Longitudinal Fluorescence Monitoring and Averseive Interventions를 위한 고체 배지에서 개별 Caenorhabditis elegans 의 장기 배양
Summary
여기에서 우리는 평생 생리학적 매개변수 추적 및 형광 정량화를 위해 고체 배지에서 분리된 개별 선충을 배양하는 프로토콜을 제시합니다. 이 배양 시스템에는 동물이 도망가는 것을 방지하기 위해 단일 벌레 우물 주위에 팔미트산 장벽이 포함되어 있어 병원성 박테리아 및 화학적 스트레스 요인을 포함한 혐오적인 개입을 사용할 수 있습니다.
Abstract
Caenorhabditis elegans 는 노화 생물학을 연구하는 데 널리 사용됩니다. 예쁜꼬마선충 노화 연구의 표준 관행은 고체 선충 성장 배지(NGM)에서 벌레 그룹을 배양하여 생존 및 기타 생리학적 표현형에 대한 개체군 수준 데이터를 효율적으로 수집하고 형광 바이오마커 정량화를 위해 하위 집단을 주기적으로 샘플링할 수 있도록 하는 것입니다. 이 접근법의 한계는 (1) 시간이 지남에 따라 개별 벌레를 추적하여 관심 표현형에 대한 연령 궤적을 개발하고 (2) 배양 환경의 맥락에서 형광 바이오마커를 직접 모니터링할 수 없다는 것입니다. 대체 배양 접근법은 액체 배양 또는 미세 유체 공학을 사용하여 시간이 지남에 따라 개별 동물을 모니터링하며, 경우에 따라 형광 정량화를 포함하여 배양 환경이 고체 NGM과 문맥상 구별된다는 단점이 있습니다. WorMotel은 고체 NGM에서 분리된 웜을 배양하기 위한 이전에 설명한 미세 조립식 다중 웰 장치입니다. 각 벌레는 C. elegans의 접촉 방수제인 황산구리로 채워진 해자로 둘러싸인 고체 NGM을 포함하는 우물에 유지되어 개별 동물의 세로 모니터링이 가능합니다. 우리는 황산구리가 식이 제한, 병원성 박테리아 및 세포 스트레스를 유발하는 화학 물질을 포함하여 노화 연구에서 흔히 볼 수 있는 혐오적인 개입을 받을 때 벌레가 도망가는 것을 방지하기에 불충분하다는 것을 발견했습니다. 멀티웰 장치는 또한 형광 이미징에서 높은 배경 아티팩트를 생성하는 폴리디메틸실록산으로 성형됩니다. 이 프로토콜은 원래 인간 백혈구 항원(HLA) 유형 지정을 위해 설계된 상업적으로 이용 가능한 폴리스티렌 마이크로트레이를 사용하여 고체 NGM에서 분리된 회충을 배양하는 새로운 접근 방식을 설명하여 수명 전반에 걸쳐 생존, 생리학적 표현형 및 형광을 측정할 수 있습니다. 팔미트산 장벽은 혐오스러운 조건에서도 벌레가 도망가는 것을 방지합니다. 각 플레이트는 최대 96마리의 동물을 배양할 수 있으며 식이 제한, RNAi 및 화학 첨가물을 포함한 다양한 조건에 쉽게 적응할 수 있으며 수명 및 활동 데이터 수집을 위한 자동화 시스템과 호환됩니다.
