Detta protokoll visar hur man differentierar CD3−/CD45+CD56+-celler med mild cytotoxicitet från humana expanderade potentiella stamceller (hEPSC) under både 3D- och 2D-odlingsförhållanden. Detta möjliggör rutinmässig fenotypisk validering utan förstörelse av den komplexa mikromiljön.
Differentieringen av naturliga mördarceller (NK) från humana pluripotenta stamceller möjliggör forskning om och tillverkning av cellulära produkter av klinisk kvalitet för immunterapi. Här beskrivs ett tvåfasprotokoll som använder ett serumfritt kommersiellt medium och en cocktail av cytokiner (interleukin [IL]-3, IL-7, IL-15, stamcellsfaktor [SCF] och FMS-liknande tyrosinkinas 3-ligand [Ftl3L]) för att differentiera humana expanderade potentiella stamceller (hEPSC) till celler som har NK-cellegenskaper in vitro med både 3-dimensionell (3D) och 2-dimensionell (2D) odlingsteknik. Efter detta protokoll genereras CD3−CD56+ eller CD45+CD56+ NK-celler konsekvent. Vid samodling med tumörmål i 3 timmar uppvisar de differentierade produkterna mild cytotoxicitet jämfört med en IL-2-oberoende permanent cellinje, NK92mi-celler. Protokollet bevarar komplexiteten hos differentieringsmikromiljön genom generering av 3D-strukturer, vilket underlättar studien av de rumsliga relationerna mellan immunceller och deras nischer. Samtidigt möjliggör 2D-odlingssystemet rutinmässig fenotypisk validering av celldifferentiering utan att skada den känsliga differentieringsnischen.
Jämfört med konventionella pluripotenta stamceller som mänskliga embryonala stamceller (hESC) och humant inducerade pluripotenta stamceller (hiPSCs) ligger humana expanderade potentiella stamceller (hEPSC) närmare tillståndet för totipotens eftersom de kan differentieras till både extraembryonala och embryonala linjer1. Till exempel kan hEPSC differentieras i trofoblaster1 och äggula sac-liknande celler2. För att uppnå den unika styrkan hos hEPSC: er odlas en enskild blastomeren i ett medium som innehåller flera små molekyler som hämmar härstamningsåtagandesignalering1, vilket kallas EPSC-medium (EPSCM). Odling av hESC och hiPSC i EPSCM expanderar deras tidigare begränsade styrka för att differentiera dem till trofoblastceller1.
Pluripotenta stamceller är ett värdefullt forskningsverktyg för att experimentera med nya genetiska modifieringar. På grund av pluripotenta stamcellers självförnyelse- och differentieringsförmåga kan en transformerad klon av en pluripotent stamcell producera differentierade cellulära produkter som har samma genetiska modifiering på samma plats. Zhu och Kaufman etablerade standarden för NK-celldifferentiering från konventionella pluripotenta stamceller (hESC och hiPSCs)3. Först inducerade de hematopoetiska stamceller (HSC) från en embryoidkropp härrörande från pluripotenta stamceller. Tillsatsen av stamcellsfaktor (SCF), FMS-liknande tyrosinkinas 3-ligand (Ftl3L), interleukin (IL)-7, IL-15 och ett tidigt tillskott av IL-3 förspände HSC: erna att utvecklas till naturliga mördarceller (NK). Därefter expanderade de NK-cellerna med artificiella antigenpresenterande celler (aAPC), som presenterar membranbunden IL-21, med kontinuerlig tillskott av IL-2. Forskare har tillämpat detta tillvägagångssätt på immunterapi för att generera iPSC-härledda naturliga mördarceller utrustade med den chimära antigenreceptorn (CAR-iNK)4.
Humana NK-celler definieras som CD3-CD56 + leukocyter i perifert blod. De är effektorer mot virusinfekterade celler och tumörceller5. Vissa hämmande receptorer på NK-celler känner igen molekyler som uttrycks allestädes närvarande i normala celler. Som ett exempel känner NKG2A / CD94-heterodimeren uttryckt på NK-celler igen MHC klass I-molekyler5. Samtidigt känner de aktiverande receptorerna på NK-celler igen stressinducerade ligander, som hur NKG2D känner igen transformationsinducerad MHC klass I polypeptidrelaterad sekvens A (GLIMMER / MICB)6. Vissa transformerade celler nedreglerar sina “självligander” för att undkomma immunövervakning och uppreglera avvikande ligander, vilket utlöser NK-cellerna att utföra sitt lytiska maskineri. De inneboende antitumörförmågorna hos NK-celler har uppmärksammat denna immuncelltyp.
