Détection de la protéine prion anormale par immunohistochimie

Summary

L’immunomarquage de la protéine prion anormale à l’aide de protocoles d’immunohistochimie nécessite des méthodologies spécifiques de préparation d’échantillons et d’anticorps anti-PrP. Le présent protocole décrit les étapes clés du démasquage des épitopes pour assurer un immunomarquage approprié de la PrP et minimiser la coloration de fond non spécifique. De plus, cette approche tient compte des mesures de biosécurité lors de la réalisation d’études immunohistochimiques avec les tissus infectés par des prions.

Abstract

Les protéines prions anormales (PrP^Sc) sont l’isoforme associée à la maladie de la protéine prion cellulaire et les marqueurs diagnostiques des encéphalopathies spongiformes transmissibles (EST). Ces maladies neurodégénératives affectent les humains et plusieurs espèces animales et comprennent la tremblante du mouton, l’encéphalopathie spongiforme bovine (ESB), la maladie débilitante chronique des cervidés (MDC) et la maladie à prions du chameau (MPC) nouvellement identifiée. Le diagnostic des EST repose sur l’immunodétection de la PrP^Sc par application de méthodes d’immunohistochimie (IHC) et d’immunoblot occidental (WB) sur les tissus de l’encéphale, à savoir le tronc cérébral (niveau obex). L’IHC est une méthode largement utilisée qui utilise des anticorps primaires (monoclonaux ou polyclonaux) contre les antigènes d’intérêt dans les cellules d’une section de tissu. La liaison anticorps-antigène peut être visualisée par une réaction de couleur qui reste localisée dans la zone du tissu ou de la cellule où l’anticorps a été ciblé. Ainsi, dans les maladies à prions, comme dans d’autres domaines de recherche, les techniques d’immunohistochimie ne sont pas uniquement utilisées à des fins diagnostiques, mais aussi dans les études de pathogenèse. Ces études consistent à détecter les profils et les types^{PrP Sc} à partir de ceux décrits précédemment afin d’identifier les nouvelles souches de prions. Comme l’ESB peut infecter les humains, il est recommandé d’utiliser des installations et/ou des pratiques de laboratoire de biosécurité de niveau 3 (BSL-3) pour manipuler des échantillons de bovins, de petits ruminants et de cervidés inclus dans la surveillance des EST. De plus, il est recommandé d’installer de l’équipement de confinement et de l’équipement dédié aux prions, dans la mesure du possible, afin de limiter la contamination. La procédure^{PrP Sc} IHC consiste en une étape de démasquage de l’épitope de l’acide formique agissant également comme une mesure d’inactivation des prions, car les tissus fixés au formol et incorporés à la paraffine utilisés dans cette technique restent infectieux. Lors de l’interprétation des résultats, il faut veiller à distinguer l’immunomarquage non spécifique du marquage cible. À cette fin, il est important de reconnaître les artefacts d’immunomarquage obtenus chez des animaux témoins EST négatifs connus afin de les différencier des types d’immunomarquage^{PrP Sc} spécifiques, qui peuvent varier entre les souches d’EST, les espèces hôtes et le génotype prnp , décrits plus en détail dans le présent document.

Introduction

Selon l’hypothèse du prion, l’isoforme anormale (PrP^Sc) est le composant principal, ou unique, de l’agent infectieux dans les encéphalopathies spongiformes transmissibles (EST). La confirmation du diagnostic des EST repose sur l’immunodétection de la PrP^Sc par application de protocoles d’immunohistochimie (IHC) et/ou de méthodes d’immunotransfert occidental (WB) des tissus de l’encéphale¹.

L’IHC est une méthode utilisant des anticorps monoclonaux ou, dans certains cas, polyclonaux (comme anticorps primaires) comme première étape dans l’immunomarquage d’antigènes d’intérêt spécifiquement ciblés situés dans les cellules d’une section de tissu. Toute liaison anticorps-antigène primaire efficace est ensuite visualisée à l’aide d’anticorps secondaires spécifiques aux anticorps primaires. Ces anticorps secondaires sont conjugués à des enzymes, telles que la peroxydase de raifort (HRP) ou la phosphatase alcaline (AP). La visualisation est ensuite réalisée en ajoutant un substrat à ces enzymes, produisant des produits de couleur insolubles localisés dans les zones où les anticorps primaires sont liés aux antigènes ciblés. Une meilleure visualisation peut être obtenue par contre-coloration, dans laquelle un colorant est utilisé pour créer un contraste entre les tissus immunomarqués et non immunomarqués².

