Den nåværende protokollen viser hvordan man skiller CD3−/CD45+CD56+-celler med mild cytotoksisitet fra humane utvidede potensielle stamceller (hEPSC) under både 3D- og 2D-kulturforhold. Dette muliggjør rutinemessig fenotypisk validering uten ødeleggelse av det komplekse mikromiljøet.
Differensieringen av naturlige dreperceller (NK) fra humane pluripotente stamceller muliggjør forskning på og fremstilling av kliniske cellulære produkter for immunterapi. Beskrevet her er en tofaseprotokoll som bruker et serumfritt kommersielt medium og en cocktail av cytokiner (interleukin [IL]-3, IL-7, IL-15, stamcellefaktor [SCF] og FMS-lignende tyrosinkinase 3-ligand [Ftl3L]) for å skille humane utvidede potensielle stamceller (hEPSC) til celler som har NK-celleegenskaper in vitro med både 3-dimensjonal (3D) og 2-dimensjonal (2D) kulturteknologi. Etter denne protokollen genereres CD3−CD56+ eller CD45+CD56+ NK-celler konsekvent. Når de er kokulturert med tumormål i 3 timer, viser de differensierte produktene mild cytotoksisitet sammenlignet med en IL-2-uavhengig permanent cellelinje, NK92mi-celler. Protokollen bevarer kompleksiteten til differensieringsmikromiljøet ved generering av 3D-strukturer, og letter dermed studiet av romlige forhold mellom immunceller og deres nisjer. I mellomtiden muliggjør 2D-kultursystemet rutinemessig fenotypisk validering av celledifferensiering uten å skade den delikate differensieringsnisjen.
Sammenlignet med konvensjonelle pluripotente stamceller som humane embryonale stamceller (hESCs) og humaninduserte pluripotente stamceller (hiPSCs), er humane utvidede potensielle stamceller (hEPSC) nærmere totipotenstilstanden, da de kan differensiere i både ekstraembryonale og embryonale linjer1. For eksempel kan hEPSC differensieres til trofoblaster1 og eggeplomme-sac-lignende celler2. For å oppnå den unike styrken til hEPSC, dyrkes en individuell blastomer i et medium som inneholder flere små molekyler som hemmer avstamningsforpliktelsessignalering1, som refereres til som EPSC-medium (EPSCM). Dyrking av hESC og hiPSC i EPSCM utvider deres tidligere begrensede potens for å differensiere dem til trofoblastceller1.
Pluripotente stamceller er et verdifullt forskningsverktøy for å eksperimentere med nye genetiske modifikasjoner. På grunn av selvfornyelses- og differensieringskapasiteten til pluripotente stamceller, kan en transformert klon av en pluripotent stamcelle produsere differensierte cellulære produkter som har samme genetiske modifikasjon på samme sted. Zhu og Kaufman etablerte standarden for NK-celledifferensiering fra konvensjonelle pluripotente stamceller (hESC og hiPSCs)3. Først induserte de hematopoietiske stamceller (HSC) fra et embryoid legeme avledet fra pluripotente stamceller. Tilsetningen av stamcellefaktor (SCF), FMS-lignende tyrosinkinase 3-ligand (Ftl3L), interleukin (IL)-7, IL-15 og et tidlig tilskudd av IL-3 forstyrret HSCene til å utvikle seg til naturlige dreperceller (NK). Deretter utvidet de NK-cellene med kunstige antigenpresenterende celler (aAPCs), som presenterer membranbundet IL-21, med kontinuerlig tilskudd av IL-2. Forskere har brukt denne tilnærmingen til immunterapi for å generere iPSC-avledede naturlige drepeceller utstyrt med den kimære antigenreseptoren (CAR-iNK)4.
Humane NK-celler er definert som CD3-CD56+ leukocytter i perifert blod. De er effektorer mot virusinfiserte celler og tumorceller5. Noen hemmende reseptorer på NK-celler gjenkjenner molekyler uttrykt allestedsnærværende i normale celler. Som et eksempel gjenkjenner NKG2A / CD94-heterodimeren uttrykt på NK-celler MHC klasseI-molekyler 5. I mellomtiden gjenkjenner de aktiverende reseptorene på NK-celler stressinduserte ligander, som hvordan NKG2D gjenkjenner transformasjonsindusert MHC klasse I polypeptidrelatert sekvens A (MICA / MICB) 6. Noen transformerte celler nedregulerer sine “selvligander” for å unnslippe immunovervåking og oppregulere avvikende ligander, noe som utløser NK-cellene til å utføre sitt lytiske maskineri. Den iboende antitumorevnen til NK-celler har brakt oppmerksomhet til denne immuncelletypen.
