Enriquecimiento de cultivos de neuronas de ganglios de la raíz dorsal de ratones adultos mediante inmunopanización
Summary
Este artículo describe un protocolo de inmunopanopanización para los ganglios de la raíz dorsal del ratón adulto. Al adherir anticuerpos a las placas de cultivo, podemos seleccionar y eliminar negativamente las células no neuronales. Mostramos que los cultivos se enriquecen para las neuronas utilizando este protocolo, lo que permite un estudio en profundidad de las respuestas neuronales a la manipulación.
Abstract
Los ganglios de la raíz dorsal (GRD) son estructuras periféricas adyacentes al asta dorsal de la médula espinal, que albergan los cuerpos celulares de las neuronas sensoriales, así como varios otros tipos de células. Los protocolos de cultivo publicados a menudo se refieren a cultivos DRG disociados completos como neuronales, a pesar de la presencia de fibroblastos, células de Schwann, macrófagos y linfocitos. Si bien estos cultivos DRG completos son suficientes para aplicaciones de imágenes donde las neuronas se pueden discernir en función de la morfología o la tinción, los homogeneizados de proteínas o ARN recolectados de estos cultivos no son principalmente de origen neuronal. Aquí, describimos una secuencia de inmunopanopanización para DRG de ratón cultivados. El objetivo de este método es enriquecer los cultivos de DRG para las neuronas mediante la eliminación de otros tipos de células. El inmunopanning se refiere a un método para eliminar tipos de células mediante la adhesión de anticuerpos a placas de cultivo celular. Usando estos platos, podemos seleccionar negativamente y reducir el número de fibroblastos, células inmunes y células de Schwann en cultivo. Este método nos permite aumentar el porcentaje de neuronas en cultivos.
Introduction
Los ganglios de la raíz dorsal (GRD) albergan los cuerpos celulares de las neuronas sensoriales que inervan los tejidos periféricos. El estudio de estas neuronas nos permite comprender los fundamentos mecanicistas del dolor y las condiciones sensoriales. Sin embargo, los DRG no están compuestos solo por neuronas, sino que también contienen fibroblastos, células de Schwann, macrófagos y otras células inmunes1. A pesar de la presencia de estos diversos tipos de células, los cultivos DRG completos a menudo se denominan neuronales 2,3. Estos cultivos siguen siendo útiles para la investigación neuronal mediante imágenes o citometría de flujo, lo que permitiría la identificación neuronal por tinción, tamaño celular y/o morfología. Sin embargo, para ensayos como la reacción en cadena de la polimerasa (PCR) o el western blotting, donde los cultivos se homogeneizan para la recolección de ARN o proteínas, la presencia de tipos de células no neuronales puede interferir con los resultados. Por lo tanto, existe la necesidad de aumentar la proporción de células neuronales en los cultivos DRG.
El inmunopanning es una técnica utilizada para purificar una variedad de tipos de células, incluidas las neuronas corticales, los astrocitos, las células precursoras de oligodendrocitos y la microglía. En palabras simples, implica adherir un anticuerpo contra un marcador de superficie celular a una placa de Petri, destinado a unir ciertas células (Figura 1), y puede usarse para seleccionar a favor o en contra de los tipos celulares de interés 4,5,6. Zuchero7 ha descrito previamente DRG embrionarios de rata inmunopandeando para seleccionar contra células no neuronales. Sin embargo, no hemos podido encontrar un protocolo de inmunopanopanización específico para los DRG de ratón. En este protocolo, nos basamos en los inquilinos básicos del protocolo Zuchero, pero en su lugar adaptamos la secuencia de inmunopanopanización para enriquecer los cultivos DRG de ratones adultos (Figura 2). Esta es una herramienta poderosa para estudiar neuronas sensoriales establecidas en cultivo. Es ventajoso ya que permite el uso de ratones adultos a partir de modelos genéticos, de enfermedad y lesiones, de modo que sus neuronas sensoriales pueden estudiarse con mayor especificidad.
Este protocolo es ventajoso para los lectores que buscan aumentar la proporción de neuronas en cultivos DRG de ratones adultos. Sin embargo, los pasos de inmunopanización también se pueden omitir, y este protocolo también se puede usar para cultivos DRG completos.
