Controlando a Fração de Partículas em Andaimes de Partículas Microporosas Recozidos para Cultura de Células 3D
Summary
Minimizar a variabilidade na fração de partículas dentro de andaimes granulares facilita a experimentação reprodutível. Este trabalho descreve métodos para a geração de andaimes granulares com frações de partículas controladas para aplicações de engenharia de tecidos in vitro .
Abstract
Os microgéis são os blocos de construção de andaimes de partículas microporosas recozidas (MAP), que servem como uma plataforma para a cultura de células in vitro e reparação de tecidos di vivo. Nesses andaimes granulares, a porosidade inata gerada pelo espaço vazio entre os microgéis permite a infiltração e migração celular. Controlar a fração do vazio e a fração de partículas é fundamental para o projeto do andaime MAP, pois a porosidade é uma sugestão bioativa para as células. Microgéis esféricos podem ser gerados em um dispositivo microfluídico para tamanho e forma controlados e, posteriormente, liofilizados usando métodos que impedem o fraturamento da rede polimérica. Após a reidratação, os microgéis liofilizados levam a frações de partículas controladas em andaimes MAP. A implementação desses métodos para a liofilização em microgel levou a estudos reprodutíveis mostrando o efeito da fração de partículas na difusão de macromoléculas e na disseminação celular. O protocolo a seguir abrangerá a fabricação, liofilização e reidratação de microgéis para controle da fração de partículas em andaimes MAP, bem como o recozimento dos microgéis através de reticulação bio-ortogonal para cultura de células 3D in vitro.
Introduction
Andaimes de partículas microporosas recozidos (MAP) são uma subclasse de materiais granulares em que os blocos de construção de microgel (μgel) estão interligados para formar um andaime poroso a granel. Com a microarquitetura única desses andaimes granulares, a porosidade inata gerada pelo espaço vazio entre o microgel esférico interligado suporta infiltração e migração celular acelerada1. Os blocos de construção de microgel dos andaimes MAP podem ser fabricados a partir de polímeros sintéticos e naturais com modificações químicas2. Os métodos aqui descritos destacam especificamente o uso de microgéis compostos por uma espinha dorsal de ácido hialurônico (AH) modificada com alças funcionais de norborneno (NB). A alça funcional NB no polímero HA suporta reações químicas de clique para formar microgéis e ligá-los para gerar andaimes MAP 3,4. Numerosos esquemas têm sido empregados para ligar os microgéis juntos (ou seja, recozimento), como reações enzimáticas1, 5,6 à base de luz e química de clique livre de aditivos 3,7. A química do clique livre de aditivos é descrita neste trabalho, utilizando a conjugação inversa de demanda eletrônica Diels-Alder tetrazina-norborneno para interligar os microgéis HA-NB.
Para fabricar andaimes MAP, os usuários primeiro geram os blocos de construção de microgel usando emulsões reversas em sistemas de lote ou em dispositivos microfluídicos, bem como com pulverização eletrohidrodinâmica, litografia ou fragmentação mecânica2. A produção de microgéis esféricos HA-NB tem sido bem descrita e relatada anteriormente utilizando técnicas de emulsão em batelada2 e geração de gotículas microfluídicas 8,9,10,11. Neste trabalho, microgéis esféricos de HA-NB foram gerados em uma plataforma microfluídica com foco de fluxo para tamanho e forma controlados, conforme descrito anteriormente 8,9,10. Após a purificação, os microgéis existem em suspensão aquosa e devem ser concentrados para induzir um estado encravado. Quando encravados, os microgéis exibem propriedades de afinamento por cisalhamento, que lhes permitem funcionar como materiais injetáveis e de preenchimento de espaço1. Um método de induzir um estado atolado é secar os microgéis via liofilização, ou liofilização, e posteriormente reidratar o produto seco em um volume controlado12. Alternativamente, o excesso de tampão pode ser removido da pasta de microgel por centrifugação sobre um filtro ou com a remoção manual do tampão do pellet de microgel, seja por aspiração ou usando um material absorvente. No entanto, o uso da centrifugação para secar os microgéis pode gerar uma faixa altamente variável de frações de partículas e frações vazias ao fazer andaimes granulares12. Técnicas de liofilização de microgéis têm sido descritas utilizando IPA a 70% para microgéis de polietilenoglicol (PEG)13, óleos fluorados para microgéis de metacriloíla gelatina (GelMa)14 e etanol a 70% para microgéis de AH12. Este protocolo destaca métodos para liofilização de microgéis esféricos de AH usando etanol a 70%, um reagente de laboratório padrão, para reter as propriedades originais do microgel durante o processo de secagem. Os microgéis de AH liofilizados podem ser pesados e reidratados em porcentagens de peso definidas pelo usuário para controlar as frações finais de partículas em andaimes MAP12.