Evnen til samtidig å gi opphav til både embryonale og ekstraembryonale linjer kan gjøre hEPSC til en mer trofast rekapitulering av den embryonale utviklingsnisjen enn konvensjonelle pluripotente stamceller. Av erfaring er det lettere å opprettholde styrken til hEPSC enn hiPSCs. I denne studien ble det utviklet en protokoll (figur 1) for å skjevhet hEPSCs for å utvikle seg til hematopoietiske linjer og senere differensiere stamceller til naturlige dreperceller (NK) in vitro. I protokollen brukes kommersielle medier for å unngå seruminkonsekvenser, etterfulgt av trinnvis tilsetning av cytokiner for å skjevgjøre differensiering i lymfoide linjer. Denne protokollen har to systemer for å bevare det komplekse 3D-mikromiljøet mens den utleder CD3-CD56+/CD45+CD56+-celler som fenotypisk og funksjonelt ligner humane NK-celler.
Denne protokollen kan være nyttig for å studere samspillet mellom immunceller med deres differensieringsnisjer og kan ha potensial til å rense cellulære produkter for immunterapeutisk bruk.
Det er noen viktige trinn for å sikre vellykket differensiering av CD45 + CD56 + celler fra hEPSCs. Predifferensieringen (trinn 1.2) er avgjørende siden EPSC-mediet inneholder hemmere av avstamningsforpliktelse1. Etter predifferensiering blir de kuppelformede koloniene av hEPSC flattrykt (figur 2B). Tillegg av Y27632, en rhokinasehemmer (ROCKi), under dannelsen av EB fra hEPSC (trinn 1.3) er uunnværlig for overlevelse av hEPSC etter dissosiasjon. En annen viktig faktor er antall EB-er plantet på hver transbrønn. Siden det er et lite system, er to til tre EB per transwell den optimale tettheten for å forhindre overforbruk av mediet. Luft-væske-grensesnittet opprettholdes under hele løpet av NK-celledifferensiering for 3D-systemet, som antas å opprettholde polariteten til stromale celler og støtte utvidelsen av AGM-avledede hematopoietiske progenitorer14,15.
Som nevnt tidligere er tettheten av EB på transbrønnen en avgjørende faktor for vellykket differensiering. Nøkkeltegnet for dette er fargen på mediet 1 dag etter implantasjonen av EB på transbrønnen. Hvis fargen blir gul raskt, indikerer dette enten forurensning eller overbefolkning. For å løse problemet bør en 1 ml pipette brukes til å manuelt plukke opp ekstra EB og overføre dem til en annen transbrønn.
En stor begrensning i denne protokollen er renheten til CD3−/CD45+ CD56+-celler i IVD-produktene, som antas å være delvis ansvarlig for den dårligere cytotoksisiteten sammenlignet med rene NK92mi-celler. Et 3D-kultursystem ble brukt til å indusere hematopoietiske forfedre via genereringen av en EB som ligner de tre embryonale kimlagene. Denne strategien etterligner utviklingen av blodceller i benmargens mikromiljø, og fjerner dermed behovet for stromale celler for å støtte differensieringen3. Uten et sorteringstrinn for å rense hematopoietiske forfedre, forventes renheten av IVD-produktene å bli redusert. En strategi for å beholde den komplekse differensieringsnisjen og samtidig øke renheten til endepunktsproduktet, er å utvikle en ekspansjonsmetode for de sorterte CD3-CD56+ IVD-produktene. For eksempel kan de sorterte CD3-CD56+ IVD-produktene dyrkes på kunstige antigenpresenterende celler (aAPCs), slik som bestrålte K562-celler konstruert med membranbundet IL-21. Med tilførsel av IL-2 i kulturen, kan denne metoden oppnå en 1000 ganger økning i NK-celle nummer3.
