Visualizzazione della mitofagia con coloranti fluorescenti per mitocondri e lisosomi
Summary
La mitofagia è il meccanismo primario del controllo di qualità mitocondriale. Tuttavia, la valutazione della mitofagia in vivo è ostacolata dalla mancanza di saggi quantitativi affidabili. Presentato qui è un protocollo per l’osservazione della mitofagia nelle cellule viventi utilizzando un colorante mitocondriale fluorescente verde e un colorante lisosoma rosso-fluorescente.
Abstract
I mitocondri, essendo le centrali elettriche della cellula, svolgono ruoli importanti nella bioenergetica, nella generazione di radicali liberi, nell’omeostasi del calcio e nell’apoptosi. La mitofagia è il meccanismo primario del controllo della qualità mitocondriale ed è generalmente studiata utilizzando l’osservazione microscopica, tuttavia i saggi di mitofagia in vivo sono difficili da eseguire. La valutazione della mitofagia mediante imaging di organelli vivi è un metodo alternativo e necessario per la ricerca mitocondriale. Questo protocollo descrive le procedure per l’utilizzo del colorante mitocondriale fluorescente verde MitoTracker Green e del colorante lisosoma rosso-fluorescente LysoTracker Red nelle cellule vive, compreso il caricamento dei coloranti, la visualizzazione dei mitocondri e del lisosoma e i risultati attesi. Vengono inoltre forniti passaggi dettagliati per la valutazione della mitofagia in cellule vive, nonché note tecniche sulle impostazioni del software del microscopio. Questo metodo può aiutare i ricercatori a osservare la mitofagia usando la microscopia fluorescente a cellule vive. Inoltre, può essere utilizzato per quantificare mitocondri e lisosomi e valutare la morfologia mitocondriale.
Introduction
I mitocondri sono le centrali elettriche di quasi tutte le cellule eucariotiche 1,2. Oltre alla produzione di ATP attraverso la fosforilazione ossidativa, i mitocondri svolgono un ruolo vitale in altri processi come la bioenergetica, l’omeostasi del calcio, la generazione di radicali liberi, l’apoptosi e l’omeostasi cellulare 3,4,5. Poiché i mitocondri generano specie reattive dell’ossigeno (ROS) da più complessi nella catena di trasporto degli elettroni, sono costantemente stimolati da potenziale stress ossidativo, che può eventualmente portare a danni strutturali e disfunzioni quando il sistema di difesa antiossidante collassa 6,7. È stato scoperto che la disfunzione mitocondriale contribuisce a molte malattie, tra cui disturbi metabolici, neurodegenerazione e malattie cardiovascolari8. Pertanto, è fondamentale mantenere sane le popolazioni mitocondriali e la loro corretta funzione. I mitocondri sono organelli altamente plastici e dinamici; la loro morfologia e funzione sono controllate da meccanismi di controllo della qualità mitocondriale, comprese le modificazioni post-traduzionali (PTM) delle proteine mitocondriali, la biogenesi mitocondriale, la fusione, la fissione e la mitofagia 9,10. La fissione mitocondriale mediata dalla proteina 1 correlata alla dinamina (DRP1), una GTPasi della superfamiglia di proteine della dinamina, provoca mitocondri piccoli e rotondi e isola i mitocondri disfunzionali, che possono essere eliminati e degradati dalla mitofagia11,12.
La mitofagia è un processo cellulare che degrada selettivamente i mitocondri per autofagia, di solito si verifica nei mitocondri danneggiati a seguito di lesioni, invecchiamento o stress. Successivamente, questi mitocondri vengono consegnati ai lisosomi per la degradazione10. Pertanto, la mitofagia è un processo catabolico che aiuta a mantenere la quantità e la qualità dei mitocondri in uno stato sano in una vasta gamma di tipi di cellule. Svolge un ruolo cruciale nel ripristino dell’omeostasi cellulare in normali condizioni fisiologiche e di stress13,14. Le cellule sono caratterizzate da un complesso meccanismo mitofagia, che è indotto da diversi segnali di stress cellulare e cambiamenti dello sviluppo. Le vie regolatorie della mitofagia sono classificate come ubiquitina-dipendenti o recettore-dipendenti15,16; l’autofagia ubiquitina-dipendente è mediata dalla chinasi PINK1 e dal reclutamento dell’ubiquitina ligasi Parkin E3 nei mitocondri 17,18, mentre l’autofagia recettore-dipendente comporta il legame dei recettori dell’autofagia alla catena leggera LC3 della proteina associata ai microtubuli che media la mitofagia in risposta al danno mitocondriale19.