A etapa final na formação do andaime MAP depende do recozimento dos microgéis para criar um andaime poroso a granel1. Utilizando componentes da matriz extracelular nativa e empregando esquemas de recozimento bio-ortogonal, os andaimes MAP servem como uma plataforma biocompatível tanto para a cultura de células in vitro quanto para o reparo tecidual in vivo 3. Por meio dessas abordagens, os andaimes MAP podem ser fabricados a partir de blocos de construção HA-NB com frações de partículas definidas pelo usuário para seu emprego em aplicações de engenharia de tecidos12. O protocolo a seguir descreve a produção microfluídica de microgéis HA-NB seguida de liofilização e reidratação para controle da fração de partículas em andaimes MAP. Por fim, as etapas para o recozimento dos microgéis são descritas usando química bio-ortogonal para experimentos de cultura de células 3D in vitro .
Protocol
Representative Results
Discussion
Demonstrou-se que a produção microfluídica de microgéis HA-NB gera microgéis com uma faixa mais estreita de distribuição de tamanho do que a produção em lote de emulsão 3,9. Os microgéis descritos neste protocolo foram formulados utilizando um reticulador MMP-clevable (Ac-GCRDGPQGIWGQDRCG-NH2) para suportar a degradação do material. No entanto, os microgéis HA-NB também podem ser reticulados usando um ligador de di-tiol alternativo, com…
Divulgazioni
The authors have nothing to disclose.
Acknowledgements
Os autores gostariam de agradecer aos Institutos Nacionais de Saúde, aos Institutos Nacionais de Distúrbios Neurológicos e Derrame (1R01NS112940, 1R01NS079691, R01NS094599) e ao Instituto Nacional de Alergia e Doenças Infecciosas (1R01AI152568). Este trabalho foi realizado em parte na Duke University Shared Materials Instrumentation Facility (SMIF), membro da North Carolina Research Triangle Nanotechnology Network (RTNN), que é apoiada pela National Science Foundation (número de prêmio ECCS-2025064) como parte da National Nanotechnology Coordinated Infrastructure (NNCI). Os autores gostariam de agradecer ao ex-pós-doutor do laboratório, Dr. Lucas Schirmer, bem como a Ethan Nicklow, por sua assistência na geração do dispositivo impresso em 3D para experimentos de cultura celular.
