Denne protokol viser, hvordan man kan differentiere CD3−/CD45+CD56+ celler med mild cytotoksicitet fra humane ekspanderede potentielle stamceller (hEPSC’er) under både 3D- og 2D-dyrkningsbetingelser. Dette giver mulighed for rutinemæssig fænotypisk validering uden ødelæggelse af det komplekse mikromiljø.
Differentieringen af naturlige dræberceller (NK) fra humane pluripotente stamceller giver mulighed for forskning i og fremstilling af cellulære produkter af klinisk kvalitet til immunterapi. Beskrevet her er en tofaset protokol, der bruger et serumfrit kommercielt medium og en cocktail af cytokiner (interleukin [IL]-3, IL-7, IL-15, stamcellefaktor [SCF] og FMS-lignende tyrosinkinase 3-ligand [Ftl3L]) til at differentiere humane ekspanderede potentielle stamceller (hEPSC’er) i celler, der besidder NK-celleegenskaber in vitro med både 3-dimensionel (3D) og 2-dimensionel (2D) kulturteknologi. Efter denne protokol genereres CD3-CD56+ eller CD45+CD56+ NK-celler konsekvent. Når de dyrkes sammen med tumormål i 3 timer, viser de differentierede produkter mild cytotoksicitet sammenlignet med en IL-2-uafhængig permanent cellelinje, NK92mi-celler. Protokollen bevarer kompleksiteten af differentieringsmikromiljøet ved generering af 3D-strukturer, hvilket letter undersøgelsen af de rumlige forhold mellem immunceller og deres nicher. I mellemtiden muliggør 2D-kultursystemet rutinemæssig fænotypisk validering af celledifferentiering uden at skade den sarte differentieringsniche.
Sammenlignet med konventionelle pluripotente stamceller som humane embryonale stamceller (hESC’er) og humane inducerede pluripotente stamceller (hiPSC’er) er humane ekspanderede potentielle stamceller (hEPSC’er) tættere på totipotenstilstanden, da de kan differentiere sig til både ekstraembryonale og embryonale linjer1. For eksempel kan hEPSC’er differentieres i trofoblaster1 og æggeblomme-sæklignende celler2. For at opnå den unikke styrke af hEPSC’er dyrkes en individuel blastomer i et medium, der indeholder flere små molekyler, der hæmmer afstamningsforpligtelsessignalering1, som kaldes EPSC-medium (EPSCM). Dyrkning af hESC’er og hiPSC’er i EPSCM udvider deres tidligere begrænsede styrke for at differentiere dem til trofoblastceller1.
Pluripotente stamceller er et værdifuldt forskningsværktøj til at eksperimentere med nye genetiske modifikationer. På grund af pluripotente stamcellers selvfornyelses- og differentieringskapacitet kan en transformeret klon af en pluripotent stamcelle producere differentierede cellulære produkter, der besidder den samme genetiske modifikation på samme sted. Zhu og Kaufman etablerede standarden for NK-celledifferentiering fra konventionelle pluripotente stamceller (hESC’er og hiPSC’er)3. For det første inducerede de hæmatopoietiske stamceller (HSC’er) fra en embryoid krop afledt af pluripotente stamceller. Tilsætningen af stamcellefaktor (SCF), FMS-lignende tyrosinkinase 3-ligand (Ftl3L), interleukin (IL)-7, IL-15 og et tidligt supplement af IL-3 forspændte HSC’erne til at udvikle sig til naturlige dræberceller (NK). Derefter udvidede de NK-cellerne med kunstige antigenpræsenterende celler (aAPC’er), som præsenterer membranbundet IL-21, med det kontinuerlige tilskud af IL-2. Forskere har anvendt denne tilgang til immunterapi for at generere iPSC-afledte naturlige dræberceller udstyret med den kimære antigenreceptor (CAR-iNK)4.
Humane NK-celler defineres som CD3-CD56+ leukocytter i det perifere blod. De er effektorer mod virusinficerede celler og tumorceller5. Nogle hæmmende receptorer på NK-celler genkender molekyler, der udtrykkes allestedsnærværende i normale celler. Som et eksempel genkender NKG2A / CD94 heterodimer udtrykt på NK-celler MHC klasseI molekyler 5. I mellemtiden genkender de aktiverende receptorer på NK-celler stressinducerede ligander, som hvordan NKG2D genkender transformationsinduceret MHC klasse I polypeptidrelateret sekvens A (MICA/MICB)6. Nogle transformerede celler nedregulerer deres “selvligander” for at undslippe immunovervågning og opregulere afvigende ligander, hvilket udløser NK-cellerne til at udføre deres lytiske maskineri. NK-cellernes iboende antitumorevner har bragt opmærksomheden på denne immuncelletype.
