При инфекции Mycoplasma pneumoniae серологические тесты могут давать хорошие результаты, но с низкой специфичностью из-за иммунологической перекрестной реакции. Собственный ИФА захвата антигена, описанный в этой статье, гарантирует высокую видовую специфичность и, как было показано, является надежным скрининговым тестом для точной диагностики M. pneumoniae.
Mycoplasma pneumoniae – это прокариот с дефицитом клеточной стенки, который, как известно, в основном колонизирует дыхательные пути человека и является эндемичным, с эпидемическим пиком каждые 6 лет, у детей старшего возраста и молодых людей. Диагностика M. pneumoniae является сложной задачей из-за привередливой природы возбудителя и возможности бессимптомного носительства. Лабораторная диагностика инфекции M. pneumoniae на основе титрования антител в образцах сыворотки пациентов остается наиболее практикуемым методом. Из-за потенциальной проблемы иммунологической перекрестной реактивности с использованием поликлональной сыворотки для M. pneumoniae был разработан иммуносорбентный анализ антиген-захвата (ИФА) для улучшения специфичности серологической диагностики. Пластины ИФА покрыты поликлональными антителами M. pneumoniae , выращенными у кроликов и специфичными после адсорбции против панели гетерологичных бактерий, которые разделяют антигены с видами M. pneumoniae и/ или, как известно, колонизируют дыхательные пути. Реагирующие гомологичные антигены M. pneumoniae затем специфически распознаются по соответствующим антителам в образцах сыворотки. Дальнейшая оптимизация физико-химических параметров, которым подвергается ИФА захвата антигена, привела к получению высокоспецифичного, чувствительного и воспроизводимого ИФА.
Микоплазмы являются одними из самых маленьких и простых известных прокариот. Они в основном отличаются от других бактерий отсутствием структуры клеточной стенки. Таким образом, микоплазмы были классифицированы в отдельный класс под названием Mollicutes1. Дефицит клеточной стенки придает внутреннюю устойчивость этим микроорганизмам против некоторых антимикробных агентов и в значительной степени отвечает за их полиморфизм. Микоплазмы имеют малый геном и уменьшенные размеры, что ограничивает их метаболические и биосинтетические возможности и объясняет их паразитарную и сапрофитную природу1.
Mycoplasma pneumoniae является одной из микоплазм, которые заражают человека, и считается самой вирулентной2. M. pneumoniae колонизирует верхние дыхательные пути, что приводит к атипичной пневмонии у детей и молодых людей. Клинические признаки, порожденные инфекцией M. pneumoniae, похожи на грипп, с головной болью, лихорадкой и кашлем3. Цитадренция M. pneumoniae к клеткам-хозяева опосредована органеллой прикрепления, включающей большую адгезию P1 и несколько вспомогательных белков 4,5. Более клинические проявления могут возникать из-за местного воспаления и стимуляции иммунной системы хозяина в результате тесного присоединения M. pneumoniae к слизистой оболочке дыхательных путей6. Хотя пневмония является отличительной чертой инфекции M. pneumoniae, было выявлено, что инфекция этой бактерией также может быть ответственна за широкий спектр нелегочных проявлений в различных анатомических местах, таких как центральная нервная система, сердце, кожа и суставы7.
Как и для всех видов Mycoplasma, диагностика M. pneumoniae является сложной. Клинические признаки, вызывающие микоплазмоз, в основном неочевидные и нехарактерные8. Поскольку очень трудно диагностировать инфекцию M. pneumoniae, полагаясь только на клинические проявления и симптомы, лабораторный скрининг представляет особый интерес9. Обнаружение колоний M. pneumoniae по культуре является золотым стандартом для правильной диагностики. Однако привередливые требования к росту и длительное время, необходимое для доставки окончательных результатов (1-2 недели), усложняют культуру и, таким образом, означают, что она редко используется для рутинной диагностики10. Технологии амплификации нуклеиновых кислот были проверены с точки зрения скорости и эффективности, хотя из-за их относительно высокой стоимости и недоступности в некоторых медицинских учреждениях эти молекулярные методы не считаются диагностическими тестами первой линии. Это правда, что коммерческие ПЦР-тесты широко используются для диагностики инфекций M. pneumoniae, но они все еще не могут заменить серологию. Кроме того, частое появление как ложноотрицательных, так и ложноположительных результатов ограничило использование ПЦР9. Как правило, серология остается наиболее практикуемой в лабораториях для диагностики инфекции M. pneumoniae. В течение десятилетий сообщалось о нескольких серологических подходах, таких как холодные гемагглютинины, тест фиксации комплемента11, тест на непрямую гемагглютинацию12, иммунофлуоресценция13 и технология ИФА, которая была впервые применена к серологии микоплазмы в начале 1980-х годов 14,15,16. Одной из основных проблем, возникающих при выполнении ИФА-серодиагностики инфекции M. pneumoniae, являются перекрестные реакции, что значительно снижает специфичность методики. Ранее сообщалось о неспецифической адсорбции сывороток человека антигенами M. pneumoniae; на самом деле, многие из антител, обнаруженных с помощью ИФА в сыворотках человека, не всегда могут быть связаны с микоплазмальными антигенами17 из-за общности M. pneumoniae с некоторыми бактериями18,19 и некоторыми тканями животных и человека20.
