Summary

Zebra balıklarında germline düzenlemelerinin hızlı izolasyonu için sperm taraması

Published: February 10, 2023
doi:

Summary

CRISPR-Cas teknolojileri, genom düzenleme alanında devrim yarattı. Bununla birlikte, istenen germline düzenlemesini bulmak ve izole etmek büyük bir darboğaz olmaya devam etmektedir. Bu nedenle, bu protokol, standart PCR, kısıtlama sindirimi ve jel elektroforezi tekniklerini kullanarak germline düzenlemeleri için F0 CRISPR enjekte edilen zebra balığı spermini hızlı bir şekilde taramak için sağlam bir yöntem açıklamaktadır.

Abstract

Hedeflenen CRISPR-Cas nükleaz teknolojilerinin ortaya çıkışı, hem yerleşik hem de gelişmekte olan model sistemlerinde hassas genom düzenlemesi gerçekleştirme yeteneğinde devrim yarattı. CRISPR-Cas genom düzenleme sistemleri, CRISPR ile ilişkili (Cas) bir endonükleazı Cas endonükleazının çift iplikli bir kırılma oluşturduğu spesifik genomik DNA lokuslarına hedeflemek için sentetik bir kılavuz RNA (sgRNA) kullanır. Çift iplikçik kopmalarının içsel hataya eğilimli mekanizmalarla onarılması, lokusu bozarak yerleştirmelere ve / veya silmelere yol açar. Alternatif olarak, çift sarmallı DNA donörlerinin veya tek sarmallı DNA oligonükleotidlerinin bu sürece dahil edilmesi, tek nükleotid polimorfizmlerinden küçük immünolojik etiketlere ve hatta büyük floresan protein yapılarına kadar değişen hassas genom düzenlemelerinin dahil edilmesini sağlayabilir. Bununla birlikte, bu prosedürdeki büyük bir darboğaz, germ hattında istenen düzenlemeyi bulmak ve izole etmek olabilir. Bu protokol, Danio rerio’daki (zebra balığı) spesifik lokuslarda germline mutasyonlarını taramak ve izole etmek için sağlam bir yöntem ortaya koymaktadır; Bununla birlikte, bu prensipler in vivo sperm toplanmasının mümkün olduğu herhangi bir modele uyarlanabilir.

Introduction

CRISPR (Clustered Regular Interspaced Short Palindromic Repeats)/Cas sistemi, Danio rerio (zebra balığı) model sistemi 1,2,3,4’te lokuslara özgü mutajenez ve hassas genom düzenlemesi gerçekleştirmek için güçlü bir araçtır. Cas-ribonükleoprotein (RNP) iki ana bileşenden oluşur: bir Cas endonükleaz (genellikle Cas9 veya Cas12a) ve bir lokusa özgü sentetik kılavuz RNA (sgRNA)5. Birlikte, Cas-RNP, istenen lokusta, iki içsel onarım mekanizmasından biri tarafından onarılabilen çift sarmallı bir kırılma (DSB) üretir. Homolog olmayan uç birleştirme (NHEJ) onarım mekanizması hataya eğilimlidir ve genellikle DSB çevresinde çeşitli eklemeler veya silmeler (indel) ile sonuçlanır. Bu indeller, ortaya çıkan protein dizisinde bir çerçeve kayması mutasyonu veya erken durma meydana getirirlerse zararlı olabilirler. Alternatif olarak, homolojiye yönelik onarım (HDR) mekanizması, hasarı onarmak için DSB bölgesini çevreleyen homoloji bölgelerini içeren bir donör şablonu kullanır. Araştırmacılar, hassas genomik düzenlemeler oluşturmak için HDR sisteminden yararlanabilirler. Spesifik olarak, istenen düzenlemeleri ve genomdaki DSB bölgesini çevreleyen homoloji bölgelerini içeren çift sarmallı bir DNA donör yapısını birlikte enjekte edebilirler. Ticari olarak üretilen bu CRISPR bileşenleri için artan ölçek ekonomisi, çoklu lokusların taranmasının ve hassas genom düzenlemesi için daha büyük ölçekli çabaların oluşturulmasının önündeki engelleri büyük ölçüde azaltmıştır. Bununla birlikte, cinsel olarak üreyen hayvan modellerinde, büyük bir darboğaz, germline stabil mutant hayvanların tanımlanması ve izolasyonudur.