Förmågan att samtidigt ge upphov till både embryonala och extraembryonala linjer kan göra hEPSC till en mer trogen rekapitulation av den embryonala utvecklingsnischen än konventionella pluripotenta stamceller. Av erfarenhet är det lättare att bibehålla styrkan hos hEPSC än hiPSC. I den aktuella studien utvecklades ett protokoll (figur 1) för att bias hEPSC för att utvecklas till hematopoetiska linjer och senare differentiera stamceller till naturliga mördarceller (NK) in vitro. I protokollet används kommersiella medier för att undvika seruminkonsekvenser, följt av stegvis tillsats av cytokiner till biasdifferentiering i lymfoida linjer. Detta protokoll har två system för att bevara den komplexa 3D-mikromiljön samtidigt som CD3-CD56 + / CD45 + CD56 + -celler som fenotypiskt och funktionellt liknar mänskliga NK-celler.
Detta protokoll kan vara användbart för att studera interaktionen mellan immunceller med deras differentieringsnischer och kan ha potential att rena cellulära produkter för immunterapeutisk användning.
Det finns några viktiga steg för att säkerställa en framgångsrik differentiering av CD45 + CD56 + -celler från hEPSC. Fördifferentieringen (steg 1.2) är avgörande eftersom EPSC-mediet innehåller hämmare av härstamningsåtagande1. Efter fördifferentiering plattas de kupolformade kolonierna av hEPSC (figur 2B). Tillsatsen av Y27632, en rhokinashämmare (ROCKi), under bildandet av EB från hEPSC (steg 1.3) är oumbärlig för hEPSCs överlevnad efter dissociation. En annan viktig faktor är antalet EB planterade på varje transwell. Eftersom det är ett småskaligt system är två till tre EB per transwell den optimala densiteten för att förhindra överkonsumtion av mediet. Luft-vätskegränssnittet upprätthålls under hela NK-celldifferentieringen för 3D-systemet, vilket antas bibehålla stromacellernas polaritet och stödja expansionen av de AGM-härledda hematopoetiska förfäderna14,15.
Som tidigare nämnts är densiteten hos EB på transbrunnen en avgörande faktor för framgångsrik differentiering. Nyckeltecknet för detta är mediets färg 1 dag efter implantationen av EB på transbrunnen. Om färgen snabbt blir gul indikerar detta antingen förorening eller överbeläggning. För att lösa problemet bör en 1 ml pipett användas för att manuellt plocka upp extra EB och överföra dem till en annan transwell.
En stor begränsning av detta protokoll är renheten hos CD3−/CD45+ CD56+-celler i IVD-produkterna, vilket tros vara delvis ansvarigt för den sämre cytotoxiciteten jämfört med rena NK92mi-celler. Ett 3D-odlingssystem användes för att inducera hematopoetiska förfäder via generering av en EB som liknar de tre embryonala könslagren. Denna strategi efterliknar utvecklingen av blodceller i benmärgens mikromiljö, vilket eliminerar behovet av stromaceller för att stödja differentieringen3. Utan ett sorteringssteg för att rena de hematopoetiska progenitorerna förväntas renheten hos IVD-produkterna minska. En strategi för att behålla den komplexa differentieringsnischen och samtidigt öka renheten hos slutpunktsprodukten utvecklar en expansionsmetod för de sorterade CD3−CD56+ IVD-produkterna. Till exempel kan de sorterade CD3−CD56+ IVD-produkterna odlas på artificiella antigenpresenterande celler (aAPC), såsom bestrålade K562-celler konstruerade med membranbunden IL-21. Med tillförseln av IL-2 i kulturen kan denna metod uppnå en 1000-faldig ökning av NK-cellnummer3.
