | A22287 | For staining cell culture samples |
| Aluminum foil | VWR | 89107-726 | |
| Biopsy punch with plunger, 1.0 mm | Integra Miltex | 69031-01 | |
| Biopsy punch, 4 mm | Integra Miltex | 33-34 | |
| Blunt needle, 23 G 0.5", Non-Sterile, Capped | SAI Infusion Technologies | B23-50 | |
| Bottle-top vacuum filter, 0.22 μm | Corning | CLS430521 | |
| Calcium chloride | VWR | 1B1110 | For microgel washing buffer |
| Capillary-piston assemblies for positive-displacement pipettes, 1000 μL max. volume | Rainin | 17008609 | |
| Capillary-piston assemblies for positive-displacement pipettes, 25 μL max. volume | Rainin | 17008605 | |
| Capillary-piston assemblies for positive-displacement pipettes, 250 μL max. volume | Rainin | 17008608 | |
| Countess Cell Counting Chamber Slides | Invitrogen | C10228 | |
| Countess II FL Automated Cell Counter | Invitrogen | AMQAF1000 | |
| Centrifuge tube, 15 mL | CELLTREAT | 667015B | |
| Centrifuge tube, 50 mL | CELLTREAT | 229421 | |
| Chloroform, ACS grade, Glass Bottle | Stellar Scientific | CP-C7304 | For synthesis of fluorescently-labeled tetrazine |
| Corona plasma gun, BD-10A High Frequency Generator | ETP | 11011 | |
| CryoTube Vials, Polypropylene, Internal Thread with Screw Cap | Nunc | 368632 | |
| D1 mouse mesenchymal cells | ATCC | CRL-12424 | Example cell line for culture in MAP gels |
| DAPI | Sigma-Aldrich | D9542 | For staining cell culture samples |
| Deuterium oxide, 99.9 atom% D | Sigma-Aldrich | 151882 | For NMR spectroscopy |
| Dialysis tubing, regenerated cellulose membrane, 12-14 kDa molecular weight cut-off | Spectra/Por | 132703 | For purifying HA-NB and HA-Tet |
| Diethyl ether | VWR | BDH1121-4LPC | For synthesis of fluorescently-labeled tetrazine |
| Dimethylformamide | Sigma-Aldrich | 277056 | For synthesis of fluorescently-labeled tetrazine |
| 4-(4,6-dimethoxy-1,3,5-triazin-2-yl)-4-methylmorpholinium chloride (DMTMM) | TCI-Chemicals | D2919 | For modifying HA |
| Dithiothreitol (DTT) | Thermo Scientific | R0861 | Non-degradable dithiol linker (substitute for MMP-cleavable peptide) |
| Dulbecco's Modified Eagle's Medium (DMEM), high glucose, w/ 4500 mg/L glucose, L-glutamine, sodium pyruvate, and sodium bicarbonate, liquid, sterile-filtered, suitable for cell culture | Sigma-Aldrich | D6429-500ML | For D1 cell culture |
| EMS Paraformaldehyde, Granular | VWR | 100504-162 | For making 4% PFA |
| Ethanol absolute (200 proof) | KOPTEC | 89234-850 | |
| Fetal bovine serum (FBS) | ATCC | 30-2020 | For D1 cell culture |
| Heating Plate | Kopf Instruments | HP-4M | |
| Hemacytometer with coverglass | Daigger Scientific | EF16034F | |
| 2-[4-(2-hydroxyethyl)piperazin-1-yl]ethanesulfonic acid (HEPES) | Sigma-Aldrich | H3375 | |
| Sodium hyaluronate, 79 kDa average molecular weight, produced in bacteria Streptococcus zooepidemicus, pharmaceutical grade, microbial contamination <100 CFU/g, bacterial endotoxins <0.050 IU/mg | Contipro | N/A | 79 kDa average molecular weight was used for HA-Tet synthesis, but these methods could be adapted for other molecular weights. |
| IMARIS Essentials software package | Oxford Instruments | N/A | Microscopy image analysis software |