Zebra balığı model sistemi, ters genetik çalışmalarda kullanımını artıran birkaç temel nitelik sergilemektedir. Temel su barınağı ekipmanı ile çok sayıda arkaya çekilmeleri kolaydır ve dişiler tüm yıl boyunca6 boyunca yüksek doğurganlık sergilerler. Dahası, dış yumurtlama ve döllenme onları CRISPR / Cas bileşenlerinin mikroenjeksiyonuna uygun hale getirir. Cas-RNP, teoride tüm yavru hücreler tarafından miras alınan DSB’ler / onarımlar üretmek için genellikle tek hücreli aşamalı zebra balığı embriyolarına enjekte edilir. Bununla birlikte, diploid genomlar, her iki homolog kromozomu da mutajenize etmek için iki DSB / onarım olayı gerektirir. Ayrıca, Cas-RNP tek hücreli aşamada enjekte edilmesine rağmen, DSB / onarım, gelişimin sonraki noktalarına kadar gerçekleşmeyebilir. Birlikte, bu faktörler F0 enjekte edilen balıkların mozaik doğasına katkıda bulunur. Yaygın bir uygulama, F0 enjekte edilen balıkları geçmek ve F1 soyunu indeller / spesifik düzenlemeler için taramaktır. Bununla birlikte, F0 enjekte edilen tüm balıklar germline mutasyonlarına sahip olmadığından, bu uygulama istenen düzenlemeyi üretmeyen birçok verimsiz haçla sonuçlanır. F1 somatik doku yerine F0 germline taraması, istenen germline düzenlemesini izole etme olasılığını arttırır ve bu süreçte gerekli olan hayvan sayısını azaltır.

F0 enjekte edilen zebra balıklarından ötenaziye gerek kalmadan kolayca sperm toplanabilir. Bu özellik, dondurulmuş sperm stoklarının kriyoprezervasyonuna ve yeniden türetilmesine izin verir7, ancak istenen genomik mutasyonların germline taşıyıcılarını hızlı bir şekilde taramak, tanımlamak ve izole etmek için de kullanılabilir 8,9. Brocal ve ark. (2016) daha önce F0 enjekte edilen erkek zebra balığı10’da germline düzenlemelerini taramak için dizileme tabanlı bir yöntem tanımlamıştır. Germ hattında bulunan mutasyona uğramış alelleri tanımlamak için yararlı olsa da, bu yaklaşım yüksek verimde maliyetli olabilir ve tüm laboratuvarlar için erişilebilir olmayabilir. Buna karşılık, mevcut protokol, germline düzenlemelerini tanımlamak için ulaşılabilir ve uygun maliyetli bir elektroforez tabanlı strateji sunmaktadır. Spesifik olarak, bu protokol, yüksek çözünürlüklü agaroz jel elektroforezi kullanarak spesifik lokuslarda germline mutasyonlarını taramak ve izole etmek için sağlam bir yöntemi özetlemektedir. Ek olarak, bu protokol, belirli düzenlemeleri içeren bir bağışçı yapısının başarılı entegrasyonunu tanımlamak için benzer bir stratejiyi açıklamaktadır. Her zaman olduğu gibi, belirli düzenlemeler isteniyorsa, sıralama tabanlı stratejiler aşağıda açıklanan protokolle birlikte gerçekleştirilebilir. Bu protokol zebra balığı model sistemine özgü olsa da, bu ilkeler sperm toplanmasının rutin bir prosedür olduğu herhangi bir modele uyarlanabilir olmalıdır. Birlikte, bu stratejiler, F0 enjekte edilen erkeklerin, standart polimeraz zincir reaksiyonu (PCR) ve / veya kısıtlama sindiriminden sonra bir jel üzerinde çözülebilen germline indelleri / düzenlemeleri ile tanımlanmasına izin verecektir.

Protocol

Bu çalışma, Ulusal Sağlık Enstitüleri Laboratuvar Hayvanlarının Bakımı ve Kullanımı Kılavuzu’nda yer alan kılavuzlar doğrultusunda gerçekleştirilmiştir. Protokol, Austin Hayvan Bakımı ve Kullanımı Komitesi’ndeki Teksas Üniversitesi (AUP-2021-00254) tarafından onaylandı. 1. CRISPR mutagenezi için sgRNA’nın tasarlanması Hedeflenen lokusları içeren ekzon dizisini elde edin. Cas endonükleazına özgü bir protospacer bitişik moti…

Representative Results

Bu protokolde açıklanan deneysel yaklaşımlar, F0 enjekte edilen erkek spermlerinin toplanmasından elde edilen binlerce genomun analizine odaklanarak genom düzenlemelerinin veya varsayılan zararlı alellerin daha hızlı tanımlanmasına izin verir. Şekil 2 , bu protokol kullanılarak elde edilen sonuçların nasıl yorumlanacağını vurgulamaktadır. P2ry12 lokusunda mutasyon oluşturmak için, tek hücreli evre zebra balığı embriyolarına Cas…