Introduction
예쁜꼬마선충은 유전학, 세포생물학, 분자생물학 연구를 위한 강력한 모델 유기체로, 실험실에서 쉽게 배양할 수 있고, 생성 시간과 수명이 짧으며, 포유류와 높은 수준의 단백질 상동성을 공유하고, 형광 단백질과 염료를 생체 내에서 시각화할 수 있는 투명한 신체 구조를 가지고 있기 때문입니다1. 예쁜꼬마선충을 발달 생물학 및 노화를 포함한 다양한 분야에서 주요 모델 시스템으로 오랫동안 사용해 온 결과, 이들의 성장과 발달이 잘 이해되고 게놈이 완전히 시퀀싱되었으며, 게놈 차원의 RNAi 공급 라이브러리와 수천 개의 돌연변이 및 형질전환 균주를 포함한 강력한 유전 도구가 만들어졌습니다. 역사적으로 예쁜꼬마선충은 고체 한천 선충 성장 배지(NGM)에서 개체군으로 재배되며 표현형은 직접 관찰 또는 이미징 및 다운스트림 분석을 통해 수동으로 평가됩니다. 형광 현미경은 염료 또는 개별 예쁜꼬마선충 에서 형질전환적으로 발현된 형광 태그를 사용하여 다양한 분자 표현형을 캡처하는 데 사용됩니다.형광 이미징은 일반적으로 침습적이고 종종 치명적일 수 있는 얇은 아가로스 패드가 포함된 슬라이드에 동물을 고정하거나 마비시키는 것을 포함합니다. 또한 levamisole 또는 sodium azide와 같은 화학 물질의 사용이 포함되며, 이는 잠재적으로 관심있는 분자 과정을 방해 할 수 있습니다 2,3. 이러한 접근 방식을 사용하면 광범위한 표현형에 걸쳐 단면, 개체군 수준 데이터를 수집할 수 있지만 시간이 지남에 따라 개별 동물을 추적할 수는 없습니다.
최근 몇 년 동안 분리된 예쁜꼬마선충을 배양하기 위한 몇 가지 접근 방식이 등장하여 연구자들이 새로운 이미징 기술을 활용하여 시간이 지남에 따라 동물의 생리학적 및 분자적 표현형의 동적 변화를 포착할 수 있게 되었습니다. 예쁜꼬마선충 배양 접근법의 한 범주는 WormFarm4, Nemalife 칩5 및 Chronis et al.6의 ‘거동’ 칩을 포함한 미세 유체 장치입니다 7,8,9. 이와 관련된 액체 기반 배양 방법은 다중 웰 플레이트를 사용하여 시간이 지남에 따라 개별 벌레 또는 작은 개체군을 특성화합니다10,11. 미세 유체 및 마이크로플레이트 시스템은 단일 동물에 대한 예쁜꼬마선충의 표현형 반응에 대한 우수한 정량적 측정을 제공하지만 배양 환경에는 주요 한계가 있습니다. 예쁜꼬마선충(C. elegans)에 대한 과거 연구의 대다수, 특히 노화 분야는 고체 한천 기반 배지에서 완료되었습니다. 액체 배양은 예쁜꼬마선충이 지속적으로 헤엄치게 하고 기본 생물학을 바꿀 수 있는 뚜렷한 환경적 맥락을 나타냅니다. 예를 들어, 액체 배지에서 배양된 동물은 한천 기반 고체 NGM12,13에서 배양된 동물에 비해 지방 함량과 유전자 발현(특히 스트레스 반응에 관여하는 유전자의 경우)을 크게 변화시켰습니다. 단일 동물 이미징 방법의 또 다른 범주에는 페트리 플레이트의 그룹 배양에서 고체 NGM에서 배양된 벌레가 경험하는 표준 환경을 보다 밀접하게 모방하기 위해 고체 배지에서 개별 동물을 분리하는 폴리디메틸실록산(PDMS) 장치가 포함됩니다. WorMotel은 고체 배지에서 개별 동물을 배양하도록 설계된 240웰 PDMS 장치입니다. 각 웰은 한천 대신 저융점 아가로스를 사용하여 변형된 NGM으로 채워지고 박테리아 식품으로 시딩되어 페트리 플레이트를 사용하는 가장 일반적인 배양 시스템과 유사한 견고한 배지 환경을 만듭니다. 우물 벽은 둥글기 때문에 우물 내의 위치에 관계없이 각 동물을 이미지화할 수 있습니다(다중 웰 플레이트의 벽 근처에 있는 동물로 인한 시각적 가려짐 방지). 각 우물을 둘러싸고 있는 좁은 해자에 있는 황산구리는 동물을 우물에 가두기 위한 억지력으로 사용된다(14,15). 이 접근법의 한계는 황산구리가 식이 제한, 병원성 박테리아 또는 세포 스트레스를 유발하는 화학 물질(예: 파라콰트)을 포함하여 혐오스러운 환경 조건이 존재할 때 벌레가 도망가는 것을 방지하는 데 효과적이지 않다는 것입니다.