Evnen til samtidig at give anledning til både embryonale og ekstraembryonale linjer kan gøre hEPSC’er til en mere trofast rekapitulation af den embryonale udviklingsniche end konventionelle pluripotente stamceller. Fra erfaring er det lettere at opretholde styrken af hEPSC’er end hiPSC’er. I denne undersøgelse blev der udviklet en protokol (figur 1) til bias hEPSC’er for at udvikle sig til hæmatopoietiske slægter og senere differentiere stamceller til naturlige dræberceller (NK) in vitro. I protokollen anvendes kommercielle medier for at undgå serumuoverensstemmelser, efterfulgt af trinvis tilsætning af cytokiner til biasdifferentiering i lymfoide slægter. Denne protokol har to systemer til at bevare det komplekse 3D-mikromiljø, mens den udleder CD3-CD56+/CD45+CD56+-celler, der fænotypisk og funktionelt ligner humane NK-celler.
Denne protokol kan være nyttig til at studere interaktionen mellem immunceller med deres differentieringsnicher og kan have potentiale til at rense cellulære produkter til immunterapeutiske anvendelser.
Der er et par afgørende trin for at sikre en vellykket differentiering af CD45+CD56+ celler fra hEPSC’er. Fordifferentieringen (trin 1.2) er afgørende, da EPSC-mediet indeholder inhibitorer af afstamningsforpligtelse1. Efter prædifferentiering flades de kuppelformede kolonier af hEPSC’er (figur 2B). Tilsætningen af Y27632, en rhokinasehæmmer (ROCKi), under dannelsen af EB’er fra hEPSC’er (trin 1.3) er uundværlig for hEPSC’ernes overlevelse efter dissociation. En anden vigtig overvejelse er antallet af EB’er, der er plantet på hver transwell. Da det er et lille system, er to til tre EB’er pr. transwell den optimale tæthed for at forhindre overforbrug af medierne. Luft-væske-grænsefladen opretholdes under hele forløbet af NK-celledifferentiering for 3D-systemet, hvilket menes at opretholde stromale cellers polaritet og understøtte udvidelsen af de AGM-afledte hæmatopoietiske forfædre14,15.
Som tidligere nævnt er tætheden af EB’er på transwell en afgørende faktor for vellykket differentiering. Nøgletegnet for dette er mediets farve 1 dag efter implantation af EB’er på transwellen. Hvis farven hurtigt bliver gul, indikerer dette enten forurening eller overbelægning. For at løse problemet skal en 1 ml pipette bruges til manuelt at opsamle ekstra EB’er og overføre dem til en anden transwell.
En væsentlig begrænsning af denne protokol er renheden af CD3−/CD45+ CD56+ celler i IVD-produkterne, som menes at være delvist ansvarlig for den ringere cytotoksicitet sammenlignet med rene NK92mi-celler. Et 3D-kultursystem blev anvendt til at inducere hæmatopoietiske forfædre via genereringen af en EB, der ligner de tre embryonale kimlag. Denne strategi efterligner udviklingen af blodlegemer i knoglemarvsmikromiljøet og fjerner dermed behovet for stromale celler til at understøtte differentieringen3. Uden et sorteringstrin til rensning af de hæmatopoietiske forfædre forventes IVD-produkternes renhed at blive reduceret. En strategi for at bevare den komplekse differentieringsniche og samtidig øge renheden af slutpunktsproduktet er at udvikle en ekspansionsmetode til de sorterede CD3-CD56+ IVD-produkter. For eksempel kan de sorterede CD3-CD56+ IVD-produkter dyrkes på kunstige antigenpræsenterende celler (aAPC’er), såsom bestrålede K562-celler konstrueret med membranbundet IL-21. Med forsyningen af IL-2 i kulturen kan denne metode opnå en 1.000 gange stigning i NK-cellenumre3.
