Summary
Det nuvarande protokollet beskriver högfrekvent ultraljud för att visualisera hela mussköldkörteln och övervaka tillväxten av anaplastiskt sköldkörtelcancer.
Abstract
Anaplastiskt sköldkörtelcancer (ATC) är förknippat med en dålig prognos och kort medianöverlevnadstid, men ingen effektiv behandling förbättrar resultaten signifikant. Genmanipulerade murina modeller som efterliknar ATC: s progression kan hjälpa forskare att studera behandlingar för denna sjukdom. Korsning av tre olika genotyper av möss, en TPO-cre / ERT2; BrafCA/WT; Trp53 Δex2-10/Δex2-10 transgen ATC-modell utvecklades. ATC-murina modellen inducerades av en intraperitoneal injektion av tamoxifen med överuttryck av BrafV600E och deletion av Trp53, och tumörerna genererades inom cirka 1 månad. Högupplöst ultraljud applicerades för att undersöka tumörens initiering och progression, och den dynamiska tillväxtkurvan erhölls genom att mäta tumörstorlekarna. Jämfört med magnetisk resonanstomografi (MRT) och datortomografiskanning har ultraljud fördelar med att observera ATC-murinmodellen, såsom att vara icke-invasiv, bärbar, i realtid och utan strålningsexponering. Högupplöst ultraljud är lämplig för dynamiska och multipla mätningar. Ultrasonografisk undersökning av sköldkörteln hos möss kräver dock relevant anatomisk kunskap och erfarenhet. Denna artikel ger en detaljerad procedur för att använda högupplöst ultraljud för att skanna tumörer i den transgena ATC-modellen. Under tiden listas ultraljudsparameterjustering, ultraljudsskanningsförmåga, anestesi och återhämtning av djuren och andra element som behöver uppmärksamhet under processen.
Introduction
Även om anaplastiskt sköldkörtelcancer (ATC) står för färre än 2% av sköldkörtelcancer, orsakar det mer än 50% av sköldkörtelcancerrelaterade dödsfall årligen. Medianöverlevnadstiden efter diagnos med ATC är endast cirka 6 månader, och inga behandlingar finns tillgängliga som signifikant förbättrar överlevnaden 1,2.
Sällsyntheten hos ATC har hindrat forskningen som studerar hur sjukdomen börjar och aggressivt fortskrider. Genetiskt modifierade musmodeller som efterliknar sjukdomen har nyligen blivit tillgängliga, vilket ger insikter om sjukdomen och dess svar på möjliga behandlingar 3,4,5. Sådana studier kräver noggrann tumöravbildning för mätningar och övervakning, vilket vanligtvis utförs med magnetisk resonanstomografi, datortomografi eller högupplöst ultraljud 6,7. Ultraljud har använts i stor utsträckning i musorgan. Det har fördelar jämfört med magnetisk resonanstomografi och datortomografi eftersom det kan utföras i realtid och inte utsätter ämnet för strålning, och den nödvändiga utrustningen är tillräckligt liten för att vara bärbar 8,9. Studier om kontinuerlig övervakning av ATC-tillväxt med ultraljud är dock sällsynta; Därför undersöker detta arbete användbarheten av ultraljud i detta sammanhang.
Här presenteras ett protokoll för att använda högupplöst ultraljud för att noggrant skanna, övervaka och mäta tumörer i en musmodell av ATC.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Protocol
Den aktuella studien utfördes med godkännande från Animal Care and Use Committee vid Sichuan University. TPO-cre/ERT2; BrafCA/WT; Trp53 Δex2-10/Δex2-10 transgena möss10 användes i denna studie (se materialtabell). Protokollstegen kan ändras för olika djurarter vid behov. Tolv möss, inklusive sex honor och sex hanar, med en medelålder på 93 dagar, användes här.
1. Experimentell förberedelse
- Slå på ultraljudssystemet (se Materialförteckning) och skapa en ny mapp för att fånga bilderna och samla in data. Välj 40 MHz-linjesonden och klicka på ytligt vävnadsmönster för att aktivera den ytliga vävnadsgivaren. Använd "B-läge" för sköldkörtelavbildning (figur 1A).
