Rilevazione di proteine prioniche anomale mediante immunoistochimica

Summary

L’immunomarcatura della proteina prionica anomala utilizzando protocolli immunoistochimici richiede specifiche metodologie di preparazione di campioni e anticorpi anti-PrP. Il presente protocollo descrive i passaggi chiave del demasking degli epitopi per garantire una corretta etichettatura immunologica della PrP e per ridurre al minimo la colorazione di fondo non specifica. Inoltre, questo approccio considera le misure di biosicurezza quando si conducono studi di immunoistochimica con i tessuti infetti da prioni.

Abstract

Le proteine prioniche anomale (PrP^Sc) sono l’isoforma associata alla malattia della proteina prionica cellulare e i marcatori diagnostici delle encefalopatie spongiformi trasmissibili (TSE). Queste malattie neurodegenerative colpiscono l’uomo e diverse specie animali e comprendono la scrapie, l’encefalopatia spongiforme bovina zoonotica (BSE), la malattia del deperimento cronico dei cervidi (CWD) e la malattia da prioni del cammello (CPD) recentemente identificata. La diagnosi di TSE si basa sull’immunorilevazione della PrP^Sc mediante l’applicazione sia dell’immunoistochimica (IHC) che dei metodi immunoblot occidentali (WB) sui tessuti dell’encefalo, vale a dire il tronco cerebrale (livello obex). IHC è un metodo ampiamente utilizzato che utilizza anticorpi primari (monoclonali o policlonali) contro antigeni di interesse nelle cellule di una sezione tissutale. Il legame anticorpo-antigene può essere visualizzato da una reazione di colore che rimane localizzata nell’area del tessuto o della cellula in cui l’anticorpo è stato preso di mira. Pertanto, nelle malattie da prioni, come in altri campi di ricerca, le tecniche di immunoistochimica non sono utilizzate solo per scopi diagnostici, ma anche negli studi di patogenesi. Tali studi prevedono la rilevazione dei modelli e dei tipi di PrP^Sc da quelli precedentemente descritti per identificare i nuovi ceppi prionici. Poiché la BSE può infettare l’uomo, si raccomanda di utilizzare strutture e/o pratiche di laboratorio di biosicurezza di livello 3 (BSL-3) per manipolare campioni di bovini, piccoli ruminanti e cervidi inclusi nella sorveglianza delle TSE. Inoltre, si raccomandano attrezzature di contenimento e dedicate ai prioni, quando possibile, per limitare la contaminazione. La procedura PrP^Sc IHC consiste in una fase di epitopo dell’acido formico che agisce anche come misura di inattivazione dei prioni, poiché i tessuti fissati in formalina e incorporati in paraffina utilizzati in questa tecnica rimangono infettivi. Nell’interpretare i risultati, è necessario prestare attenzione a distinguere l’immunomarcatura non specifica dall’etichettatura target. A tal fine, è importante riconoscere gli artefatti dell’immunomarcatura ottenuti in animali di controllo TSE-negativi noti per differenziarli da specifici tipi di immunomarcatura PrP^Sc , che possono variare tra ceppi di TSE, specie ospiti e genotipo prnp , ulteriormente descritti nel presente documento.

Introduction

Secondo l’ipotesi prionica, l’isoforma anomala (PrP^Sc) è l’unico componente primario dell’agente infettivo nelle encefalopatie spongiformi trasmissibili (TSE). La conferma per la diagnosi di TSE si basa sull’immunorilevazione della PrP^Sc mediante l’applicazione di protocolli immunoistochimici (IHC) e/o metodi immunoblot occidentali (WB) dei tessuti dell’encefalo¹.

L’IHC è un metodo che impiega anticorpi monoclonali o, in alcuni casi, policlonali (come anticorpi primari) come primo passo nell’immunocolorazione di antigeni di interesse specificamente mirati situati nelle cellule di una sezione tissutale. Qualsiasi legame efficace anticorpo-antigene primario viene quindi visualizzato utilizzando anticorpi secondari specifici per gli anticorpi primari. Questi anticorpi secondari sono coniugati agli enzimi, come la perossidasi di rafano (HRP) o la fosfatasi alcalina (AP). La visualizzazione si ottiene quindi aggiungendo un substrato a questi enzimi, producendo prodotti di colore insolubili localizzati in aree in cui gli anticorpi primari sono legati agli antigeni bersaglio. Una migliore visualizzazione può essere ottenuta contrastando, in cui un colorante viene utilizzato per creare un contrasto tra tessuto immunomarcato e non immunomarcato².