En annan begränsning är den begränsade tillgången till bona fide humana NK-celler som en positiv referens. NK92mi är den positiva referensen som används i samkulturanalysen, men den är inte tillräckligt exakt. NK92mi-celler är konstruerade från NK92-celler, en permanent cellinje som uttrycker aktiverade NK-cellfenotyper16, för att autonomt producera IL-2 för att uppfylla odlingskraven. NK92-celler visar överlägsen dödande aktivitet mot K562-celler in vitro än humana primära NK-celler17. En rättvisare jämförelse av tumördödande kapacitet hos IVD-produkter skulle kunna uppnås genom att jämföra cytotoxiciteten hos NK-celler i perifert blod parallellt, men tyvärr saknas tillgång till blodbanker.
Detta tvåsystemkulturprotokoll syftar till att generera CD3−/CD45+CD56+-celler från hEPSC. Bedömningen av ytmarkörer och cytotoxicitet med FACS kan rutinmässigt utföras på celler från 2D-system utan att störa differentieringsnischen. Trots skillnaderna i procentandelen CD3−CD56+-celler kan 3D- och 2D-systemen härleda CD3−CD56+-celler med liknande variationer i CD56-uttryck (figur 3), och 2D-systemet återspeglar förekomsten av lymfoida stamfäder från 3D-odlingstillståndet.
Betydelsen av att använda 3D-odlingssystemet är att det möjliggör användning av högupplösta profileringsanalyser, såsom rumslig transkriptomik eller avbildande masspektrometri, för att undersöka de rumsliga relationerna och cell-cellinteraktionerna inom den komplexa differentieringsnischen.
The authors have nothing to disclose.
Vi vill tacka Dr. Handi Cao, Sanxing GAO, David Xiang, Yiming Chao, Ritika Jogani, Owen Chan, Stephanie Cheung och Celine Chan för deras tekniska hjälp och användbara diskussioner. Detta arbete stöddes av Platform Technology Fund. Figur 1 har skapats med BioRender.com.
30 w/v% Albumin Solution, from Bovine Serum(BSA), Fatty Acid Free | Wako Chemicals | 017-22231 | For resuspending cytokines. |
ACCUMAX | STEMCELL Technologies | 07921 | |
Anti-human-CD159a-PE | BD | 375104 | During antibody staining, 0.5 µL of antibodies is added into the staining buffer (PBS + 5% FBS) |
Anti-human-CD3-APC antibodies | BD | 555355 | During antibody staining, 0.5 µL of antibodies is added into the staining buffer (PBS + 2% FBS) |
Anti-human-CD45-APC antibodies | BD | 555485 | During antibody staining, 0.5 µL of antibodies is added into the staining buffer (PBS + 3% FBS) |
Anti-human-CD56-PE antibodies | BD | 555516 | During antibody staining, 0.5 µL of antibodies is added into the staining buffer (PBS + 4% FBS) |
Anti-human-CD56-PEcy7 antibodies | BD | 335826 | During antibody staining, 0.5 µL of antibodies is added into the staining buffer (PBS + 5% FBS) |
Anti-human-CD94-APC | BD | 559876 | During antibody staining, 0.5 µL of antibodies is added into the staining buffer (PBS + 5% FBS) |
Bemis Parafilm M Laboratory Wrapping Film | Thermo Scientific | 11772644 | |
Cd244 Monoclonal Antibody (eBioC1.7 (C1.7)), Functional Grade, eBioscience | Thermo Scientific | 16-5838-85 | |
Costar 6.5 mm Transwell, 0.4 µm Pore Polyester Membrane Inserts | STEMCELL Technologies | 3470 | |
Dapi Solution, 1 mg/mL | BD | 564907 | It is resuspended with ddH2O so the concentration is 10 µM/mL. Add 1 µL of the aliquot in 300 µL of FACS buffer (PBS + 2% FBS) |
DMEM | CPOS-Bioreagent core | 11965092 | |
DMEM/F12 | Thermo Scientific | 11320033 | |
FcX, human | Biolengend | 422302 | |
Fetal Bovine Serum(FBS) qualified E.U.-approved South America | CPOS-Bioreagent core | 10270106 | |
FlowJo v10.8.0 | BD | ||
