Nötrofil Hücre Dışı Tuzaklardan Miyeloperoksidaz-DNA ve Nötrofil Elastaz-DNA Komplekslerinin Modifiye Sandviç ELISA Kullanılarak Miktarının Belirlenmesi

Summary

Aktive edilmiş nötrofillerden türetilen nötrofil hücre dışı tuzak kalıntılarının, miyeloperoksidaz konjuge DNA ve nötrofil elastaz konjuge DNA komplekslerinin iki bileşenini kantitatif olarak ölçmek için modifiye edilmiş bir sandviç enzime bağlı immünosorbent test tekniği için bir protokol sunuyoruz.

Abstract

Mikroorganizmalar gibi bazı uyaranlar, nötrofillerin, temel olarak miyeloperoksidaz (MPO) ve nötrofil elastaz (NE) gibi granül proteinli DNA’dan ve sitoplazmik ve hücre iskeleti proteinlerinden oluşan ağ benzeri yapılar olan nötrofil hücre dışı tuzakları (NET’ler) serbest bırakmasına neden olur. Son zamanlarda NET’lere olan ilgi artmış olsa da, klinik ortamlarda NET’leri ölçmek için hassas, güvenilir bir test yöntemi mevcut değildir. Bu makalede, NET’lerin spesifik bileşenleri olan ve NET’lerin parçalanma ürünleri olarak hücre dışı boşluğa salınan dolaşımdaki NET’lerin iki bileşenini, MPO-DNA ve NE-DNA komplekslerini kantitatif olarak ölçmek için modifiye edilmiş bir sandviç enzime bağlı immünosorbent testi açıklanmaktadır. Test, yakalama antikorları ve DNA’ya özgü bir tespit antikoru olarak MPO veya NE için spesifik monoklonal antikorlar kullanır. MPO veya NE, MPO-DNA veya NE-DNA kompleksleri içeren numunelerin ilk inkübasyonu sırasında yakalama antikorunun bir bölgesine bağlanır. Bu tahlil, iyi doğrusallık ve yüksek tahliller arası ve tahlil içi hassasiyet gösterir. Eşlik eden akut solunum sıkıntısı sendromu olan COVID-19’lu 16 hastada kullandık ve MPO-DNA ve NE-DNA’nın plazma konsantrasyonlarının sağlıklı kontrollerden elde edilen plazmadan önemli ölçüde daha yüksek olduğunu bulduk. Bu tespit testi, insan plazması ve kültür süpernatantlarındaki NET’lerin özelliklerini araştırmak için güvenilir, oldukça hassas ve kullanışlı bir yöntemdir.

Introduction

Bu makale, DNA ^1,2 ile miyeloperoksidaz (MPO) ve nötrofil elastaz (NE) komplekslerini tespit etmek için sandviç enzime bağlı immünosorbent testi (ELISA) kullanarak biyolojik sıvılarda nötrofil hücre dışı tuzak (NET) oluşumunu ölçmek için bir yöntemi özetlemektedir. NET’ler, nötrofil granüllerinden kaynaklanan antimikrobiyal proteazlarla süslenmiş bir DNA omurgasından oluşur ^3,4. Hem MPO-DNA hem de NE-DNA kompleksleri, NET’lerin önemli ve spesifik bileşenleridir ve NET’lerin^parçalanma ürünleri olarak hücre dışı boşluğa salınır ^3,4.

Antimikrobiyal savunmadaki önemli fizyolojik rollerinin³ yanı sıra, NET’lerin trombogenezin⁶ teşviki ve sepsisin^{kötüleşmesi 7} dahil olmak üzere çeşitli patolojik etkileri de vardır ^4,5. Bu doğrultuda, NET’ler son zamanlarda dikkat çekmektedir. Bununla birlikte, NET’lerin in vivo kantitifikasyonu, hassas, güvenilir bir kantitatif test yönteminin olmaması nedeniyle zor olduğu kanıtlanmıştır.

NET’lerin floresan mikroskobu^8,9 ve akış sitometrisi 10 ile doğrudan ölçümü ve dolaşımdaki hücresiz DNA, nükleozomlar ve sitrüline histon H3’ün dolaylı ölçümü dahil olmak üzere birkaç yöntem mevcuttur^, ancak her yöntemin kendi avantajları ve sınırlamaları^{vardır 11}. İmmünofloresan mikroskobik yöntem NET’lere özgü olmasına ve NET oluşumunun lokalizasyonunu ve derecesini net olarak göstermesine rağmen, örnekler biyopsi dokusu ve salgılanan materyallerle sınırlıdır. Üstelik bu yöntemin yetenekli araştırmacılar tarafından yapılması gerekiyor ve sonuçların elde edilmesi uzun zaman alıyor. NET ile ilgili bileşenlerin dolaşımdaki seviyelerinin akış sitometrisi ile ölçülmesi kolaydır ve hızlı bir şekilde sonuç verir; ancak, yöntem NET^12’ye özgü değildir.