Con IHC che utilizza tessuti incorporati in paraffina fissati in formalina (FFPE), la fissazione della formalina può annullare l’efficacia degli anticorpi primari a causa della reticolazione mediante formaldeide e riscaldamento e disidratazione durante l’incorporazione di paraffina. Questi modificano la conformazione delle proteine, distruggendo, denaturando o mascherando gli epitopi, diminuendo o abrogando così la loro rilevazione³. Come tale, ciò richiede il recupero dell’antigene (AR). Le tecniche AR interrompono il cross-linking dei gruppi chimici correlati alla formaldeide nelle molecole antigeniche, ripristinando o smascherando così la conformazione originale antigene-proteina. Ciò si traduce nel recupero dell’affinità anticorpo-antigene (epitopo) per l’immunomarcatura. L’eventuale efficacia dell’AR dipende dalle qualità dell’antigene bersaglio e/o dell’anticorpo primario².

Il recupero dell’antigene indotto dal calore (epitopo) (HIER) è una procedura di AR³ e viene utilizzato di routine per il rilevamento di PrP^Sc IHC, come descritto nel presente documento. L’IHC è essenziale per la diagnosi e viene utilizzato nei laboratori di ricerca per determinare la distribuzione tissutale di un antigene associato alla patologia. È ampiamente usato nella diagnosi e nella ricerca di cancro, neuroscienze e malattie infettive⁴, tra gli altri. Per le TSE, l’IHC svolge un ruolo importante nella diagnosi e nella ricerca per confermare e studiare la distribuzione di PrP^Sc negli ospiti naturali e nei modelli sperimentali. IHC contribuisce agli studi sulla patogenesi prionica e all’analisi dei tipi e dei modelli di deposizione di PrP^Sc , vale a dire, nei tessuti neurali⁵, per rilevare deviazioni dalle infezioni descritte di routine e identificare nuovi ceppi prionici putativi.

Poiché i prioni dell’encefalopatia spongiforme bovina (BSE) possono infettare l’uomo, alcuni protocolli di laboratorio coinvolti nel lavoro con la BSE possono richiedere l’uso di strutture e pratiche BSL-3⁶. Questi includono l’uso di un contenitore secondario sigillato per trasportare potenziali campioni di tessuto infetto da BSE all’interno dell’istituto e del laboratorio. Comprende anche la designazione di aree di contenimento e attrezzature dedicate ai prioni per la ricerca e l’analisi della BSE ogniqualvolta possibile. Questo viene fatto per prevenire la contaminazione al di fuori dell’area di lavoro e fornire uno spazio ristretto poiché le procedure di decontaminazione diventano necessarie.

Di conseguenza, il Laboratorio di Patologia dell’INIAV segue le strutture e le pratiche raccomandate di livello 3 di biosicurezza (BSL-3)⁶ per gestire potenziali campioni di tessuti infetti da prioni di bovini, piccoli ruminanti e cervidi associati alla sorveglianza delle TSE.

I tessuti fissati in formalina e incorporati in paraffina inclusi nelle procedure diagnostiche o di ricerca sulle TSE, specialmente nel sistema nervoso centrale, possono essere potenzialmente infettivi. Quindi, questi tessuti fissi devono essere trattati con acido formico per ridurre l’infettività dei prioni, se presenti, prima della lavorazione dei tessuti. Questo viene eseguito posizionando tessuti fissi e rifilati (circa 2-4 mm di spessore) in una cassetta di lavorazione. La cassetta viene quindi immersa in acido formico al 98% (per 1 ora). Dopo l’immersione, le cassette con i fazzoletti vengono lavate in acqua corrente del rubinetto per 30 minuti e restituite al fissativo prima di ulteriori elaborazioni. Se le sezioni di tessuto non vengono trattate prima della lavorazione, le sezioni di tessuto post-microtomico devono essere immerse in acido formico non diluito per almeno 5 minuti prima della colorazione istologica⁷. Il protocollo IHC per PrP^Sc include una fase di routine di epitopo dell’acido formico, che serve anche a inattivare i prioni⁷. Dopo queste fasi di inattivazione dei prioni, i tessuti fissi risultanti possono quindi essere elaborati a BSL-2 utilizzando pratiche standard BSL-2.