En annen begrensning er den begrensede tilgangen til bona fide humane NK-celler som en positiv referanse. NK92mi er den positive referansen som brukes i kokulturanalysen, men den er ikke nøyaktig nok. NK92mi-celler er konstruert fra NK92-celler, en permanent cellelinje som uttrykker aktiverte NK-cellefenotyper16, for autonomt å produsere IL-2 for å møte kulturkravene. NK92-celler viser overlegen drapsaktivitet mot K562-celler in vitro enn humane primære NK-celler17. En mer rettferdig sammenligning av den tumordrepende kapasiteten til IVD-produkter kan oppnås ved å analysere cytotoksisiteten til perifere blod NK-celler parallelt, men dessverre mangler tilgang til blodbanker.
Denne to-systemkulturprotokollen tar sikte på å generere CD3−/CD45+CD56+-celler fra hEPSC-er. Vurderingen av overflatemarkører og cytotoksisitet med FACS kan rutinemessig utføres på celler fra 2D-systemer uten å forstyrre differensieringsnisjen. Til tross for forskjellene i prosentandelen av CD3-CD56+-celler, kan 3D- og 2D-systemene utlede CD3-CD56+-celler med tilsvarende variasjoner i CD56-uttrykk (figur 3), og 2D-systemet gjenspeiler eksistensen av lymfoide progenitorer fra 3D-kulturtilstanden.
Betydningen av å utnytte 3D-kultursystemet er at det tillater bruk av høyoppløselige profileringsanalyser, for eksempel romlig transkriptomikk eller avbildning av massespektrometri, for å undersøke romlige forhold og celle-celle-interaksjoner innenfor den komplekse differensieringsnisjen.
The authors have nothing to disclose.
Vi vil gjerne takke Dr. Handi Cao, Sanxing GAO, David Xiang, Yiming Chao, Ritika Jogani, Owen Chan, Stephanie Cheung og Celine Chan for deres tekniske assistanse og nyttige diskusjoner. Dette arbeidet ble støttet av Platform Technology Fund. Figur 1 er laget med BioRender.com.
30 w/v% Albumin Solution, from Bovine Serum(BSA), Fatty Acid Free | Wako Chemicals | 017-22231 | For resuspending cytokines. |
ACCUMAX | STEMCELL Technologies | 07921 | |
Anti-human-CD159a-PE | BD | 375104 | During antibody staining, 0.5 µL of antibodies is added into the staining buffer (PBS + 5% FBS) |
Anti-human-CD3-APC antibodies | BD | 555355 | During antibody staining, 0.5 µL of antibodies is added into the staining buffer (PBS + 2% FBS) |
Anti-human-CD45-APC antibodies | BD | 555485 | During antibody staining, 0.5 µL of antibodies is added into the staining buffer (PBS + 3% FBS) |
Anti-human-CD56-PE antibodies | BD | 555516 | During antibody staining, 0.5 µL of antibodies is added into the staining buffer (PBS + 4% FBS) |
Anti-human-CD56-PEcy7 antibodies | BD | 335826 | During antibody staining, 0.5 µL of antibodies is added into the staining buffer (PBS + 5% FBS) |
Anti-human-CD94-APC | BD | 559876 | During antibody staining, 0.5 µL of antibodies is added into the staining buffer (PBS + 5% FBS) |
Bemis Parafilm M Laboratory Wrapping Film | Thermo Scientific | 11772644 | |
Cd244 Monoclonal Antibody (eBioC1.7 (C1.7)), Functional Grade, eBioscience | Thermo Scientific | 16-5838-85 | |
Costar 6.5 mm Transwell, 0.4 µm Pore Polyester Membrane Inserts | STEMCELL Technologies | 3470 | |
Dapi Solution, 1 mg/mL | BD | 564907 | It is resuspended with ddH2O so the concentration is 10 µM/mL. Add 1 µL of the aliquot in 300 µL of FACS buffer (PBS + 2% FBS) |
DMEM | CPOS-Bioreagent core | 11965092 | |
DMEM/F12 | Thermo Scientific | 11320033 | |
FcX, human | Biolengend | 422302 | |
Fetal Bovine Serum(FBS) qualified E.U.-approved South America | CPOS-Bioreagent core | 10270106 | |