OBS: B-läge är det grundläggande ultraljudsavbildningsläget. Utseendet på ultraljudsbilder är beroende av ljudets fysiska interaktioner med vävnaderna i kroppen. B-lägesbilder produceras som grå bilder11,12. - Håll mössen i specifika burar med fri tillgång till mat och vatten. Placera buret på en extra värmeanordning (se materialförteckning) för att säkerställa termoregulering.
- Se till att det finns tillräckligt med isofluran i förångaren ochO2 i tanken. Om leveranserna är otillräckliga, byt ut tankarna mot nya.
- Rengör djuravbildningsplattformen med steril saltlösning och slå på värmeknappen. Kontrollera att temperaturen är 38–40 °C innan du placerar djuret på plattformen (figur 1C).
2. Djurberedning för bildbehandling
- Slå på isofluranförångaren. Överför musen från buret till bedövningsboxen.
- Bedöva djuret med en blandning av 1% -2% isofluran från förångaren och syreflöde vid 0,8 l / min.
- Applicera hårborttagningskräm från bröstet till halsen, vänta 30 sekunder och torka sedan bort krämen och pälsen helt. Skölj noggrant området och omgivande päls med varm steril saltlösning.
- Placera det bedövade djuret på den uppvärmda plattformen. Täck nosen med en noskon ansluten till anestesiutloppet (figur 2A, B).
Musen måste vara helt sederad inom 1-2 minuter. Om djuret fortfarande är aktivt, utför långvarig isofluraninduktion tills djuret inte längre uppvisar en pedalabstinensreflex. Se till att djuret andas stabilt. - Under avbildning, övervaka musens hjärtfrekvens genom den uppvärmda plattformen.
OBS: Ultraljud bildsystemet är utrustat med en pulsmätare. - Använd tejp för att fixera musens lemmar på den uppvärmda plattformen, med djuret i ryggläge. Se till att noskonen är stabilt placerad med ett konstant narkosgasflöde (1,5 l/min).
- Skydda ögonen genom att applicera oftalmisk salva.
3. Tumöravbildning
- Justera bildsystemet för att optimera upplösningen. Ställ in följande parametrar: tvådimensionell förstärkning, 25-30 dB; bilddjup, 10 mm; antal fokuszoner, 3; och centrum, 3-6 mm.
OBS: För den aktuella studien användes en 40 MHz-sond. B-läget specificerades för datainsamling. - Applicera ultraljudsgel (se materialförteckning) på området med bar hud.
- Håll sonden och placera den i kontakt med ultraljudsgelen på bröstet och skanna sedan från bröstet mot nacken för att lokalisera sköldkörteln (figur 2C).
OBS: Tryck försiktigt under skanning; Överdriven tryck på djurets nacke kan orsaka gasning eller apné. Detta protokoll utvecklades baserat på handhållen skanning, men mekaniserad skanning kan också utföras med hjälp av en maskin för att styra sonden, till exempel en djurbildplattform som rör sig längs x- och y-axlarna. - Skanna upp och ner för att identifiera tumörens gränser och bedöma dess storlek och form.
OBS: En frisk sköldkörtel uppträder vanligtvis som en hypoekogen, homogen struktur framför luftstrupen. Anaplastiska tumörer gör att sköldkörteln verkar mycket större, vilket lätt kan identifieras genom nackskanning (figur 3). - Identifiera ATC-tumörerna från luftstrupen och remmusklerna beroende på anatomisk plats och ultraljudseko.
OBS: Remmusklerna ligger framför sköldkörteln och luftstrupen, liksom bakom sköldkörteln. Ultraljudsekot i remmusklerna verkar högre än hos ATC, medan dämpning finns bakom luftstrupen13.- Baserat på intrycket av den totala tumören, bekräfta bildsektionen med den största tumördiametern från vänster till höger. Tryck på frysknappen och mät anteroposterior och vänster till höger tumördiametrar med ultraljudsmätaren.
OBS: Den anteroposteriora diametern måste mätas vinkelrätt mot tumördiametern från vänster till höger (figur 4). Tumörstorleken hos ATC beräknades genom att multiplicera anteroposteriordiametern med vänster till höger tumördiameter14. Eftersom storleken på tumörerna på vänster och höger sida var inkonsekvent, beräknades varje sida av tumörerna separat. Den totala storleken på tumörerna erhölls genom tillsats av de bilaterala tumörerna. Storlekarna registrerades för att observera ATC: s tillväxtkurva.
