Enrichissement de cultures de neurones ganglionnaires de la racine dorsale de souris adultes par immunopanoramique
Summary
Cet article décrit un protocole d’immunopanoramique pour les ganglions de la racine dorsale de souris adultes. En adhérant des anticorps aux plaques de culture, nous pouvons sélectionner négativement et éliminer les cellules non neuronales. Nous montrons que les cultures sont enrichies pour les neurones en utilisant ce protocole, permettant une étude approfondie des réponses neuronales à la manipulation.
Abstract
Les ganglions radiculaires dorsaux (DRG) sont des structures périphériques adjacentes à la corne dorsale de la moelle épinière, qui abritent les corps cellulaires des neurones sensoriels ainsi que divers autres types de cellules. Les protocoles de culture publiés se réfèrent souvent à des cultures DRG dissociées entières comme étant neuronales, malgré la présence de fibroblastes, de cellules de Schwann, de macrophages et de lymphocytes. Bien que ces cultures DRG entières soient suffisantes pour les applications d’imagerie où les neurones peuvent être discernés en fonction de la morphologie ou de la coloration, les homogénats de protéines ou d’ARN collectés à partir de ces cultures ne sont pas principalement d’origine neuronale. Ici, nous décrivons une séquence d’immunopanoramique pour les DRG de souris en culture. Le but de cette méthode est d’enrichir les cultures DRG pour les neurones en supprimant d’autres types de cellules. L’immunopanning fait référence à une méthode d’élimination des types de cellules en adhérant des anticorps aux boîtes de culture cellulaire. En utilisant ces plats, nous pouvons sélectionner négativement et réduire le nombre de fibroblastes, de cellules immunitaires et de cellules de Schwann en culture. Cette méthode nous permet d’augmenter le pourcentage de neurones dans les cultures.
Introduction
Les ganglions radiculaires dorsaux (DRG) abritent les corps cellulaires des neurones sensoriels qui innervent les tissus périphériques. L’étude de ces neurones nous permet de comprendre les fondements mécanistes de la douleur et des conditions sensorielles. Cependant, les DRG ne sont pas composés uniquement de neurones, mais contiennent également des fibroblastes, des cellules de Schwann, des macrophages et d’autres cellules immunitaires1. Malgré la présence de ces différents types de cellules, les cultures DRG entières sont souvent appelées neuronales 2,3 dans la littérature. Ces cultures sont toujours utiles pour l’investigation neuronale par imagerie ou cytométrie en flux, ce qui permettrait une identification neuronale par coloration, taille cellulaire et/ou morphologie. Cependant, pour des tests tels que la réaction en chaîne de la polymérase (PCR) ou le Western blotting, où les cultures sont homogénéisées pour la collecte d’ARN ou de protéines, la présence de types de cellules non neuronales peut interférer avec les résultats. Par conséquent, il est nécessaire d’augmenter la proportion de cellules neuronales dans les cultures DRG.
L’immunopanning est une technique utilisée pour purifier une variété de types de cellules, y compris les neurones corticaux, les astrocytes, les cellules précurseurs d’oligodendrocytes et la microglie. En termes simples, il s’agit d’adhérer un anticorps contre un marqueur de surface cellulaire à une boîte de Pétri, destiné à lier certaines cellules (Figure 1), et il peut être utilisé pour sélectionner soit pour ou contre des types de cellules d’intérêt 4,5,6. L’immunopanning de DRG embryonnaires de rat à sélectionner contre les cellules non neuronales a été décrit précédemment par Zuchero7. Cependant, nous n’avons pas été en mesure de trouver un protocole d’immunopanoramique spécifique aux DRG de souris. Dans ce protocole, nous nous appuyons sur les tenants de base du protocole Zuchero, mais nous adaptons plutôt la séquence d’immunopanoramique pour enrichir les cultures DRG de souris adultes (Figure 2). Il s’agit d’un outil puissant pour étudier les neurones sensoriels établis en culture. Il est avantageux car il permet l’utilisation de souris adultes à partir de modèles génétiques, de maladies et de blessures, de sorte que leurs neurones sensoriels peuvent être étudiés avec plus de spécificité.
Ce protocole est avantageux pour les lecteurs qui cherchent à augmenter la proportion de neurones dans les cultures DRG de souris adultes. Cependant, les étapes d’immunopanoramique peuvent également être omises, et ce protocole peut également être utilisé pour des cultures DRG entières.