FlowJo v10.8.0 | BD | ||
Gibco PBS (10x) pH 7.4 | CPOS-Bioreagent core | 70011044 | 10x concentrated PBS is manufactured as follows: without calcium, magnesium or phenol red |
K562 cells | ATCC | CCL-243 | |
Knockout Serum Replacement | Thermo Scientific | 10828-028 | |
MyeloCult H5100 medium | STEMCELL Technologies | 5150 | |
NK92mi cells | ATCC | CRL-2408 | Lot: 70045208. Once thawed, they are cultured in MyeloCult H5100 medium, and maintained the density between 2 x 105 to 1 x 106 cell/mL. |
Nunc Cell-Culture Treated Multidishes 12 well plate | Thermo Scientific | 150628 | flat bottom |
Nunc Cell-Culture Treated Multidishes 24 well plate | Thermo Scientific | 142475 | |
Nunc EasYDish Dishes | Thermo Scientific | 150460 | |
pLenti-GFP Lentiviral Control Vector | CELL BIOLABS | LTV-400 | It is packaged as the manufactuer suggested (https://www.cellbiolabs.com/sites/default/files/LTV-400-gfp- lentiviral-plasmid.pdf). 40 μL of 50x lentivirus is added with 1 μL 10 mg/mL polybrene per 1 mL of cell suspension. Complete medium change is performed 24 h after the addition of lentivirus. Cells are incubated undisputedly for 3 days at 37 °C, 5% CO2. |
Polybrene | EMD Millipore | TR-1003-G | |
Recombinant Human Flt-3 Ligand/FLT3L Protein | R&D Systems | 308-FK-005 | It is resuspend with PBS + 0.2% BSA. Thr working concentration is 10 ng/mL or 12 IU/mL. |
Recombinant Human IL-15 Protein | R&D Systems | 247-ILB-005 | It is resuspended with PBS + 0.2% BSA. The working concentration is 10 ng/mL or 4500 IU/mL. |
Recombinant Human IL-18/IL-1F4 Protein | R&D Systems | 9124-IL-010 | It is resuspended with PBS + 0.2% BSA. The working concentration is 50 ng/mL. The IU is not provided by the company. |
Recombinant Human IL-2 Protein | R&D Systems | 202-IL-010 | It is resuspended with PBS + 0.2% BSA. The working concentration is 50 ng/mL or 455 IU/mL. |
Recombinant Human IL-3 Protein, 50ug | PeproTech | 200-03 | It is resuspended with PBS + 0.2% BSA. The working concentration is 5 ng/mL or 14 IU/mL. |
Recombinant Human IL-7 Protein | R&D Systems | 207-IL-010 | It is resuspended with PBS + 0.2% BSA. The working concentration is 20 ng/mL or 8800 IU/mL. |
Recombinant Human SCF Protein | R&D Systems | 255-SC-010 | It is resuspended with PBS + 0.2% BSA. The working concentration is 20 ng/mL or 26 IU/mL. |
STEMdiff Hematopoietic Kit | STEMCELL Technologies | 5310 | Medium A: 45 mL STEMdiff Hematopoietic Basal Medium + STEMdiff Hematopoietic Supplement A ; Medium B: 75 STEMdiff Hematopoietic Basal Medium + STEMdiff Hematopoietic Supplement B |
StemSpan lymphoid differentiation coating material | STEMCELL Technologies | 9950 | It is resuspended in PBS (100x) |
StemSpan NK cell differentiation medium | STEMCELL Technologies | 9960 | It is prepared by adding 500 µL StemSpan NK Cell Differentiation Supplement (100x) into 49.5 mL of SFEM II. Both are provided in StemSpan NK Cell Generation Kit. |
StemSpan lymphoid expansion medium | STEMCELL Technologies | 9960 | It is prepared by adding 5 mL StemSpan Lymphoid Progenitor Expansion Supplement (10x) into 45 mL of StemSpan SFEM II. Both are provided in StemSpan NK Cell Generation Kit. |
StemSpan NK Cell Generation Kit | STEMCELL Technologies | 9960 | Thaw the medium and materials in room temperature and the medium is stored in 4 °C once thawed. |
The BD LSRFortessa cell analyzer | BD | ||
Trypsin-EDTA (0.05%), phenol red | Thermo Scientific | 25300054 | |
Y-27632 dihydrochloride | Tocris | 1254 | working concentration: 10 µM |