Protocol
Representative Results
Discussion
Este protocolo de inmunopanización aumenta la proporción de células neuronales en cultivos primarios de DRG. Para obtener los mejores resultados, las disecciones deben hacerse de manera oportuna, y los DRG deben recortarse del exceso de nervios. El paso de disociación debe ser monitoreado cuidadosamente, y no debe exceder 1 h, para evitar que las células sufran un estrés innecesario. Con respecto a la inmunopanorámica específicamente, cada placa debe girarse suavemente en el punto medio para permitir que las cél…
Divulgazioni
The authors have nothing to disclose.
Acknowledgements
Este trabajo fue apoyado por una subvención de proyecto de los Institutos Canadienses de Investigación en Salud (FRN-162434) y una subvención de descubrimiento de la Sociedad de EM de Canadá (EGID-3761). Los autores desean agradecer al Dr. Sun y al Cross Cancer Institute por la capacitación y el uso del sistema ImageXpress.
Materials
| 0.2 um Syringe filters | Fisher | 723-2520 | |
| 100 mm petri dishes | ThermoFisher | FB0875712 | |
| 24 well black glass-bottom plates | Cellvis | P24-1.5H-N | |
| 70 um cell strainer | Cedarlane | 15-1070-1(BI) | |
| B27+ supplement | Gibco | A3582801 | |
| Bovine Serum Albumin | Sigma Aldrich | A7906 | for 15% BSA cushion, and ICC (heat shock fraction ≥98%) |
| Bovine Serum Albumin | Sigma Aldrich | A4161 | for 4% BSA for immunopanning, and SATO for media (essentially globulin free, suitable for cell culture, ≥99%) |
| CD45 antibody | BD Pharmigen | 550539 | |
| DAPI | Invitrogen | D1306 | |
| DMEM | Gibco | 11960069 | |
| DNAse | Worthington | LS002007 | for stemxyme solution and panning buffer |
| D-PBS | Sigma Aldrich | D8662 | |
| EBSS | Sigma Aldrich | E6267 | for DNAse solution |
| Filter paper P8 grade | ThermoFisher | 09-795K | for 8% PFA |
| Glutamax | ThermoFisher | 35050061 | |
| goat-anti-mouse IgG | Jackson Immunoresearch | 115-005-020 | for O4 dish |
| goat-anti-rabbit 488 | Invitrogen | A11008 | |
| goat-anti-rabbit IgG | Jackson Immunoresearch | 115-005-003 | for PDGFRB dish |
| goat-anti-rat IgG | Jackson Immunoresearch | 115-005-044 | for CD45 dish |
| HBSS -/- | Sigma Aldrich | 14175145 | |
| Insulin | Sigma Aldrich | I2643 | |
| laminin | Invitrogen | 23017-015 | |
| N-acetyl cysteine | Sigma Aldrich | A8199 | |
| Neurobasal | Gibco | 21103049 | |
| Normal Donkey Serum | Sigma-Aldrich | D9663 | |
| O4 antibody | n/a | n/a | Hybridoma |
| Ovomucoid trypsin inhibitor | Cedarlane | LS003086 | for low ovo |
| paraformaldehyde prills | Sigma Aldrich | 441244 | for 8% PFA |
| PDGFRB antibody | Abcam | AB32570 | |
| penicillin/ streptomycin | Gibco | 15140-122 | |
| Poly-D-Lysine | Sigma Aldrich | P6407 | |
| Progesterone | Sigma Aldrich | P8783 | for SATO |
| Putrescine dihydrochrloride | Sigma Aldrich | P5780 | for SATO |
| Sodium phosphate dibasic | Fisher | S374-1 | for 0.2 M PB |
| Sodium Phosphate monobasic dihydrate | Sigma Aldrich | 04269 | for 0.2 M PB |
| Sodium Pyruvate | ThermoFisher | 11360070 | |
| Sodium Selenite | Sigma Aldrich | S5261 | for SATO |
| Stemxyme I | Cedarlane | LS004107 | for tissue dissociation; combination collagenase |
| Transferrin | Sigma Aldrich | T1147 | for SATO |
| Tris-HCl | Millipore Sigma | T5941 | |
| trypan blue | Gibco | 15250-061 | |
| β3-Tubulin | Sigma-Aldrich | T2200 |
Riferimenti
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