2光子顕微鏡を用いた閉鎖頭蓋外傷性脳損傷マウスおよび頭蓋窓における蛍光タンパク質発現の生体内イメージング
Summary
この研究は、マウスへの反復性外傷性脳損傷の送達と、2光子顕微鏡を使用したニューロン発現EGFPのその後の生体内イメージングのための頭蓋窓の同時移植を示しています。
Abstract
このプロトコルの目的は外因性の刺激への露出に縦断的に動物の頭脳の特定のセル・タイプ内の興味の蛋白質の表現そしてローカリゼーションを、視覚化する方法を示すことである。ここでは、閉鎖頭蓋骨外傷性脳損傷(TBI)の投与と、その後の縦断的生体内イメージングのための頭蓋窓の同時移植がマウスに示されています。マウスに、増強緑色蛍光タンパク質(EGFP)を発現するアデノ随伴ウイルス(AAV)をニューロン特異的プロモーター下で頭蓋内注射します。2〜4週間後、マウスはAAV注射位置の上でウェイトドロップデバイスを使用して反復TBIを受けます。同じ手術セッション内で、マウスに金属製のヘッドポストを埋め込み、次にTBIの衝撃部位の上にガラスの頭蓋窓を埋め込みます。EGFPの発現と細胞局在は、数か月にわたって外傷にさらされた同じ脳領域で2光子顕微鏡を使用して調べられます。
Introduction
外傷性脳損傷(TBI)は、スポーツ傷害、車両衝突、軍事戦闘に起因する可能性があり、世界的な健康上の懸念事項です。TBIは、生理学的、認知的、行動的障害、および生涯にわたる障害または死亡率につながる可能性があります1,2。TBIの重症度は、軽度、中等度、重度に分類でき、大多数は軽度のTBI(75%-90%)です3。TBI、特にTBIの反復発生は、神経変性を促進し、アルツハイマー病(AD)、筋萎縮性側索硬化症(ALS)、前頭側頭型認知症(FTD)、慢性外傷性脳症(CTE)などのいくつかの神経変性疾患の危険因子として機能する可能性があることがますます認識されています4,5,6.しかし、TBI誘発性神経変性の根底にある分子メカニズムは依然として不明であり、したがって活発な研究分野を表しています。ニューロンがTBIに応答し、TBIから回復する方法についての洞察を得るために、TBI後のマウスにおける縦断的生体内イメージングによって、特にニューロン内で目的の蛍光タグ付きタンパク質をモニタリングする方法を本明細書に記載する。
この目的のために、この研究は、以前に報告されたものと同様の閉鎖頭蓋骨TBIの投与のための外科的処置を組み合わせる方法を示しています7,8、 Goldeyらによって記述されたように、下流の生体内イメージングのための頭蓋窓の移植のための外科的処置と一緒に9。特に、最初に頭蓋窓を移植し、その後、TBIを誘発する体重減少の影響が窓を損傷し、マウスに取り返しのつかない害を及ぼす可能性があるため、同じ領域にTBIを実行することは現実的ではありません。したがって、このプロトコルは、TBIを投与してから、すべて同じ手術セッション内で、衝撃部位に直接頭蓋窓を埋め込むように設計されました。TBIと頭蓋窓移植の両方を1回の手術セッションで組み合わせることの利点は、マウスが手術を受ける回数が減ることです。さらに、後の手術セッションで窓を埋め込むのとは対照的に、TBIに対する即時反応(つまり、時間のタイムスケールで)を監視できます(つまり、TBI後数日の時間スケールで開始される初期イメージング)。また、頭蓋窓と生体内イメージングプラットフォームは、固定組織の免疫染色などの従来の方法によるニューロンタンパク質のモニタリングよりも優れています。例えば、同じマウスを複数の時点で研究できるため、個別の時点に必要なマウスのコホートとは対照的に、生体内イメージングに必要なマウスの数が少なくて済みます。さらに、同じニューロンを経時的に監視できるため、同じ細胞内の特定の生物学的または病理学的イベントを追跡できます。
概念実証として、シナプシンプロモーター下での増強緑色蛍光タンパク質(EGFP)のニューロン特異的発現がここで実証されています10。このアプローチは、1)オリゴデンドロサイトのミエリン塩基性タンパク質(MBP)プロモーターやアストロサイトのグリア線維性酸性タンパク質(GFAP)プロモーターなど、他の細胞タイプ特異的なプロモーターを利用することで異なる脳細胞タイプに拡張できます11、2)それらの遺伝子をEGFP遺伝子と融合させることによる目的の異なる標的タンパク質、および3)異なる蛍光色素に融合した複数のタンパク質を共発現します。ここでは、EGFPは、頭蓋内注射によるアデノ随伴ウイルス(AAV)送達を介してパッケージ化され、発現されます。閉じた頭蓋骨TBIは、ウェイトドロップデバイスを使用して投与され、その後、頭蓋窓が埋め込まれます。ニューロンEGFPの可視化は、2光子顕微鏡を使用してin vivoでEGFP蛍光を検出するために頭蓋窓を介して達成されます。2光子レーザーでは、最小限の光損傷で皮質組織の奥深くまで浸透することができ、個々のマウス内の同じ皮質領域を数日から最大数ヶ月にわたって縦断的に繰り返しイメージングすることができます12,13,14,15。要するに、TBI手術と生体内イメージングを組み合わせるこのアプローチは、TBI誘発性疾患の病理に寄与する分子イベントの理解を深めることを目的としています16,17。
Protocol
Representative Results
Discussion
本研究では、AAV注射、TBI投与、頭蓋窓留置ヘッドポストを組み合わせて、マウスの脳皮質(IV層およびV層)内のEGFP標識ニューロンの縦断的画像解析を行い、皮質ニューロンに対するTBIの影響を観察しました。この研究は、ここで選択された海馬の上のTBI部位が、頭蓋窓の移植に比較的平らで広い表面を提供することを指摘しています。逆に、頭蓋骨はこの部位の前方が比較的狭いため、ヘッド?…
Divulgazioni
The authors have nothing to disclose.