Protocol
Representative Results
Discussion
Ce protocole d’immunopanoramique augmente la proportion de cellules neuronales dans les cultures primaires DRG. Pour de meilleurs résultats, les dissections doivent être effectuées en temps opportun et les DRG doivent être débarrassés de l’excès de nerfs. L’étape de dissociation doit être surveillée attentivement et ne doit pas dépasser 1 h pour éviter que les cellules ne subissent un stress inutile. En ce qui concerne l’immunopanoramique en particulier, chaque plaque doit être doucement tourbillonn?…
Divulgazioni
The authors have nothing to disclose.
Acknowledgements
Ces travaux ont été financés par une subvention Projet des Instituts de recherche en santé du Canada (FRN-162434) et une subvention à la découverte de la Société canadienne de la SP (EGID-3761). Les auteurs tiennent à remercier le Dr Sun et le Cross Cancer Institute pour la formation et l’utilisation du système ImageXpress.
Materials
| 0.2 um Syringe filters | Fisher | 723-2520 | |
| 100 mm petri dishes | ThermoFisher | FB0875712 | |
| 24 well black glass-bottom plates | Cellvis | P24-1.5H-N | |
| 70 um cell strainer | Cedarlane | 15-1070-1(BI) | |
| B27+ supplement | Gibco | A3582801 | |
| Bovine Serum Albumin | Sigma Aldrich | A7906 | for 15% BSA cushion, and ICC (heat shock fraction ≥98%) |
| Bovine Serum Albumin | Sigma Aldrich | A4161 | for 4% BSA for immunopanning, and SATO for media (essentially globulin free, suitable for cell culture, ≥99%) |
| CD45 antibody | BD Pharmigen | 550539 | |
| DAPI | Invitrogen | D1306 | |
| DMEM | Gibco | 11960069 | |
| DNAse | Worthington | LS002007 | for stemxyme solution and panning buffer |
| D-PBS | Sigma Aldrich | D8662 | |
| EBSS | Sigma Aldrich | E6267 | for DNAse solution |
| Filter paper P8 grade | ThermoFisher | 09-795K | for 8% PFA |
| Glutamax | ThermoFisher | 35050061 | |
| goat-anti-mouse IgG | Jackson Immunoresearch | 115-005-020 | for O4 dish |
| goat-anti-rabbit 488 | Invitrogen | A11008 | |
| goat-anti-rabbit IgG | Jackson Immunoresearch | 115-005-003 | for PDGFRB dish |
| goat-anti-rat IgG | Jackson Immunoresearch | 115-005-044 | for CD45 dish |
| HBSS -/- | Sigma Aldrich | 14175145 | |
| Insulin | Sigma Aldrich | I2643 | |
| laminin | Invitrogen | 23017-015 | |
| N-acetyl cysteine | Sigma Aldrich | A8199 | |
| Neurobasal | Gibco | 21103049 | |
| Normal Donkey Serum | Sigma-Aldrich | D9663 | |
| O4 antibody | n/a | n/a | Hybridoma |
| Ovomucoid trypsin inhibitor | Cedarlane | LS003086 | for low ovo |
| paraformaldehyde prills | Sigma Aldrich | 441244 | for 8% PFA |
| PDGFRB antibody | Abcam | AB32570 | |
| penicillin/ streptomycin | Gibco | 15140-122 | |
| Poly-D-Lysine | Sigma Aldrich | P6407 | |
| Progesterone | Sigma Aldrich | P8783 | for SATO |
| Putrescine dihydrochrloride | Sigma Aldrich | P5780 | for SATO |
| Sodium phosphate dibasic | Fisher | S374-1 | for 0.2 M PB |
| Sodium Phosphate monobasic dihydrate | Sigma Aldrich | 04269 | for 0.2 M PB |
| Sodium Pyruvate | ThermoFisher | 11360070 | |
| Sodium Selenite | Sigma Aldrich | S5261 | for SATO |
| Stemxyme I | Cedarlane | LS004107 | for tissue dissociation; combination collagenase |
| Transferrin | Sigma Aldrich | T1147 | for SATO |
| Tris-HCl | Millipore Sigma | T5941 | |
| trypan blue | Gibco | 15250-061 | |
| β3-Tubulin | Sigma-Aldrich | T2200 |
Riferimenti
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- Lin, Y. T., Chen, J. C. Dorsal root ganglia isolation and primary culture to study neurotransmitter release. Journal of Visualized Experiments:JoVE. (140), e57569 (2018).
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- Viveiros, A., et al. In-cell labeling coupled to direct analysis of extracellular vesicles in the conditioned medium to study extracellular vesicles secretion with minimum sample processing and particle loss. Cells. 11 (3), 351 (2022).