| Infusion pump, dual syringe | Chemyx | N/A | |
| Kimwipe | Kimberly-Clark | 34120 | |
| Laboratory stand with support lab clamp | Geyer | 212100 | |
| Liquid nitrogen | Airgas | NI 180LT22 | |
| Lithium Phenyl(2,4,6-trimethylbenzoyl)phosphinate | TCI-Chemicals | L0290 | |
| Lyophilizer | Labconco | N/A | Labconco FreeZone 6 plus has been discontinued, but other lab grade console freeze dryers could be used for this protocol. |
| Methyltetrazine-PEG4-maleimide | Kerafast | FCC210 | For synthesis of fluorescently-labeled tetrazine |
| 2-(4-Morpholino)ethane Sulfonic Acid (MES) | Fisher Scientific | BP300-100 | For modifying HA |
| Micro cover glass, 24 x 60 mm No. 1 | VWR | 48393-106 | |
| Microfluidic device SU8 master wafer | FlowJem | Custom design made either in-house in clean room or outsourced | |
| Mineral oil, heavy | Sigma-Aldrich | 330760 | |
| MMP-cleavable dithiol crosslinker peptide (Ac-GCRDGPQGIWGQDRCG-NH2) | GenScript | N/A | |
| 5-Norbornene-2-methylamine | TCI-Chemicals | 95-10-3 | For HA-NB synthesis |
| Packing tape | Scotch | 3M 1426 | |
| Parafilm | Bemis | PM996 | |
| PEG(thiol)2 | JenKem Technology USA | A4001-1 | For synthesis of fluorescently-labeled tetrazine |
| Penicillin-Streptomycin, 10,000 units/mL | Thermo Fisher Scientific | 15140122 | For D1 cell culture |
| Petri dish, polystyrene, disposable, Dia. x H=150 x 15 mm | Corning | 351058 | |
| Pluronic F-127 | Sigma-Aldrich | P2443 | For washing HMPs |
| Phosphate buffered saline (PBS) 1x | Gibco | 10010023 | |
| RainX water repellent glass treatment | Grainger | 465D20 | Synthetic hydrophobic treatment solution for microfluidic device treatment |
| RGD peptide (Ac-RGDSPGERCG-NH2) | GenScript | N/A | |
| Rubber bands | Staples | 112417 | |
| Sodium chloride | Chem-Impex | 30070 | For dialysis |
| Span 80 for synthesis | Sigma-Aldrich | 1338-43-8 | |
| Sylgard 184 Silicone Elastomer | Electron Microscopy Science | 4019862 | polydimethylsiloxane (PDMS) elastomer for making microfluidic devices and tissue culture devices |
| Syringe filter, Whatman Uniflo, 0.2 μm PES, 13 mm diameter | Cytvia | 09-928-066 | |
| Tetraview LCD digital microscope | Celestron | 44347 | |
| Tetrazine-amine HCl salt | Chem-Impex | 35098 | For HA-Tet synthesis |
| Triethylamine | Sigma-Aldrich | 471283 | For synthesis of fluorescently-labeled tetrazine |
| Tris(2-carboxyethyl)phosphine (TCEP) | Millipore Sigma | 51805-45-9 | |
| Triton X-100 | VWR | 97063-864 | |
| Trypan blue solution, 0.4% | Thermo Fisher Scientific | 15250061 | |
| Trypsin EDTA (0.25%), Phenol red | Fisher Scientific | 25-200-056 | For lifting adherent cells to seed in MAP gels |
| Tygon ND-100-80 Non-DEHP Medical Tubing, Needle Gauge=23, Wall Thickness=0.020 in, Internal diameter = 0.020, Outer diameter = 0.060 in | Thomas Scientific | 1204G82 | |
| UV curing system controller, LX500 LED | OmniCure | 010-00369R | |
| UV curing head, LED spot UV | OmniCure | N/A | |
| UV light meter, Traceable | VWR | 61161-386 | |
| Vacuum dessicator | Bel-Art | 08-594-15C | |
| X-Acto Z Series Precision Utility Knife | Elmer's | XZ3601W |
Riferimenti
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