Avec l’IHC utilisant des tissus incorporés à la paraffine fixés au formol (FFPE), la fixation du formol peut annuler l’efficacité des anticorps primaires en raison de la réticulation par le formaldéhyde et du chauffage et de la déshydratation pendant l’incorporation de la paraffine. Ceux-ci modifient la conformation des protéines, détruisant, dénaturant ou masquant les épitopes, diminuant ou abrogeant ainsi leur détection³. En tant que tel, cela nécessite la récupération d’antigènes (AR). Les techniques AR perturbent la réticulation du groupe chimique lié au formaldéhyde dans les molécules antigéniques, restaurant ou démasquant ainsi la conformation antigène-protéine d’origine. Il en résulte la récupération de l’affinité anticorps-antigène (épitope) pour l’immunomarquage. L’efficacité éventuelle de l’EI dépend des qualités de l’antigène ciblé et/ou de l’anticorps primaire².

La récupération de l’antigène (épitope) induite par la chaleur (HIER) est une procédure du RA³ et est couramment utilisée pour la détection de la^{PrP Sc} IHC, comme décrit ici. L’IHC est essentielle pour le diagnostic et utilisée dans les laboratoires de recherche pour déterminer la distribution tissulaire d’un antigène associé à une pathologie. Il est largement utilisé dans le diagnostic et la recherche sur le cancer, les neurosciences et les maladies infectieuses⁴, entre autres. Pour les EST, l’IHC joue un rôle important dans le diagnostic et la recherche pour confirmer et étudier la distribution de^{PrP Sc} dans les hôtes naturels et les modèles expérimentaux. IHC contribue aux études de pathogenèse des prions et à l’analyse des types et des profils de dépôt de^{PrP Sc} , notamment dans les tissus neuraux⁵, afin de détecter les écarts par rapport aux infections décrites systématiquement et d’identifier les nouvelles souches présumées de prions.

Étant donné que les prions de l’encéphalopathie spongiforme bovine (ESB) peuvent infecter les humains, certains protocoles de laboratoire impliqués dans le travail avec l’ESB peuvent nécessiter l’utilisation d’installations et de pratiques BSL-3⁶. Il s’agit notamment de l’utilisation d’un contenant secondaire scellé pour transporter des échantillons de tissus potentiellement infectés par l’ESB à l’intérieur de l’institut et du laboratoire. Il comprend également la désignation de zones de confinement et d’équipement dédié aux prions pour la recherche et l’analyse de l’ESB, dans la mesure du possible. Ceci est fait pour prévenir la contamination à l’extérieur de la zone de travail et fournir un espace confiné puisque des procédures de décontamination deviennent nécessaires.

Par conséquent, le Laboratoire de pathologie de l’INIAV suit les installations et les pratiques recommandées de niveau de biosécurité 3 (BSL-3)⁶ pour gérer les échantillons potentiels de tissus infectés par des prions provenant de bovins, de petits ruminants et de cervidés associés à la surveillance des EST.

Les tissus fixés au formol et incorporés dans la paraffine inclus dans les procédures de diagnostic ou de recherche sur les EST, en particulier dans le système nerveux central, peuvent être potentiellement infectieux. Par conséquent, ces tissus fixes doivent être traités avec de l’acide formique pour réduire l’infectiosité des prions, s’ils sont présents, avant le traitement des tissus. Ceci est effectué en plaçant des tissus fixes et coupés (environ 2-4 mm d’épaisseur) dans une cassette de traitement. La cassette est ensuite immergée dans de l’acide formique à 98% (pendant 1 h). Après immersion, les cassettes avec des mouchoirs sont lavées à l’eau courante du robinet pendant 30 minutes et retournées au fixateur avant un traitement ultérieur. Si les coupes de tissus ne sont pas traitées avant le traitement, les coupes de tissus post-microtomiques doivent être immergées dans de l’acide formique non dilué pendant au moins 5 minutes avant coloration histologique⁷. Le protocole IHC pour PrP^Sc comprend une étape de démasquage systématique des épitopes de l’acide formique, servant également à inactiver les prions⁷. Après ces étapes d’inactivation des prions, les tissus fixes résultants peuvent ensuite être traités à BSL-2 en utilisant les pratiques standard BSL-2.