- Baserat på intrycket av den totala tumören, bekräfta bildsektionen med den största tumördiametern från vänster till höger. Tryck på frysknappen och mät anteroposterior och vänster till höger tumördiametrar med ultraljudsmätaren.
- Spara inspelningen som en cineslinga, vilket underlättar granskningen av de valda bilderna.
4. Återhämtning av djur
- Efter skanning, torka ultraljudsgelen och ta bort fasthållningstejpen från djurets lemmar.
- Placera musen på den extra uppvärmningsanordningen (steg 1.2). Lägg djuret på sin sida (figur 2D).
- När musen har återhämtat sig (~ 5 min), överför den tillbaka till buren.
- Rengör ultraljudssystemet, sonden och plattformen med en mjuk trasa och isopropylalkohol eller glutaraldehyddukar.
- Stäng av bildsystemet.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Representative Results
Den genomsnittliga högra ATC-storleken i början av studien var 4.867 mm 2 och den genomsnittliga vänstra ATC-storleken var 5.189 mm2. Vid den fjärde mätningen hade den genomsnittliga högra ATC-storleken vuxit till 11.844 mm 2, medan tumörstorleken på vänster lob hade vuxit till 9.280 mm2. Den totala ATC-storleken ökade från 10.057 mm 2 till 15.843 mm2. I det senare skedet av studien växte ATC snabbt. När det gäller musen märkt "P92" (tabell 1) hade tumörstorleken vid den fjärde mätningen vuxit till nästan fyra gånger större än storleken på den ursprungliga mätningen. De representativa mätningarna av fyra möss och tillväxtkurvorna visas i figur 5.
Högfrekvent ultraljud är den avbildningsmetod som oftast används för att undersöka sköldkörteln hos människor, och tekniken verkar också väl lämpad för möss. Det kan visualisera hela mussköldkörteln och detaljer om sköldkörteln lesion tillväxt. Detta protokoll för att tillämpa metoden för högfrekvent ultraljud kan användas för att noggrant skanna, övervaka och mäta tumörer i en genetiskt konstruerad musmodell av ATC.
Figur 1: Utrustning som används i denna studie . (A) Högfrekvent ultraljudssystem. (B) Laboratorieutrustning: (1) Elektrisk värmefilt. (2) Pappershanddukar. (3) Ultraljud gel. (4) Isofluranförångare. (5) Hårborttagningskräm. (6) Bomullspinne. (7) Sax. (8) Självhäftande tejp. (9) Medicinska handskar. (10) Kammare för anestesiinduktion. (11) Anestesisystem. (C) Ett mekaniserat skanningssystem för ultraljudsavbildning. Den helt sederade musen placerades på den uppvärmda plattformen (visas i grönt) och skanningssonden fästes på en rörlig precisionsarm. Klicka här för att se en större version av denna figur.
Figur 2: Musberedning och ultraljudsskanning . (A) Anestesiinduktion. (B) Fixering av djuret på den uppvärmda plattformen och anestesiunderhåll. (C) Ultraljudsskanning med en frihandsmetod. d) Bärgning av djuret på det elektriska värmefilten. Klicka här för att se en större version av denna figur.
Figur 3: Ultraljudsbilder av en ortotopisk ATC-tumörmusmodell. Den gröna linjen avgränsar luftstrupen, den röda linjen avgränsar ATC-tumören och den gula linjen avgränsar remmuskeln. Klicka här för att se en större version av denna figur.
Figur 4: Beräkning av tumörstorleken. Tumörstorleken beräknades genom att multiplicera den anteroposteriora diametern (orange linje) med tumördiametern från vänster till höger (vit linje). Klicka här för att se en större version av denna figur.
Figur 5: Longitudinell analys av ortotopisk ATC-tillväxt i musmodellen . (A) Höger sköldkörtellob. (B) Vänster sköldkörtellob. (C) Hela sköldkörteln. Varje kurva motsvarar ett djur som mäts fyra gånger. Klicka här för att se en större version av denna figur.