En anden begrænsning er den begrænsede adgang til bona fide humane NK-celler som en positiv reference. NK92mi er den positive reference, der anvendes i coculture-assayet, men den er ikke præcis nok. NK92mi-celler er konstrueret fra NK92-celler, en permanent cellelinje, der udtrykker aktiverede NK-cellefænotyper16, til autonomt at producere IL-2 for at opfylde dyrkningskravene. NK92-celler viser overlegen drabsaktivitet mod K562-celler in vitro end humane primære NK-celler17. En mere retfærdig sammenligning af IVD-produkters tumordræbende kapacitet kunne opnås ved parallelt at analysere cytotoksiciteten af perifere NK-celler i blodet, men desværre mangler der adgang til blodbanker.
Denne kulturprotokol med to systemer sigter mod at generere CD3−/CD45+CD56+ celler fra hEPSC’er. Vurderingen af overflademarkørerne og cytotoksiciteten med FACS kan rutinemæssigt udføres på celler fra 2D-systemer uden at forstyrre differentieringsnichen. På trods af forskellene i procentdelene af CD3-CD56+ celler kan 3D- og 2D-systemerne udlede CD3-CD56+ celler med lignende variationer i CD56-ekspression (figur 3), og 2D-systemet afspejler eksistensen af lymfoide forfædre fra 3D-kulturtilstanden.
Betydningen af at bruge 3D-kultursystemet er, at det tillader brugen af profileringsanalyser i høj opløsning, såsom rumlig transkriptomik eller billeddannelse af massespektrometri, til at undersøge de rumlige relationer og celle-celle-interaktioner inden for den komplekse differentieringsniche.
The authors have nothing to disclose.
Vi vil gerne takke Dr. Handi Cao, Sanxing GAO, David Xiang, Yiming Chao, Ritika Jogani, Owen Chan, Stephanie Cheung og Celine Chan for deres tekniske assistance og nyttige diskussioner. Dette arbejde blev støttet af Platform Technology Fund. Figur 1 er oprettet med BioRender.com.
30 w/v% Albumin Solution, from Bovine Serum(BSA), Fatty Acid Free | Wako Chemicals | 017-22231 | For resuspending cytokines. |
ACCUMAX | STEMCELL Technologies | 07921 | |
Anti-human-CD159a-PE | BD | 375104 | During antibody staining, 0.5 µL of antibodies is added into the staining buffer (PBS + 5% FBS) |
Anti-human-CD3-APC antibodies | BD | 555355 | During antibody staining, 0.5 µL of antibodies is added into the staining buffer (PBS + 2% FBS) |
Anti-human-CD45-APC antibodies | BD | 555485 | During antibody staining, 0.5 µL of antibodies is added into the staining buffer (PBS + 3% FBS) |
Anti-human-CD56-PE antibodies | BD | 555516 | During antibody staining, 0.5 µL of antibodies is added into the staining buffer (PBS + 4% FBS) |
Anti-human-CD56-PEcy7 antibodies | BD | 335826 | During antibody staining, 0.5 µL of antibodies is added into the staining buffer (PBS + 5% FBS) |
Anti-human-CD94-APC | BD | 559876 | During antibody staining, 0.5 µL of antibodies is added into the staining buffer (PBS + 5% FBS) |
Bemis Parafilm M Laboratory Wrapping Film | Thermo Scientific | 11772644 | |
Cd244 Monoclonal Antibody (eBioC1.7 (C1.7)), Functional Grade, eBioscience | Thermo Scientific | 16-5838-85 | |
Costar 6.5 mm Transwell, 0.4 µm Pore Polyester Membrane Inserts | STEMCELL Technologies | 3470 | |
Dapi Solution, 1 mg/mL | BD | 564907 | It is resuspended with ddH2O so the concentration is 10 µM/mL. Add 1 µL of the aliquot in 300 µL of FACS buffer (PBS + 2% FBS) |
DMEM | CPOS-Bioreagent core | 11965092 | |
DMEM/F12 | Thermo Scientific | 11320033 | |
FcX, human | Biolengend | 422302 | |
Fetal Bovine Serum(FBS) qualified E.U.-approved South America | CPOS-Bioreagent core | 10270106 | |