Il requisito minimo di campionamento dei tessuti per la diagnosi di TSE in qualsiasi animale incluso nella sorveglianza delle TSE è la raccolta del tronco encefalico (a livello dell’obex). Inoltre, per rilevare BSE e scrapie atipiche, si consiglia di raccogliere anche una parte del cervelletto ^1,8. Per la diagnosi di CWD, sia il tronco encefalico (obex) che i linfonodi retrofaringei dovrebbero essere testati poiché PrP Sc potrebbe essere rilevato nei tessuti linfoidi senza PrP^Sc rilevabile nell’obex⁹, esaminato da Machado et ^al.10.

La porzione obex del tronco encefalico comprende siti bersaglio diagnostici TSE, vale a dire il nucleo vagale dorsale (DVN), il nucleo del tratto solitario (STN) e il nucleo del tratto spinale del nervo trigemino (V). Queste aree presentano costantemente un accumulo bilaterale di PrP^Sc , anche nelle prime fasi della BSE e della scrapie classica. Nei casi clinici di TSE avanzata, tutte le aree della materia grigia all’interno del tronco encefalico mostrano una diffusa distribuzione di PrP^{Sc 11}.

Prima del sezionamento e dell’elaborazione, i campioni cerebrali vengono valutati (Figura 1) per accertare il livello di autolisi e la presenza di eventuali danni tissutali che potrebbero compromettere l’idoneità del campione per la diagnosi di conferma basata su IHC⁸. Per convalidare l’integrità dei protocolli preparativi e dei risultati analitici, i campioni di tessuto positivo e negativo alla TSE sono inclusi come controlli in combinazione con la preparazione dei tessuti dai casi di prova in ciascun test.

Figura 1: La procedura PrP^Sc IHC. Rappresentazione che mostra la sequenza passo-passo della procedura PrP^Sc IHC dalla deparaffinizzazione di sezioni tissutali all’eventuale immunocolorazione e rilevazione (FFPE – Formalin-fixed paraffin-embedded; Mab – anticorpo monoclonale; DAB – 3,3′ diaminobenzidina). Questa figura è stata creata nel BioRender.com. Fare clic qui per visualizzare una versione ingrandita di questa figura.

Protocol

La procedura IHC qui descritta è una componente del progetto di ricerca FAIRJ-CT98-7021, “The establishment of a European network for the surveillance of ruminant TSE and the standardization and harmonization of the process and criteria for the identification of suspect cases”. Segue i criteri diagnostici definiti dall’Organizzazione mondiale per la salute animale, WOAH (precedentemente denominato Office International des Épizooties, OIE)1 e European Reference Laboratory for animal TSE 8,11…

Representative Results

Dato che è possibile una marcatura immunomarcatrice bersaglio non specifica, è importante accertare il livello di immunomarcatura non specifica negli animali di controllo noti TSE-negativi. Questo è un passo importante per interpretare correttamente specifici immunolabeling PrPSc 7 (Figura 2). È stato notato che la marcatura non bersaglio da parte di anticorpi anti-PrP si verifica come colorazione intraneuronale discreta del particolato fine (…

Discussion

Le TSE sono potenziali malattie zoonotiche. Dopo la comparsa della BSE nel 1986 nel Regno Unito, il Portogallo è diventato uno degli Stati membri dell’Unione europea con una maggiore incidenza di questa malattia^14,15. Al fine di controllare questa malattia, altre TSE che sono emerse (scrapie classica e atipica, varianti della BSE, e attualmente la sorveglianza della malattia del deperimento cronico nei cervidi), meccanismi di sorveglianza sono stati sviluppati d…