Gibco PBS (10x) pH 7.4 | CPOS-Bioreagent core | 70011044 | 10x concentrated PBS is manufactured as follows: without calcium, magnesium or phenol red |
K562 cells | ATCC | CCL-243 | |
Knockout Serum Replacement | Thermo Scientific | 10828-028 | |
MyeloCult H5100 medium | STEMCELL Technologies | 5150 | |
NK92mi cells | ATCC | CRL-2408 | Lot: 70045208. Once thawed, they are cultured in MyeloCult H5100 medium, and maintained the density between 2 x 105 to 1 x 106 cell/mL. |
Nunc Cell-Culture Treated Multidishes 12 well plate | Thermo Scientific | 150628 | flat bottom |
Nunc Cell-Culture Treated Multidishes 24 well plate | Thermo Scientific | 142475 | |
Nunc EasYDish Dishes | Thermo Scientific | 150460 | |
pLenti-GFP Lentiviral Control Vector | CELL BIOLABS | LTV-400 | It is packaged as the manufactuer suggested (https://www.cellbiolabs.com/sites/default/files/LTV-400-gfp- lentiviral-plasmid.pdf). 40 μL of 50x lentivirus is added with 1 μL 10 mg/mL polybrene per 1 mL of cell suspension. Complete medium change is performed 24 h after the addition of lentivirus. Cells are incubated undisputedly for 3 days at 37 °C, 5% CO2. |
Polybrene | EMD Millipore | TR-1003-G | |
Recombinant Human Flt-3 Ligand/FLT3L Protein | R&D Systems | 308-FK-005 | It is resuspend with PBS + 0.2% BSA. Thr working concentration is 10 ng/mL or 12 IU/mL. |
Recombinant Human IL-15 Protein | R&D Systems | 247-ILB-005 | It is resuspended with PBS + 0.2% BSA. The working concentration is 10 ng/mL or 4500 IU/mL. |
Recombinant Human IL-18/IL-1F4 Protein | R&D Systems | 9124-IL-010 | It is resuspended with PBS + 0.2% BSA. The working concentration is 50 ng/mL. The IU is not provided by the company. |
Recombinant Human IL-2 Protein | R&D Systems | 202-IL-010 | It is resuspended with PBS + 0.2% BSA. The working concentration is 50 ng/mL or 455 IU/mL. |
Recombinant Human IL-3 Protein, 50ug | PeproTech | 200-03 | It is resuspended with PBS + 0.2% BSA. The working concentration is 5 ng/mL or 14 IU/mL. |
Recombinant Human IL-7 Protein | R&D Systems | 207-IL-010 | It is resuspended with PBS + 0.2% BSA. The working concentration is 20 ng/mL or 8800 IU/mL. |
Recombinant Human SCF Protein | R&D Systems | 255-SC-010 | It is resuspended with PBS + 0.2% BSA. The working concentration is 20 ng/mL or 26 IU/mL. |
STEMdiff Hematopoietic Kit | STEMCELL Technologies | 5310 | Medium A: 45 mL STEMdiff Hematopoietic Basal Medium + STEMdiff Hematopoietic Supplement A ; Medium B: 75 STEMdiff Hematopoietic Basal Medium + STEMdiff Hematopoietic Supplement B |
StemSpan lymphoid differentiation coating material | STEMCELL Technologies | 9950 | It is resuspended in PBS (100x) |
StemSpan NK cell differentiation medium | STEMCELL Technologies | 9960 | It is prepared by adding 500 µL StemSpan NK Cell Differentiation Supplement (100x) into 49.5 mL of SFEM II. Both are provided in StemSpan NK Cell Generation Kit. |
StemSpan lymphoid expansion medium | STEMCELL Technologies | 9960 | It is prepared by adding 5 mL StemSpan Lymphoid Progenitor Expansion Supplement (10x) into 45 mL of StemSpan SFEM II. Both are provided in StemSpan NK Cell Generation Kit. |
StemSpan NK Cell Generation Kit | STEMCELL Technologies | 9960 | Thaw the medium and materials in room temperature and the medium is stored in 4 °C once thawed. |
The BD LSRFortessa cell analyzer | BD | ||
Trypsin-EDTA (0.05%), phenol red | Thermo Scientific | 25300054 | |
Y-27632 dihydrochloride | Tocris | 1254 | working concentration: 10 µM |