L’exigence minimale d’échantillonnage tissulaire pour le diagnostic des EST chez tout animal inclus dans la surveillance des EST est la collecte du tronc cérébral (au niveau obex). En outre, pour détecter l’ESB atypique et la tremblante, il est conseillé de prélever également une partie du cervelet ^1,8. Pour le diagnostic de la MDC, les ganglions lymphatiques du tronc cérébral (obex) et du rétropharynx doivent être testés, car la PrP Sc pourrait être détectée dans les tissus lymphoïdes sans PrP^Sc détectable dans l’obex⁹, examinée par Machado et ^coll.10.

La partie obex du tronc cérébral comprend les sites cibles diagnostiques des EST, à savoir le noyau vagal dorsal (DVN), le noyau solitaire (STN) et le noyau du tractus rachidien du nerf trijumeau (V). Ces zones présentent systématiquement une accumulation bilatérale de PrP^Sc , même aux premiers stades de l’ESB et de la tremblante classique. Dans les cas cliniques d’EST avancée, toutes les zones de matière grise du tronc cérébral présentent une distribution étendue de PrP^{Sc 11}.

Avant la section et le traitement, les échantillons de cerveau sont évalués (Figure 1) pour déterminer le niveau d’autolyse et la présence de toute lésion tissulaire susceptible de compromettre l’adéquation de l’échantillon pour un diagnostic de confirmation basé sur l’IHC⁸. Pour valider l’intégrité des protocoles de préparation et des résultats d’analyse, les échantillons de tissus positifs et négatifs aux EST sont inclus comme témoins en conjonction avec la préparation de tissus à partir de cas d’essai dans chaque essai.

Figure 1 : La procédure^{PrP Sc} IHC. Représentation montrant la séquence étape par étape de la procédure^{PrP Sc} IHC depuis la déparaffinisation des coupes tissulaires jusqu’à l’immunomarquage et la détection éventuels (FFPE – Paraffine fixée au formol – Embedded de paraffine; Mab – anticorps monoclonal; DAB – 3,3′ diaminobenzidine). Cette figure a été créée en BioRender.com. Veuillez cliquer ici pour voir une version agrandie de cette figure.

Protocol

La procédure IHC décrite ici est une composante du projet de recherche FAIRJ-CT98-7021, « La création d’un réseau européen pour la surveillance des EST des ruminants et la normalisation et l’harmonisation du processus et des critères pour l’identification des cas suspects ». Il suit les critères diagnostiques définis par l’Organisation mondiale de la santé animale, WOAH (anciennement Office international des épizooties, OIE)1 et le Laboratoire européen de référence pour le…

Representative Results

Étant donné qu’un immunomarquage ciblé non spécifique est possible, il est important de déterminer le niveau d’immunomarquage non spécifique chez les animaux témoins EST négatifs connus. Il s’agit d’une étape importante pour interpréter correctement l’immunomarquage spécifique de PrPSc 7 (Figure 2). On a noté que le marquage non ciblé par les anticorps anti-PrP se présentait sous la forme d’une coloration intraneuronale d…

Discussion

Les EST sont des zoonoses potentielles. Après l’apparition de l’ESB en 1986 au Royaume-Uni, le Portugal est devenu l’un des États membres de l’Union européenne où l’incidence de cette maladie était la plus élevée^14,15. Afin de lutter contre cette maladie, d’autres EST qui ont émergé (tremblante classique et atypique, variantes de l’ESB, et actuellement la surveillance de la maladie débilitante chronique chez les cervidés), des mécanismes…