FlowJo v10.8.0 | BD | ||
Gibco PBS (10x) pH 7.4 | CPOS-Bioreagent core | 70011044 | 10x concentrated PBS is manufactured as follows: without calcium, magnesium or phenol red |
K562 cells | ATCC | CCL-243 | |
Knockout Serum Replacement | Thermo Scientific | 10828-028 | |
MyeloCult H5100 medium | STEMCELL Technologies | 5150 | |
NK92mi cells | ATCC | CRL-2408 | Lot: 70045208. Once thawed, they are cultured in MyeloCult H5100 medium, and maintained the density between 2 x 105 to 1 x 106 cell/mL. |
Nunc Cell-Culture Treated Multidishes 12 well plate | Thermo Scientific | 150628 | flat bottom |
Nunc Cell-Culture Treated Multidishes 24 well plate | Thermo Scientific | 142475 | |
Nunc EasYDish Dishes | Thermo Scientific | 150460 | |
pLenti-GFP Lentiviral Control Vector | CELL BIOLABS | LTV-400 | It is packaged as the manufactuer suggested (https://www.cellbiolabs.com/sites/default/files/LTV-400-gfp- lentiviral-plasmid.pdf). 40 μL of 50x lentivirus is added with 1 μL 10 mg/mL polybrene per 1 mL of cell suspension. Complete medium change is performed 24 h after the addition of lentivirus. Cells are incubated undisputedly for 3 days at 37 °C, 5% CO2. |
Polybrene | EMD Millipore | TR-1003-G | |
Recombinant Human Flt-3 Ligand/FLT3L Protein | R&D Systems | 308-FK-005 | It is resuspend with PBS + 0.2% BSA. Thr working concentration is 10 ng/mL or 12 IU/mL. |
Recombinant Human IL-15 Protein | R&D Systems | 247-ILB-005 | It is resuspended with PBS + 0.2% BSA. The working concentration is 10 ng/mL or 4500 IU/mL. |
Recombinant Human IL-18/IL-1F4 Protein | R&D Systems | 9124-IL-010 | It is resuspended with PBS + 0.2% BSA. The working concentration is 50 ng/mL. The IU is not provided by the company. |
Recombinant Human IL-2 Protein | R&D Systems | 202-IL-010 | It is resuspended with PBS + 0.2% BSA. The working concentration is 50 ng/mL or 455 IU/mL. |
Recombinant Human IL-3 Protein, 50ug | PeproTech | 200-03 | It is resuspended with PBS + 0.2% BSA. The working concentration is 5 ng/mL or 14 IU/mL. |
Recombinant Human IL-7 Protein | R&D Systems | 207-IL-010 | It is resuspended with PBS + 0.2% BSA. The working concentration is 20 ng/mL or 8800 IU/mL. |
Recombinant Human SCF Protein | R&D Systems | 255-SC-010 | It is resuspended with PBS + 0.2% BSA. The working concentration is 20 ng/mL or 26 IU/mL. |
STEMdiff Hematopoietic Kit | STEMCELL Technologies | 5310 | Medium A: 45 mL STEMdiff Hematopoietic Basal Medium + STEMdiff Hematopoietic Supplement A ; Medium B: 75 STEMdiff Hematopoietic Basal Medium + STEMdiff Hematopoietic Supplement B |
StemSpan lymphoid differentiation coating material | STEMCELL Technologies | 9950 | It is resuspended in PBS (100x) |
StemSpan NK cell differentiation medium | STEMCELL Technologies | 9960 | It is prepared by adding 500 µL StemSpan NK Cell Differentiation Supplement (100x) into 49.5 mL of SFEM II. Both are provided in StemSpan NK Cell Generation Kit. |
StemSpan lymphoid expansion medium | STEMCELL Technologies | 9960 | It is prepared by adding 5 mL StemSpan Lymphoid Progenitor Expansion Supplement (10x) into 45 mL of StemSpan SFEM II. Both are provided in StemSpan NK Cell Generation Kit. |
StemSpan NK Cell Generation Kit | STEMCELL Technologies | 9960 | Thaw the medium and materials in room temperature and the medium is stored in 4 °C once thawed. |
The BD LSRFortessa cell analyzer | BD | ||
Trypsin-EDTA (0.05%), phenol red | Thermo Scientific | 25300054 | |
Y-27632 dihydrochloride | Tocris | 1254 | working concentration: 10 µM |