Materials
| 1 mL Luer-Lok syringe sterile, single use, polycarbonate | BD | 309628 | |
| 5 mL Luer-Lok syringe sterile, single use, polycarbonate | BD | 309646 | |
| Alexa Fluor 488 C5 maleimide | Invitrogen | A10254 | For synthesis of fluorescently-labeled tetrazine |
| Alexa Fluor 647 Phalloidin | Invitrogen | A22287 | For staining cell culture samples |
| Aluminum foil | VWR | 89107-726 | |
| Biopsy punch with plunger, 1.0 mm | Integra Miltex | 69031-01 | |
| Biopsy punch, 4 mm | Integra Miltex | 33-34 | |
| Blunt needle, 23 G 0.5", Non-Sterile, Capped | SAI Infusion Technologies | B23-50 | |
| Bottle-top vacuum filter, 0.22 μm | Corning | CLS430521 | |
| Calcium chloride | VWR | 1B1110 | For microgel washing buffer |
| Capillary-piston assemblies for positive-displacement pipettes, 1000 μL max. volume | Rainin | 17008609 | |
| Capillary-piston assemblies for positive-displacement pipettes, 25 μL max. volume | Rainin | 17008605 | |
| Capillary-piston assemblies for positive-displacement pipettes, 250 μL max. volume | Rainin | 17008608 | |
| Countess Cell Counting Chamber Slides | Invitrogen | C10228 | |
| Countess II FL Automated Cell Counter | Invitrogen | AMQAF1000 | |
| Centrifuge tube, 15 mL | CELLTREAT | 667015B | |
| Centrifuge tube, 50 mL | CELLTREAT | 229421 | |
| Chloroform, ACS grade, Glass Bottle | Stellar Scientific | CP-C7304 | For synthesis of fluorescently-labeled tetrazine |
| Corona plasma gun, BD-10A High Frequency Generator | ETP | 11011 | |
| CryoTube Vials, Polypropylene, Internal Thread with Screw Cap | Nunc | 368632 | |
| D1 mouse mesenchymal cells | ATCC | CRL-12424 | Example cell line for culture in MAP gels |
| DAPI | Sigma-Aldrich | D9542 | For staining cell culture samples |
| Deuterium oxide, 99.9 atom% D | Sigma-Aldrich | 151882 | For NMR spectroscopy |
| Dialysis tubing, regenerated cellulose membrane, 12-14 kDa molecular weight cut-off | Spectra/Por | 132703 | For purifying HA-NB and HA-Tet |
| Diethyl ether | VWR | BDH1121-4LPC | For synthesis of fluorescently-labeled tetrazine |
| Dimethylformamide | Sigma-Aldrich | 277056 | For synthesis of fluorescently-labeled tetrazine |
| 4-(4,6-dimethoxy-1,3,5-triazin-2-yl)-4-methylmorpholinium chloride (DMTMM) | TCI-Chemicals | D2919 | For modifying HA |
| Dithiothreitol (DTT) | Thermo Scientific | R0861 | Non-degradable dithiol linker (substitute for MMP-cleavable peptide) |
| Dulbecco's Modified Eagle's Medium (DMEM), high glucose, w/ 4500 mg/L glucose, L-glutamine, sodium pyruvate, and sodium bicarbonate, liquid, sterile-filtered, suitable for cell culture | Sigma-Aldrich | D6429-500ML | For D1 cell culture |
| EMS Paraformaldehyde, Granular | VWR | 100504-162 | For making 4% PFA |
| Ethanol absolute (200 proof) | KOPTEC | 89234-850 | |
| Fetal bovine serum (FBS) | ATCC | 30-2020 | For D1 cell culture |
| Heating Plate | Kopf Instruments | HP-4M | |
| Hemacytometer with coverglass | Daigger Scientific | EF16034F | |
| 2-[4-(2-hydroxyethyl)piperazin-1-yl]ethanesulfonic acid (HEPES) | Sigma-Aldrich | H3375 | |
| Sodium hyaluronate, 79 kDa average molecular weight, produced in bacteria Streptococcus zooepidemicus, pharmaceutical grade, microbial contamination <100 CFU/g, bacterial endotoxins <0.050 IU/mg | Contipro | N/A | 79 kDa average molecular weight was used for HA-Tet synthesis, but these methods could be adapted for other molecular weights. |