Biz¹³ ve diğerleri^1,2, yakalama antikorları olarak MPO veya NE için spesifik antikorlar ve DNA’ya özgü bir tespit antikoru kullanan modifiye edilmiş bir ELISA tekniği ile insan plazmasında dolaşımdaki NET bileşenlerini^, MPO-konjuge veya NE-konjuge DNA’yı ölçmek için oldukça hassas ve güvenilir bir test geliştirdik. Bu test, forbol 12-miristat 13-asetat (PMA) stimülasyonuna yanıt olarak aktive edilmiş nötrofiller tarafından salınan hücre kültürü süpernatantlarındaki NET bileşenlerini tanımlamak için ex vivo olarak da kullanılabilir.

Protocol

Bu çalışma Helsinki Bildirgesi’ne uygun olarak yürütülmüş ve Aichi Tıp Üniversitesi kurumsal inceleme kurulları tarafından onaylanmıştır (2017-H341, 2019-H137). Her katılımcıdan yazılı bilgilendirilmiş onam alındı. 1. Reaktif hazırlama NOT: Sandviç ELISA testini gerçekleştirmek için reaktifler aşağıda açıklandığı gibi hazırlanır. Kaplama tamponu:0,1 mol/L karbonat-bikarbonat tamponu yapmak içi…

Representative Results

Bu yöntem, MPO ile ilişkili ve NE ile ilişkili DNA’yı ölçmek için anti-MPO, anti-NE ve anti-DNA monoklonal antikorları olan bir sandviç ELISA kullandı (Şekil 1). Bu yöntemde, bir mikrotitre plakasının kuyucukları, DNA ile ilişkili MPO ve DNA ile ilişkili NE’nin yanı sıra DNA ile ilişkili olmayan MPO ve NE’yi yakalamak için MPO’ya özgü veya NE’ye özgü bir monoklonal antikor ile kaplandı. Test içi değişkenlik katsayısını (CV) hesaplamak için, COVID-19’lu hastal…

Discussion

MPO-DNA veya NE-DNA kompleksleri içeren numunelerin ilk inkübasyonu sırasında MPO veya NE’nin yakalama antikorunun bir bölgesine bağlandığı bir sandviç ELISA yöntemini tanımladık. Yıkandıktan sonra, numunelerin peroksidaz ile ilişkili bir anti-DNA monoklonal antikoru ile inkübe edilmesiyle “sandviç” tamamlanır. Bağlanmamış sekonder antikorun çıkarılmasından sonra, bağlı peroksidaz konjugatı, 405 nm’de spektrofotometrik olarak okunabilen çözünür bir son ürün veren bir kromojenik ABTS per…

Materials

1-Step Polymorphs	Accurate Chemical and Scientific Corporation	AN221725	Isolation of PMN's from human blood.
96-well microtiter plate	Thermo Fisher Scientific	467466	flat bottom
ABTS buffer solution	Sigma-Aldrich Merck	11 204 530 001	Contains sodium perborate, citric acid, and disodium hydrogen phosphate.
ABTS tablets	Sigma-Aldrich Merck	11 204 521 001	Each tablet contains 5 mg ABTS substrate and 60 mg vehicle substances.
Adhesive plastic cover, Axygen	Thermo Fisher Scientific	14222348
Anti-MPO antibody	Sigma-Aldrich Merck	07-496-I	Store at 2-8 °C. stable for 1 year. Host species is rabbit.
Anti-NE antibody, clone AHN-10	Sigma-Aldrich Merck	MABS461	Store at 2-8 °C. stable for 1 year. Host species is mouse.
Bovine serum albumin	Biomedical Science	BR-220700081	Albumin from bovine fraction V. Store at 2–8 °C. stable for 2 year.
DNase I	New England BioLabs	M0303M	Store at -20 °C
IgG, rabbit, Isotype Control	GENETEX, Inc.	GTX35035	Store as concentrated solution at 2–8 °C.
IgG1, mouse Isotype Control, clone Ci4	Merck	MABC002	Store as concentrated solution at 2–8 °C.
Lithium heparin blood collection tube	Becton Dickinson and Company
Microplate mixer	As one corporation	NS-P
Microplate Reader	Molecular Devices	SpectraMax 190	Any microplate plate reader capable of reading wavelengths from 405–490 nm can use.
Microplate reader application	Molecular Devices	SoftMax pro
Peroxidase-conjugated anti-DNA antibody, Cell death Detection ELISA	Roche Diagnostics	1154467500	bottle 2. Store at 2–8 °C. stable for 1 year.
Phorbol 12-myristate 13-acetate	Sigma-Aldrich Merck	P8139	Activation of PMN's from human blood.
Phosphate buffered solution	Takara Bio	T9181	Store at room temperature. Stable for 6 months.
SigmaPlot v14.5	Systat Software Inc. San Jose, CA, USA
Sodium azide	Fujifilm Wako Chemicals	190-14901	Store at room temperature.
t-Octylphenoxypolyethoxyethanol, Polyethylene glycol tert-octylphenyl ether	Fujifilm Wako Chemicals	9002-93-1	Store at room temperature.