Discussion

Bu protokol, F0 erkek sperm genomlarına odaklanmış analiz yoluyla CRISPR-Cas teknolojisini kullanarak varsayılan genom düzenlemelerini veya hedeflenen mutasyonları hızlı bir şekilde karakterize etmek için bir yöntem açıklamaktadır. Bu protokol, spermin ötenazi olmadan örnekleme için hazır olduğu diğer hayvan modellerine uygun olmalıdır. Bu yöntem, istenen düzenlemeler için tarama verimini artırır ve özellikle nadir HDR aracılı zincirleme olayları tanımlamak için kullanışlıdır. Bu yakl…

Divulgazioni

The authors have nothing to disclose.

Acknowledgements

Washington Üniversitesi Tıp Fakültesi’nden Anna Hindes’e, sıcak atış yöntemini kullanarak kaliteli sperm genomik DNA’sı elde etme konusundaki ilk çabaları için teşekkür ederiz. Bu çalışma, Ulusal Sağlık Enstitüleri Ulusal Artrit ve Kas-İskelet ve Deri Hastalıkları Enstitüsü tarafından Ödül kapsamında finanse edilmiştir (R01AR072009 to R.S.G.).

Materials

Agarose powder  Fisher BioReagents BP1356-100
Breeding tanks Carolina Biological  161937
BstNI Restriction Enzyme NEB R0168S
Cas9 Endonuclease IDT 1081060
DNA Ladder, 100 bp  Thermo Scientific  FERSM0241
dnah10 donor construct   Sigma-Aldrich DNA Oligo in Tube; 0.025 nM, standard desalt purification, dry.
Phosphorothioate bond on the donor at the first three phosphate bonds on both the 5’ and 3’ ends (5'-CCTCTCTCCCTTTCAGAAGCTTC
TGCTCATCCGCTGCTTCTGCCT
GGACCGAGTGTACCGTGCCGTC
AGTGATTACGTCACGC-3')
dnah10 forward primer  Sigma-Aldrich DNA Oligo in Tube; 0.025 nM, standard desalt purification, dry (5'-CATGGAACTCTTTCCTAATGAGT
TTGGC-3')
dnah10 reverse primer  Sigma-Aldrich DNA Oligo in Tube; 0.025 nM, standard desalt purification, dry ('5-AGTAGAGATCACACATCAACAGA
ATACAGC-3') 
dnah10 synthetic sgRNA  Synthego  Synthetic sgRNA, target sequence: 5'-GCTCATCCGCTGCTTCAGGC-3'
Electrophoresis power supply Thermo Scientific  105ECA-115
Filter forceps Millipore XX6200006P
Fish (system) water Generic n/a
Gel electrophoresis system (including casting frame, comb, and electrophoresis chamber)  Thermo Scientific  B2
Gel imaging light box  Azure Biosystems AZI200-01
Gel stain, 10000X  Invitrogen S33102
Glass bowl, 250 mL  Generic n/a
Isolation tanks, 0.8 L  Aquaneering ZT080
Microcap capillary tube with bulb, 20 µL  Drummond 1-000-0020/CA
Minicentrifuge Bio-Rad 12011919EDU
Micropipettes, various with appropriate tips Generic  n/a
Microwave  Generic  n/a
Nuclease free water Promega P119-C
Paper towels Generic n/a
PCR tubes, 0.2 mL Bioexpress T-3196-1
Plastic spoon, with drilled holes/slots  Generic n/a
KCl solution, 0.2 M RNAse Free Sigma-Aldrich P9333
p2ry12 forward primer  Sigma-Aldrich DNA Oligo in Tube; 0.025 nM, standard desalt purification, dry (5'-CCCAAATGTAATCCTGACCAGT
-3')
p2ry12 reverse primer Sigma-Aldrich DNA Oligo in Tube; 0.025 nM, standard desalt purification, dry (5'-CCAGGAACACATTAACCTGGAT
-3') 
p2ry12 synthetic sgRNA  Synthego  Synthetic sgRNA, target sequence: 5'-GGCCGCACGAGGTCTCCGCG-3'
Restriction Enzyme 10X Buffer NEB B6003SVIAL
NaOH solution, 50 mM  Thermo Scientific  S318; 424330010
Sponge, 1-inch x 1-inch cut with small oval divot Generic  n/a
Stereomicroscope Zeiss Stemi 508
Taq polymerase master mix, 2X Promega M7122
TBE Buffer Concentrate, 10X VWR E442
Thermal Cycler Bio-Rad 1861096
Tissue paper Fisher Scientific 06-666
Tricaine-methanesulfonate solution (Syncaine, MS-222), 0.016% in fish water (pH 7.0±0.2)  Syndel 200-266
Tris Base, 1M (Buffered with HCl to ph 8.0)  Promega H5131