La microscopia elettronica a trasmissione (TEM) è il metodo più comunemente usato, e ancora uno dei metodi migliori, per osservare e rilevare la mitofagia20. Le caratteristiche morfologiche della mitofagia sono autofagosomi o autolisosomi formati dalla fusione di autofagosomi con lisosomi, che possono essere osservati da immagini al microscopio elettronico21. La debolezza della microscopia elettronica (EM), tuttavia, è l’incapacità di monitorare i processi dinamici della mitofagia, come la depolarizzazione mitocondriale, la fissione mitocondriale e la fusione di autofagosomi e lisosomi, nella cellula vivente20. Pertanto, la valutazione della mitofagia attraverso l’imaging degli organelli viventi è un metodo alternativo interessante per la ricerca mitocondriale. La tecnica di imaging delle cellule vive qui descritta utilizza due coloranti fluorescenti per colorare mitocondri e lisosomi. Quando si verifica la mitofagia, i mitocondri danneggiati o superflui inghiottiti dagli autofagosomi sono macchiati di verde dal colorante mitocondriale, mentre il colorante rosso colora i lisosomi. La fusione di questi autofagosomi e lisosomi, indicati come autolisosomi, fa sì che la fluorescenza verde e rossa si sovrapponga e si manifesti come punti gialli, indicando così la presenza di mitofagia22. Il colorante mitocondriale permeato dalle cellule (MitoTracker Green) contiene una porzione di clorometil leggermente tiolo-reattiva per etichettare i mitocondri23. Per marcare i mitocondri, le cellule vengono semplicemente incubate con il colorante, che si diffonde passivamente attraverso la membrana plasmatica e si accumula nei mitocondri attivi. Questo colorante mitocondriale può facilmente macchiare le cellule vive ed è meno efficace nella colorazione delle cellule morte o fissate con aldeidi. Il colorante lisosoma (LysoTracker Red) è una sonda acidotropica fluorescente utilizzata per l’etichettatura e il monitoraggio degli organelli acidi nelle cellule vive. Questo colorante presenta un’elevata selettività per gli organelli acidi e può marcare efficacemente le cellule vive a concentrazioni nanomolari24.
Le procedure per l’utilizzo di questi coloranti fluorescenti nelle cellule viventi, compreso il caricamento dei coloranti e la visualizzazione di mitocondri e lisosomi, sono presentate qui. Questo metodo può aiutare i ricercatori a osservare la mitofagia usando la microscopia fluorescente a cellule vive. Può anche essere usato per quantificare mitocondri e lisosomi e valutare la morfologia mitocondriale.
Protocol
Representative Results
Discussion
Il protocollo qui descritto fornisce un metodo per valutare e monitorare il processo dinamico della mitofagia nelle cellule viventi, che coinvolge autofagosomi, lisosomi e fissione mitocondriale, attraverso la co-colorazione con mitocondri e coloranti lisosomi. Il metodo può anche essere utilizzato per identificare i mitocondri e valutare la morfologia mitocondriale. Entrambi i coloranti utilizzati in questo studio dovrebbero essere protetti dalla luce, dovrebbero essere evitati cicli multipli di gelo-scongelamento e i …
Divulgazioni
The authors have nothing to disclose.
Acknowledgements
Questo lavoro è stato parzialmente finanziato dal National Key Research and Development Program of China (2017YFA0105601, 2018YFA0107102), dalla National Natural Science Foundation of China (81970333,31901044,) e dal Program for Professor of Special Appointment presso le Shanghai Institutions of Higher Learning (GZ2020008).
Materials
| Automated cell counter | Countstar | IC1000 | |
| Cell counting chamber slides | Countstar | 12-0005-50 | |
| Dulbecco's modified Eagle medium (DMEM) | Corning | 10-013-CV | |
| Dulbecco's phosphate-buffered saline (DPBS) | Corning | 21-031-CVC | |
| Glass bottom cell culture dish (confocal dish) | NEST | 801002 | |
| Image J (Rasband, NIH) | NIH | https://imagej.nih.gov/ij/download.html | |
| Krebs–Henseleit(KHB) buffer | Self-prepared | ||
| LysoTracker Red | Invitrogen | 1818430 | 100 µmol/L, red-fluorescent lysosome dye |
| MitoTracker Green | Invitrogen | 1842298 | 200 µmol/L stock, green-fluorescent mitochondria dye |
| Mouse Embryonic Fibroblasts | Self-prepared | ||
| Objective (63x oil lens) | ZEISS | ZEISS LSM 880 | |
| Trypsin-EDTA 0.25% | Gibico | Cat# 25200056 | |
| ZEISS LSM 880 Confocal Laser Scanning Microscope | ZEISS | ZEISS LSM 880 | |
| ZEN Microscopy Software 2.1 (confocal microscope imaging software) | ZEISS | ZEN 2.1 |
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