고체 배지를 사용하는 두 번째 시스템은 웜 코랄(Worm Corral)로, 하이드로겔을 사용하여 슬라이드 상의 각 웜에 대해 작은 밀폐 환경을 생성하여, 개별적으로 격리된 동물(16)의 장기 모니터링을 가능하게 한다. 주요 제한 사항은 동물을 알처럼 환경에 밀봉해야 하므로 번식을 방지하기 위해 멸균 동물을 사용해야 하고 약물 치료를 단일 적용으로 제한해야 한다는 것입니다. 다중 용량 약물 시험은 WorMotel에서 웜을 장치로 옮기기 전에 여러 차례의 노출을 수행하거나 실험 중에 웰에 추가 약물을 국소 적으로 추가하여 수행 할 수 있습니다. 그러나 후자의 경우 기존 웰에 추가 약물을 첨가한 후 실제 노출 선량을 정확하게 정량화하기 어렵고 약물이 얼마나 빨리 분해되는지에 따라 달라집니다. WorMotel과 Worm Corral은 모두 명시야 또는 암시야 이미징에 탁월하여 활동 및 동물 생리학(예: 성장 및 발달)과 관련된 정보를 캡처합니다. 이러한 시스템은 형광을 모니터링하는 데 사용할 수 있지만, 우리의 경험에 비추어 볼 때, 다른 단일 웜 이미징 기술을 만드는 데 사용되는 PDMS는 특히 예쁜꼬마선충 연구에 사용되는 가장 일반적인 형광단인 GFP의 방출 범위에서 일관된 형광 시각화 및 정량화를 방해하는 불규칙한 형광 아티팩트를 생성하는 미세 기포를 형성하고, 미립자를 포집하고, 기타 작은 이상을 포착하는 경향이 있습니다. 현재까지, 예쁜꼬마선충 개별 동물의 종방향 방식의 생형광 이미징은 주로 미세유체 장치17에 의존한다.
여기에서 우리는 혐오 개입과 직접 형광 이미징 모두와 호환되는 고체 배지에서 개별 예쁜꼬마선충을 배양하는 새로운 방법을 설명합니다. 이 접근 방식은 맞춤형 성형 PDMS 칩이 원래 미세 세포 독성 분석용으로 개발된 상업적으로 이용 가능한 폴리스티렌 마이크로트레이(일반적으로 Terasaki 트레이라고도 함)로 대체된다는 점을 제외하면 다른 단일 웜 이미징 기술과 개념이 유사합니다18. 이 마이크로트레이는 고체 배지로 채우고 박테리아 식품으로 씨를 뿌릴 수 있는 웰을 특징으로 하며, 표준 고체 NGM 배양 방법론에 따라 동물이 경험하는 환경을 밀접하게 모방합니다. 각 우물은 황산구리가 아닌 팔미트산의 혐오스러운 장벽으로 둘러싸여 있습니다. 팔미트산은 일반적으로 벌레가 식이 제한이나 화학적 스트레스 요인에 노출되는 것과 같은 혐오스러운 환경에 도전하는 실험에서 페트리 플레이트의 표준 그룹 배양을 사용하여 벌레가 고체 배지에서 도망치는 것을 방지하는 데 사용됩니다. 또한 마이크로트레이는 최소한으로 일관된 형광 배경을 생성하여 배양 환경에서 직접 동물의 형광 이미징을 가능하게 합니다. 이 새로운 단일 동물 고체 한천 기반 배양 시스템은 일생 동안 개별 동물을 추적하고 성장, 발달, 활동 및 수명을 모니터링할 수 있을 뿐만 아니라 직접 형광 현미경과도 호환됩니다. 벌레는 마비나 고정 없이 이미지화할 수 있기 때문에 배양 배지에 남아 있는 개별 동물에서 생체 내 형광 바이오마커를 종단으로 정량화할 수 있어 각 동물의 수명 동안 동적 변화를 관찰할 수 있습니다. 이러한 배양 시스템은 또한 수명 및 다른 건강 지표를 추적하기 위한 현세대 자동화 시스템과도 호환된다(14,19). 우리는 이 마이크로트레이 기반 시스템에서 개별 예쁜꼬마선충을 배양하기 위한 자세한 프로토콜을 제공하고, 잠재적인 함정 및 문제 해결에 대해 논의하고, 다른 시스템, 특히 업데이트되고 최적화된 WorMotel 프로토콜15와 관련된 장점과 한계에 대해 논의합니다.