| IMARIS Essentials software package | Oxford Instruments | N/A | Microscopy image analysis software |
| Infusion pump, dual syringe | Chemyx | N/A | |
| Kimwipe | Kimberly-Clark | 34120 | |
| Laboratory stand with support lab clamp | Geyer | 212100 | |
| Liquid nitrogen | Airgas | NI 180LT22 | |
| Lithium Phenyl(2,4,6-trimethylbenzoyl)phosphinate | TCI-Chemicals | L0290 | |
| Lyophilizer | Labconco | N/A | Labconco FreeZone 6 plus has been discontinued, but other lab grade console freeze dryers could be used for this protocol. |
| Methyltetrazine-PEG4-maleimide | Kerafast | FCC210 | For synthesis of fluorescently-labeled tetrazine |
| 2-(4-Morpholino)ethane Sulfonic Acid (MES) | Fisher Scientific | BP300-100 | For modifying HA |
| Micro cover glass, 24 x 60 mm No. 1 | VWR | 48393-106 | |
| Microfluidic device SU8 master wafer | FlowJem | Custom design made either in-house in clean room or outsourced | |
| Mineral oil, heavy | Sigma-Aldrich | 330760 | |
| MMP-cleavable dithiol crosslinker peptide (Ac-GCRDGPQGIWGQDRCG-NH2) | GenScript | N/A | |
| 5-Norbornene-2-methylamine | TCI-Chemicals | 95-10-3 | For HA-NB synthesis |
| Packing tape | Scotch | 3M 1426 | |
| Parafilm | Bemis | PM996 | |
| PEG(thiol)2 | JenKem Technology USA | A4001-1 | For synthesis of fluorescently-labeled tetrazine |
| Penicillin-Streptomycin, 10,000 units/mL | Thermo Fisher Scientific | 15140122 | For D1 cell culture |
| Petri dish, polystyrene, disposable, Dia. x H=150 x 15 mm | Corning | 351058 | |
| Pluronic F-127 | Sigma-Aldrich | P2443 | For washing HMPs |
| Phosphate buffered saline (PBS) 1x | Gibco | 10010023 | |
| RainX water repellent glass treatment | Grainger | 465D20 | Synthetic hydrophobic treatment solution for microfluidic device treatment |
| RGD peptide (Ac-RGDSPGERCG-NH2) | GenScript | N/A | |
| Rubber bands | Staples | 112417 | |
| Sodium chloride | Chem-Impex | 30070 | For dialysis |
| Span 80 for synthesis | Sigma-Aldrich | 1338-43-8 | |
| Sylgard 184 Silicone Elastomer | Electron Microscopy Science | 4019862 | polydimethylsiloxane (PDMS) elastomer for making microfluidic devices and tissue culture devices |
| Syringe filter, Whatman Uniflo, 0.2 μm PES, 13 mm diameter | Cytvia | 09-928-066 | |
| Tetraview LCD digital microscope | Celestron | 44347 | |
| Tetrazine-amine HCl salt | Chem-Impex | 35098 | For HA-Tet synthesis |
| Triethylamine | Sigma-Aldrich | 471283 | For synthesis of fluorescently-labeled tetrazine |
| Tris(2-carboxyethyl)phosphine (TCEP) | Millipore Sigma | 51805-45-9 | |
| Triton X-100 | VWR | 97063-864 | |
| Trypan blue solution, 0.4% | Thermo Fisher Scientific | 15250061 | |
| Trypsin EDTA (0.25%), Phenol red | Fisher Scientific | 25-200-056 | For lifting adherent cells to seed in MAP gels |
| Tygon ND-100-80 Non-DEHP Medical Tubing, Needle Gauge=23, Wall Thickness=0.020 in, Internal diameter = 0.020, Outer diameter = 0.060 in | Thomas Scientific | 1204G82 | |
| UV curing system controller, LX500 LED | OmniCure | 010-00369R | |
| UV curing head, LED spot UV | OmniCure | N/A | |
| UV light meter, Traceable | VWR | 61161-386 | |
| Vacuum dessicator | Bel-Art | 08-594-15C | |
| X-Acto Z Series Precision Utility Knife | Elmer's | XZ3601W |
Riferimenti
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