| Datum | 2021.08.24 | 2021.09.16 | 2021.10.19 | 2021.11.19 | |
| Etikett | Plats | Tumör Storlek (mm2) | |||
| P71 | Höger | 6.39 | 6.688 | 6.327 | 8.461 |
| Vänster | 6.461 | 6.419 | 6.984 | 8.6 | |
| total | 12.851 | 13.107 | 13.311 | 17.062 | |
| P85 | Höger | 5.962 | 7.318 | 7.057 | 7.352 |
| Vänster | 6.809 | 7.165 | 8.514 | 30.836 | |
| total | 12.711 | 14.483 | 15.571 | 38.188 | |
| P89 | Höger | 4.423 | 5.423 | 5.988 | 8.911 |
| Vänster | 4.872 | 5.949 | 7.183 | 7.016 | |
| total | 9.296 | 11.372 | 13.172 | 15.928 | |
| P92 | Höger | 3.593 | 3.509 | 3.769 | 6.734 |
| Vänster | 2.724 | 4.033 | 5.39 | 19.97 | |
| total | 6.317 | 7.542 | 9.159 | 26.704 | |
Tabell 1: Data om mätning av tumörstorlek. "P71", "P85", "P89" och "P92" representerar mössens etiketter. Höger: tumörstorleken på höger sida. Vänster: tumörstorleken på vänster sida. Totalt: den totala tumörstorleken genom att lägga till de bilaterala tumörerna. Den första raden inkluderar tumörstorleken (mm2: kvadratmillimeter) och datumet för mätningarna.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Discussion
Detta protokoll använder högupplöst ultraljud för att analysera ortotopiska ATC-tumörer i en genetiskt konstruerad musmodell. Den transgena modellen, med en genotyp av TPO-cre/ERT2; BrafCA/WT; Trp53 Δex2-10/Δex2-10, utvecklades i vårt laboratorium. Djuren överuttrycker BrafV600E och saknar Trp53; Injektion av djuren intraperitonealt med tamoxifen leder till tumörtillväxt efter cirka 1 månad10. Tumörerna växer snabbt och når en mätbar storlek inom 50 dagar. Detta protokoll användes för att övervaka tumörtillväxt i 4 månader.
Ultraljud har visat sig vara tillförlitligt hos möss för avbildning av vävnader som upptar liknande kroppsplatser som mänskliga vävnader, inklusive levern, sköldkörteln och fostret9. Liksom hos människor ligger mussköldkörteln på vardera sidan av sköldkörtelbrosket och luftstrupen13. Det presenterade protokollet möjliggör analys av ATC-tumörer i sköldkörteln, vilket möjliggör studier av tumörinitiering, progression och svar på behandlingar. Sköldkörteltumörerna i musmodellen växte ganska stora och upptog utrymmet runt luftstrupen och remmusklerna. De visade solid-cystiska egenskaper i ultraljud, liknande follikulära strukturer. Ultraljudets icke-invasivitet, korta varaktighet och bekvämlighet kan göra det mer attraktivt för många forskargrupper än magnetisk resonanstomografi eller datortomografi8. Eftersom långa sederings- eller anestesiperioder är onödiga kan ultraljudets fördelar underlätta longitudinella studier.
Att applicera tillräcklig ultraljudsgel under skanning är avgörande för att eliminera luftfickor som kan påverka bilden och för att undvika överdriven kompression som kan leda till apné. Detta protokoll utförs rutinmässigt i vårt laboratorium av erfarna ultraljudsspecialister som utför frihandsskanning. Frihandsskanning föredras framför en mekaniserad plattform eftersom det möjliggör flexibilitet vid justering av ultraljudssondens position enligt djurets tillstånd. Vid användning av en mekaniserad plattform måste x- och y-koordinaterna justeras för att förhindra överdriven kompression på djuret. Resultaten visade att tumörerna växte långsamt under den tidiga perioden, men från dag 60 utvecklades tumörerna dramatiskt snabbare och den maximala tumörstorleken var 38,188 mm2. Den främsta dödsorsaken var kvävning i det sena skedet. I kliniska prövningar, på grund av sällsyntheten hos ATC-tumörer, är det svårt att samla tillräckligt med prover för att observera utvecklingsprocessen och utvecklingsmekanismen. Metoden för ATC-lesioner kunde observeras bättre i murinmodellen. I framtiden kan dessa prover ge mer information för kliniska behandlingar.