각 단일 웜 배양 환경은 맞춤형 3D 인쇄 어댑터를 사용하여 표준 단일 웰 트레이 내부에 장착된 마이크로 트레이로 구성됩니다(그림 1A). 우물은 저융점 아가로스 선충 성장 배지(lmNGM)로 채워지고, 농축된 박테리아를 먹이로 씨를 뿌리고, 벌레가 도망가는 것을 방지하기 위해 팔미트산 코팅으로 둘러싸여 있습니다(그림 1B). 마이크로트레이와 단일 웰 플레이트의 벽 사이의 공간은 습도를 유지하기 위해 포화 물 결정으로 채워집니다(그림 1B). 결로를 방지하기 위해 트레이 뚜껑에 세제 코팅이 되어 있습니다. 단일 웜이 각 웰에 추가되고 단일 웰 트레이는 파라필름으로 밀봉되어 수분을 유지하고 산소 교환이 가능합니다. 최대 6개의 마이크로트레이를 한 명의 숙련된 연구원이 병렬로 합리적으로 준비할 수 있습니다.
Protocol
Representative Results
Discussion
여기에서는 원래 인간 백혈구 항원 조직 유형 분석을 위해 개발된 마이크로트레이를 적용하여 C. elegans 연구의 표준인 한천 기반 NGM과 맥락적으로 유사한 고체 배지 환경에서 시간이 지남에 따라 단일 예쁜꼬마선충의 분리 및 특성화를 허용하는 새로운 배양 시스템에 대해 설명합니다. 이 시스템은 식이 제한, 외인성 약물 치료, 화학적 또는 환경적 스트레스 요인에 대한 도전 및 RNAi?…
Divulgazioni
The authors have nothing to disclose.
Acknowledgements
이 작업은 GLS에 대한 NIH R35GM133588, LE에 대한 NIHT32GM008659 교육 보조금, GLS에 대한 미국 국립 의학 아카데미 촉매 상, 애리조나 이사회에서 관리하는 애리조나 주 기술 및 연구 이니셔티브 기금의 지원을 받았습니다.
Materials
| 3D-printed terasaki inserts | Custom printing company | Robot_Terasaki_tray_insert_10-20 -2021.STL |
FDM printing, nozzle size 0.6 mm using standard PLA plus filament |
| AirClean systems AC624LF vertical laminar flow fume hood | Fisher Scientific | 36-100-4376 | |
| Bacto peptone | Thermo Scientific | 211677 | |
| CaCl2 | Acros organics | 349615000 | |
| Caenorhabditis elegans N2 | Caenorhabditis Genetics Center (CGC) | N2 | Wildtype strain |
| Carbenicillin | Goldbio | C-103-25 | |
| Cholesterol | ICN Biomedicals Inc | 101380 | |
| Escherichia coli OP50 | Caenorhabditis Genetics Center (CGC) | OP50 | Standard labratory food for C. elegans |
| Ethanol | Millipore | ex0276-4 | |
| Fisher Vortex Genie 2 | Fisher Scientific | G-560 | |
| FUdR | Research Products International | F10705-1.0 | |
| Hydrating water crystals | M2 Polymer Technologies | Type S | Type S super absorbent polymer |
| Isopropyl ß-D-1-thiogalactopyranoside (IPTG) | GoldBio | I2481C100 | |
| K2HPO4 | Fisher Chemical | P288-500 | |
| Kimwipes | KimTech | 34155 | Task wipes |
| LB Broth, Lennox | BD Difco | 240230 | |
| Leica K5 sCMOS monochrome camera | Leica Microsystems | 11547112 | |
| Leica M205 FCA Fluorescent Stereo Microscope | Leica Microsystems | 10450826 | |
| Low-melt agarose | Research Products International | A20070-250.0 | |
| MgSO4 | Fisher Chemical | M-8900 | |
| NaCl | Fisher bioreagents | BP358-1 | |
| Nunc OmniTray Single-Well Plate | Thermo Scientific | 264728 | |
| Nystatin | Sigma | N1538 | |
| Palmitic acid | Acros organics | 129700010 | |
| Paper towels | Coastwide Professional | 365374 | |
| Parafilm M | Parafilm | 16-101 | |
| Stratagene UV Stratalinker 2400 | Stratagene | 400075 | UV crosslinker |
| Terasaki trays (Lambda) | One Lambda | 151431 | |
| Thermolyne Dri-bath | Thermolyne | DB28125 | |
| Tween | Thermo Scientific | J20605-AP |
Riferimenti
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