Из-за высоких фоновых показаний, наблюдаемых в обычном тесте ИФА, который практиковался в лаборатории, интерпретация результатов часто была сложной, и, таким образом, постановка правильного диагноза M. pneumoniae была трудным заданием. Столкнувшись с этой проблемой, мы решили улучшить ИФА M. pneumoniae , удалив неспецифические реакции антигенов M. pneumoniae с антителами, подлежащими тестированию. С этой целью мы работали над селективным истощением неспецифических антигенов M. pneumoniae с использованием метода адсорбции. Фактически, основной целью ИФА захвата антигена является конкретное обнаружение иммуноглобулина M. pneumoniae (Ig) G в образцах сыворотки крови человека. Концепция этого ИФА состоит в основном из селективного захвата специфических антигенов M. pneumoniae, перед добавлением образцов сыворотки крови человека. Эта селективность обеспечивается инкубацией сырого антигена M. pneumoniae с поликлональной антисывороткой M. pneumoniae , продуцируемой у кроликов в лаборатории, и превращением ее в видоспецифичным путем адсорбции против группы гетерологичных бактерий, принадлежащих или не принадлежащих к классу Mollicutes, разделяющих антигены с M. pneumoniae виды и/или известные колонизирующие дыхательные пути. Процедуру адсорбции повторяли трижды, а ее эффективность по устранению перекрестной реактивности проверяли иммуноблоттингом. Разработанный ИФА-анализ представляет собой комбинацию сэндвича и непрямого ИФА. Вкратце, колодцы ИФА-пластины сначала покрываются поликлональной антисывороткой, специфичной для M. pneumoniae. Затем добавляется антиген M. pneumoniae и захватывается между антисывороткой и антителами, присутствующими в образце сыворотки для тестирования. Сформированный иммунологический комплекс обнаруживается вторичным фермент-конъюгированным антителом (пероксидазо-конъюгированный IgG). Реакции визуализируются добавлением хромогенного субстрата, а поглощение измеряется спектрофотометрически. Этот внутренний ИФА схематично представлен на рисунке 1. Домашний ИФА оказался эффективным в выявлении инфекции M. pneumoniae и в настоящее время является одним из наиболее практикуемых тестов в рутинной диагностической деятельности.
В настоящем документе представлено общее описание собственной ИФА, в основном разработанной для обеспечения специфического скрининга M. pneumoniae инфекция. Приведены подробности о протоколе самого анализа ИФА, а также о некоторых этапах предварительной и постобработки. Специфика эт?…
The authors have nothing to disclose.
Это исследование финансировалось Министерством здравоохранения Туниса и Министерством высшего образования и научных исследований Туниса.
4-chloro-1-naphtol | Sigma-Aldrich | C6788-50 TAB | |
Bacto peptone | BD | 211677 | |
Bacto tryptone | BD | 211705 | |
Bovine serum albumin | Sigma-Aldrich | A9647-50 G | |
Carbonate bicarbonate buffer | Sigma-Aldrich | C3041-50 Cap | |
Casein | Sigma-Aldrich | C7078-1 KG | |
CMRL1066 | VWR | P0058-N1L | |
D-Glucose | Sigma-Aldrich | G7528-1KG | |
Difco PPLO Broth | BD | 255420 | Frey media |
ELISA plate-Reader | MULTISKAN GO, Thermo Scientific | Ref: 51119200 | |
Fetal bovine serum | Capricorn Scientific | FBS-12A | |
Goat peroxidase-conjugated anti-human IgG | Abcam | ab6759 | |
Goat peroxidase-conjugated anti-rabbit IgG | Life Technologies | 656120 | |
Hydrochloric Acid 37% | Prolab | 2025.290 | |
Hydrogen peroxide (H2O2), solution 30% | Scharlau | HI01361000 | |
L-arginin | Sigma-Aldrich | A5006-1KG | |
LB broth | Prepared in Pasteur Institute of Tunis | Provided by the laboratory of bacteriology of the Pasteur Institute of Tunis | |
Mycoplasma pneumoniae polyclonal antiserum produced in rabbit | Produced in Pasteur Institute of Tunis | Serum was produced by rabbit immunization at the Pasteur Institute of Tunis | |
Nicotinamide adenine dinucleotide | Sigma-Aldrich | N7004-10G | |
Nunc Maxisorp flat-bottom 96-well microtiter plate | Invitrogen | 44-2404-21 | |
Penicillin G sodium (1 MIU) | PANPHARMA | ||
Phenol red | fluka chemika | 77660 | |
Skim milk | MP Biomedicals | 902887 | |
Sodium bicarbonate | Sigma-Aldrich | S6297-1KG | |
Sodium carbonate | Sigma-Aldrich | S7795-1KG | |
Sodium chloride (NaCl) | Novachim | PS02805 | |
Sulfuric acid (H2SO4) 95-97% | Merck | 1007311011 | |
Thimerosal | USB | 22215 | |
TMB substrate (3,3’, 5,5’ TetraMethyl-Benzidine solution) | Abcam | ab142042 | |
Trizma base | Sigma-Aldrich | T6791-1 KG | |
Tween 20 | Sigma-Aldrich | 1379-500 ML | |
Yeast extract, powder, Ultrapure | Thermo Scientific | J23547 |