Materials

Absolute ethanol	Labchem	LB0507-9010	Undituled
			Diluted 90%, 70% and 50% in distilled water
Avidin-biotin complex and peroxidase Vectastain Elite ABC kit Peroxidase	Vector Laboratories	PK-6100	Prepare and gently mix 30 min before use according to kit instructions. Do not mix after standing.
Biotinylated secondary antibody (Horse anti-mouse IgG H+L)	Vector Laboratories	BA-2000-1.5	Dilute at 1/200 in TBS with 10% horse normal serum. Prepare the volume required depending on the number of sections.
Chromogen Diaminobenzidine- DAB, substrate kit, Peroxidase	Vector Laboratories	SK-4100	Prepare before use according to kit instructions. Use 400 µL of solution per section.
DakoCytomation Pascal pressure chamber	DAKO	S2800
Ehrlich’s Hematoxylin:
Hematoxylin	Merck	115938	Dissolve 2 g of hematoxylin in 100 mL of absolute ethanol. Add 100 mL of distilled water, 10 mL of glacial acetic acid and 15 g of potassium alum with constant stirring. Add 100 mL of glycerin. The natural oxidation process takes 2 months, before use.
Absolute ethanol	Labchem	LB0507-9010
Glacial acetic acid	Merck	101830
Potassium alum	Merck	1.01047.1000
Glycerin	Merck	1.04091.1000
Endogenous Peroxidase Block solution (3% concentration H2O2):			40 mL Hydrogen peroxide (30% w/w) in 360 mL Methanol. Prepare before use
Hydrogen peroxide (30% w/w)	Scharlau	HI0136
Methanol	Sigma Aldrich	322415-2L
Formic acid 98%	Merck	1.00264.1000	Undiluted
Microtome	Shandon-AS325	Microtome	Shandon-AS325
Mounting medium Entellan	Merck	107960	Ready- to- use.
Normal serum (20% ) block solution in TBS: Horse normal serum	Gibco	16050-122	Prepare final volume according to the number of sections in the assay (200 µL of solution per section).
Primary antibody anti-PrP Mouse MAb 2G11	BIORAD	MCA2460	PrP 146-R154R171182 Ovine including atypical scrapie, cervine, feline. Not suitable for bovine. According to the number of sections in the assay (200 µL of solution per section) and antibody dilution, prepare final volume in TBS supplemented with 10% of normal serum from the species the secondary antibody was raised in (horse normal serum) Usual antibody dilution: MAb 2G11 1/100 but working dilution should be established in every new batch to get the concentration to give the strongest labelling with lowest background. For storage, freeze aliquot volumes of a minimum of 10 μL into sterile microtubes. Defrost and use one aliquot at a time.
Primary antibody anti-PrP Mouse MAb 12F10	Cayman  Chemical Company	189710	PrP142-160 Bovine, not suitable for ovine Usual antibody dilution: 1/200 but working dilution should also be established. Prepare as MAb 2G11
Shandon CoverplateTM chamber	Thermo Scientific	72110017
Shandon Sequenza® Immunstaining center	Thermo Scientific	73300001
Shandon Sequenza® Immunstaining slide rack	Thermo Scientific	73310017
Solution Citrate Buffer (10 mM pH 6.1):			2.55 g Tri-sodium citrate dihydrate  and 0.255 g Citric acid in one litre purified water. Adjust pH of working solution to 6.1 using 10 mM citric acid solution (1.05 g citric acid in 500 mL purified water) Prepare on assay day.
Tri-sodium citrate dihydrate	Sigma-aldrich	S4641-500G
Citric acid	Sigma Aldrich	C0759
Staining jar and basket	Deltalab	19360
		19361
Superfrost Plus microscope slides	VWR	631-0108
Tris-Buffered Saline solution (TBS) (50 mM TRIZMA BASE; 0.8% NaCI; pH 7.6):			10xTBS (stock solution 0.5 M TRIZMA BASE; 8% NaCI; pH 7.6): TRIZMA BASE 60,57 g and NaCl 80 g in 800 mL purified water. Adjust pH of stock solution using Hydrochloric acid 37% and final volume to one litre with purified water (keep 5± 3 °C until 2 months) Dilute TBS stock solution 1/10 on assay day.
TRIZMA BASE	Sigma Aldrich	T6066-1KG
Sodium Chloride (NaCl)	Merck	106404
Xylene	Panreac Applied Chem ITW reagents	251769	Undiluted