En begränsning med ultraljudsavbildning är att ekogeniciteten hos ATC-tumörer kan likna den hos de omgivande vävnaderna, vilket döljer tumörmarginaler, särskilt i en stillbild. Dessa marginaler kan dock identifieras med hjälp av dynamisk kontrast, så dynamiska bilder sparades i denna studie för efterföljande analys. För att säkerställa de mest exakta och tillförlitliga resultaten måste sonden placeras på olika sätt för att visualisera hela sköldkörteln och tumören från olika vinklar. I denna studie utförde endast en ultraljudsfotograf alla mätningar, så tillförlitlighetsmätningar mellan olika examinatorer utvärderades inte.
Detta protokoll kan underlätta användningen av högupplöst ultraljud för lokalisering och mätning av ATC-tumörer hos djur, vilket banar väg för detaljerade studier av cancerdebut, progression och behandling.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Disclosures
Författarna har inga intressekonflikter att deklarera.
Acknowledgments
Denna forskning fick inget specifikt bidrag från offentliga, kommersiella eller ideella finansieringsorgan.
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| Adhesive tape | Winner | ||
| Anesthesia system | RWDlifescience | ||
| Brafflox/wt mice | Collaboration with Institute of Life Science, eBond Pharmaceutical Technology Ltd, Chengdu, China | ||
| Chamber for anesthesia induction | RWDlifescience | ||
| Cotton swabs | Winner | ||
| Depilatory cream | Veet | ||
| Electric heating blanket | Petbee | ||
| Isoflurane vaporizer | RWDlifescience | ||
| Medical gloves | Winner | ||
| Paper towels | Breeze | B914JY | |
| TPO-cre/ERT2 mice | Collaboration with Institute of Life Science, eBond Pharmaceutical Technology Ltd, Chengdu, China | ||
| Trp53flox/wt mice | Collaboration with Institute of Life Science, eBond Pharmaceutical Technology Ltd, Chengdu, China | ||
| Ultrasound gel | Keppler | KL-250 | |
| Ultrasound machine | VisualSonics | Vevo 3100 |
References
- Maniakas, A., et al. Evaluation of overall survival in patients with anaplastic thyroid carcinoma, 2000-2019. JAMA Oncology. 6 (9), 1397-1404 (2020).
- Molinaro, E., et al. Anaplastic thyroid carcinoma: From clinicopathology to genetics and advanced therapies. Nature Reviews Endocrinology. 13 (11), 644-660 (2017).
- Champa, D., Di Cristofano, A. Modeling anaplastic thyroid carcinoma in the mouse. Hormones and Cancer. 6 (1), 37-44 (2015).
- Vitiello, M., Kusmic, C., Faita, F., Poliseno, L. Analysis of lymph node volume by ultra-high-frequency ultrasound imaging in the Braf/Pten genetically engineered mouse model of melanoma. Journal of Visualized Experiments. (175), e62527 (2021).
- Wang, Y., et al. Low intensity focused ultrasound (LIFU) triggered drug release from cetuximab-conjugated phase-changeable nanoparticles for precision theranostics against anaplastic thyroid carcinoma. Biomaterials Science. 27 (1), 196-210 (2018).
- Mohammed, A., et al. Early detection and prevention of pancreatic cancer: Use of genetically engineered mouse models and advanced imaging technologies. Current Medicinal Chemistry. 19 (22), 3701-3713 (2012).
- Wege, A. K., et al. High resolution ultrasound including elastography and contrast-enhanced ultrasound (CEUS) for early detection and characterization of liver lesions in the humanized tumor mouse model. Clinical Hemorheology and Microcirculation. 52 (2-4), 93-106 (2012).
- Greco, A., et al. Preclinical imaging for the study of mouse models of thyroid cancer. International Journal of Molecular Sciences. 18 (12), 2731 (2017).
- Renault, G., et al.
- McFadden, D. G., et al. p53 constrains progression to anaplastic thyroid carcinoma in a Braf-mutant mouse model of papillary thyroid cancer. Proceedings of the National Academy of Sciences of the United States of America. 111 (16), 1600-1609 (2014).
- Garassini, M.
- Aldrich, J. E.
- Mancini, M., et al. Morphological ultrasound microimaging of thyroid in living mice. Endocrinology. 150 (10), 4810-4815 (2009).
- Ying, M., Yung, D. M., Ho, K. K. Two-dimensional ultrasound measurement of thyroid gland volume: a new equation with higher correlation with 3-D ultrasound measurement. Ultrasound in Medicine & Biology. 34 (1), 56-63 (2008).