Riferimenti

  1. Auer, T. O., Duroure, K., De Cian, A., Concordet, J. P., Del Bene, F. Highly efficient CRISPR/Cas9-mediated knock-in in zebrafish by homology-independent DNA repair. Genome Research. 24 (1), 142-153 (2014).
  2. Hwang, W. Y., et al. Efficient genome editing in zebrafish using a CRISPR-Cas system. Nature Biotechnology. 31 (3), 227-229 (2013).
  3. Jao, L. E., Wente, S. R., Chen, W. Efficient multiplex biallelic zebrafish genome editing using a CRISPR nuclease system. Proceedings of the National Academy of Sciences of the United States of America. 110 (34), 13904-13909 (2013).
  4. Troutwine, B. R., et al. The Reissner fiber is highly dynamic in vivo and controls morphogenesis of the spine. Current Biology. 30 (12), 2353-2362 (2020).
  5. Xu, Y., Li, Z. CRISPR-Cas systems: Overview, innovations and applications in human disease research and gene therapy. Computational and Structural Biotechnology Journal. 18, 2401-2415 (2020).
  6. Creaser, C. W. The technic of handling the zebrafish (Brachydanio rerio) for the production of eggs which are favorable for embryological research and are available at any specified time throughout the year. Copeia. 1930 (4), 159-161 (1934).
  7. Carmichael, C., Westerfiel, M., Varga, Z. M. Cryopreservatin and in vitro fertilization at the zebrafish international resource center. Methods in Molecular Biology. 546, 45-65 (2009).
  8. Wang, Y., Troutwine, B. R., Zhang, H., Gray, R. S. The axonemal dynein heavy chain 10 gene is essential for monocilia motility and spine alignment in zebrafish. Biologia dello sviluppo. 482, 82-90 (2021).
  9. Gray, R. S., et al. Postembryonic screen for mutations affecting spine development in zebrafish. Biologia dello sviluppo. 471, 18-33 (2021).
  10. Brocal, I., et al. Efficient identification of CRISPR/Cas9-induced insertions/deletions by direct germline screening in zebrafish. BMC Genomics. 17, 259 (2016).
  11. Davis, M. W., Jorgensen, E. M. ApE, A Plasmid Editor: A freely available DNA manipulation and visualization program. Frontiers in Bioinformatics. 2, 816619 (2022).
  12. Labun, K., et al. CHOPCHOP v3: Expanding the CRISPR web toolbox beyond genome editing. Nucleic Acids Research. 47, 171-174 (2019).
  13. Hill, J. T., et al. Poly Peak Parser: Method and software for identification of unknown indels using sanger sequencing of polymerase chain reaction products. Developmental Dynamics. 243 (12), 1632-1636 (2014).
  14. Varshney, G. K., et al. High-throughput gene targeting and phenotyping in zebrafish using CRISPR/Cas9. Genome Research. 25 (7), 1030-1042 (2015).
  15. Liu, Q., et al. Hi-TOM: A platform for high-throughput tracking of mutations induced by CRISPR/Cas systems. Science China. Life Sciences. 62 (1), 1-7 (2019).
  16. Sorlien, E. L., Witucki, M. A., Ogas, J. Efficient production and identification of CRISPR/Cas9-generated gene knockouts in the model system Danio rerio. Journal of Visualized Experiments. (138), e56969 (2018).
  17. Draper, B. W., Moens, C. B. A high-throughput method for zebrafish sperm cryopreservation and in vitro fertilization. Journal of Visualized Experiments. (29), e1395 (2009).
  18. Parant, J. M., George, S. A., Pryor, R., Wittwer, C. T., Yost, H. J. A rapid and efficient method of genotyping zebrafish mutants. Developmental Dynamics. 238 (12), 3168-3174 (2009).

Play Video

Citazione di questo articolo
Voigt, B., Minowa, R., Gray, R. S. Screening Sperm for the Rapid Isolation of Germline Edits in Zebrafish. J. Vis. Exp. (192), e64686, doi:10.3791/64686 (2023).

View Video