Materials

Absolute ethanol	Labchem	LB0507-9010	Undituled
			Diluted 90%, 70% and 50% in distilled water
Avidin-biotin complex and peroxidase Vectastain Elite ABC kit Peroxidase	Vector Laboratories	PK-6100	Prepare and gently mix 30 min before use according to kit instructions. Do not mix after standing.
Biotinylated secondary antibody (Horse anti-mouse IgG H+L)	Vector Laboratories	BA-2000-1.5	Dilute at 1/200 in TBS with 10% horse normal serum. Prepare the volume required depending on the number of sections.
Chromogen Diaminobenzidine- DAB, substrate kit, Peroxidase	Vector Laboratories	SK-4100	Prepare before use according to kit instructions. Use 400 µL of solution per section.
DakoCytomation Pascal pressure chamber	DAKO	S2800
Ehrlich’s Hematoxylin:
Hematoxylin	Merck	115938	Dissolve 2 g of hematoxylin in 100 mL of absolute ethanol. Add 100 mL of distilled water, 10 mL of glacial acetic acid and 15 g of potassium alum with constant stirring. Add 100 mL of glycerin. The natural oxidation process takes 2 months, before use.
Absolute ethanol	Labchem	LB0507-9010
Glacial acetic acid	Merck	101830
Potassium alum	Merck	1.01047.1000
Glycerin	Merck	1.04091.1000
Endogenous Peroxidase Block solution (3% concentration H2O2):			40 mL Hydrogen peroxide (30% w/w) in 360 mL Methanol. Prepare before use
Hydrogen peroxide (30% w/w)	Scharlau	HI0136
Methanol	Sigma Aldrich	322415-2L
Formic acid 98%	Merck	1.00264.1000	Undiluted
Microtome	Shandon-AS325	Microtome	Shandon-AS325
Mounting medium Entellan	Merck	107960	Ready- to- use.
Normal serum (20% ) block solution in TBS: Horse normal serum	Gibco	16050-122	Prepare final volume according to the number of sections in the assay (200 µL of solution per section).
Primary antibody anti-PrP Mouse MAb 2G11	BIORAD	MCA2460	PrP 146-R154R171182 Ovine including atypical scrapie, cervine, feline. Not suitable for bovine. According to the number of sections in the assay (200 µL of solution per section) and antibody dilution, prepare final volume in TBS supplemented with 10% of normal serum from the species the secondary antibody was raised in (horse normal serum) Usual antibody dilution: MAb 2G11 1/100 but working dilution should be established in every new batch to get the concentration to give the strongest labelling with lowest background. For storage, freeze aliquot volumes of a minimum of 10 μL into sterile microtubes. Defrost and use one aliquot at a time.
Primary antibody anti-PrP Mouse MAb 12F10	Cayman  Chemical Company	189710	PrP142-160 Bovine, not suitable for ovine Usual antibody dilution: 1/200 but working dilution should also be established. Prepare as MAb 2G11
Shandon CoverplateTM chamber	Thermo Scientific	72110017
Shandon Sequenza® Immunstaining center	Thermo Scientific	73300001
Shandon Sequenza® Immunstaining slide rack	Thermo Scientific	73310017
Solution Citrate Buffer (10 mM pH 6.1):			2.55 g Tri-sodium citrate dihydrate  and 0.255 g Citric acid in one litre purified water. Adjust pH of working solution to 6.1 using 10 mM citric acid solution (1.05 g citric acid in 500 mL purified water) Prepare on assay day.
Tri-sodium citrate dihydrate	Sigma-aldrich	S4641-500G
Citric acid	Sigma Aldrich	C0759
Staining jar and basket	Deltalab	19360
		19361
Superfrost Plus microscope slides	VWR	631-0108
Tris-Buffered Saline solution (TBS) (50 mM TRIZMA BASE; 0.8% NaCI; pH 7.6):			10xTBS (stock solution 0.5 M TRIZMA BASE; 8% NaCI; pH 7.6): TRIZMA BASE 60,57 g and NaCl 80 g in 800 mL purified water. Adjust pH of stock solution using Hydrochloric acid 37% and final volume to one litre with purified water (keep 5± 3 °C until 2 months) Dilute TBS stock solution 1/10 on assay day.
TRIZMA BASE	Sigma Aldrich	T6066-1KG
Sodium Chloride (NaCl)	Merck	106404
Xylene	Panreac Applied Chem ITW reagents	251769	Undiluted