Acknowledgements
AAV(PHP.eB)-Syn1-EGFPウイルスを寄贈してくださったマサチューセッツ大学チャン医科大学のMiguel Sena-Esteves博士と、マウスの頭蓋骨のスケッチを描いてくださったマサチューセッツ大学チャン医科大学のDebra Cameron博士に感謝します。また、Bosco、Schafer、Henningerの各研究室の現在および過去のメンバーの提案とサポートにも感謝します。この研究は、国防総省(W81XWH202071/PRARP)からDAB、DS、およびNHに資金提供されました。
Materials
| Adjustable Precision Applicator Brushes | Parkell | S379 | |
| BD insulin syringe | BD | NDC/HRI#08290-3284-38 | 5/16" x 31G |
| Betadine | Purdue | NDC67618-151-17 | including 7.5% povidone iodine |
| Buprenorphine | PAR Pharmaceutical | NDC 42023-179-05 | |
| Cefazolin | HIKMA Pharmaceutical | NDC 0143-9924-90 | |
| Ceramic Mixing Dish | Parkell | SKU: S387 | For dental cement preparation |
| Cotton Tipped Applicators | ZORO | catlog #: G9531702 | |
| Catalyst | Parkell | S371 | full name: "C" Universal TBB Catalyst |
| Dental cement powder | Parkell | S396 | Radiopaque L-Powder for C&B Metabond |
| Dental drill | Foredom | H.MH-130 | |
| Dental drill controller | Foredom | HP4-310 | |
| Dexamethasone | Phoenix | NDC 57319-519-05 | |
| EF4 carbide bit | Microcopy | Lot# C150113 | Head Dia/Lgth/mm 1.0/4.2 |
| Ethonal | Fisher Scientific | 04355223EA | 75% |
| FG1/4 carbide bit | Microcopy | Lot# C150413 | Head Dia/Lgth/mm 0.5/0.4 |
| FG4 carbide bit | Microcopy | Lot# C150309 | Head Dia/Lgth/mm 1.4/1.1 |
| Headpost | N/A | N/A | Custom-manufactured |
| Heating apparatus | CWE | TC-1000 Mouse | equiped with the stereotaxic instrument and be used while operating surgery |
| Heating blanket | CVS pharmacy | E12107 | extra heating device and be used after surgery |
| Isoflurane | Pivetal | NDC 46066-755-03 | |
| Isoflurane induction chamber | Vetequip | 89012-688 | induction chamber for short |
| Isoflurane volatilizing machine | Vetequip | 911103 | |
| Isoflurane volatilizing machine holder | Vetequip | 901801 | |
| Leica surgical microscope | Leica | LEICA 10450243 | |
| Lubricant ophthalmic ointment | Picetal | NDC 46066-753-55 | |
| Marker pen | Delasco | SMP-BK | |
| Meloxicam | Norbrook | NDC 55529-040-10 | |
| Microinjection pump and its controller | World Precision Instruments | micro4 and UMP3 | |
| Microliter syringe | Hamilton | Hamilton 80014 | 1701 RN, 10 μL gauge for syringe and 32 gauge for needle, 2 in, point style 3 |
| Mosquito forceps | CAROLINA | Item #:625314 | Stainless Steel, Curved, 5 in |
| Depilatory agent | McKesson Corporation | N/A | Nair Hair Aloe & Lanolin Hair Removal Lotion |
| Microscope 1 | Nikon | SMZ745 | Nikon microscope for cranial window preparation |
| Microscope 2 | Zeiss | LSM 7 MP | two-photon microscope |
| Multiphoton laser | Coherent | Chameleon Ultra II, Model: MRU X1, VERDI 18W | laser for two-photon microscopy |
| Non-absorbable surgical suture | Harvard Apparatus | catlog# 59-6860 | 6-0, with round needle |
| Norland Optical Adhesive 81 | Norland Products | NOA 81 | |
| No-Snag Needle Holder | CAROLINA | Item #: 567912 | |
| Quick base liquid | Parkell | S398 | "B" Quick Base For C&B Metabond |
| Regular scissor 1 | Eurostat | eurostat es5-300 | |
| Regular scissor 2 | World Precision Instruments | No. 501759-G | |
| Round cover glass 1 | Warner instruments | CS-5R Cat# 64-0700 | for 5 mm of diameter |
| Round cover glass 2 | Warner instruments | CS-3R Cat# 64-0720 | for 3 mm of diameter |
| Rubber rings | Orings-Online | Item # OO-014-70-50 | O-Rings |
| Saline | Bioworld | L19102411PR | |
| Spring scissor 1 | World Precision Instruments | No. 91500-09 | tip straight |
| Spring scissor 2 | World Precision Instruments | No. 91501-09 | tip curved |
| Stereotaxic platform | KOPF | Model 900LS | |
| Super glue | Henkel | Item #: 1647358 | |
| surgical Caliper | World Precision Instruments | No. 501200 | |
| Surgical forceps 1 | ELECTRON MICROSCOPY SCIENCES | Catlog# 0508-5/45-PO | style 5/45, curved |
| Surgical forceps 2 | ELECTRON MICROSCOPY SCIENCES | catlog# 0103-5-PO | style 5, straight |
| Surgical forceps 3 | ELECTRON MICROSCOPY SCIENCES | catlog# 72912 | |
| Surgical forceps 4 | ELECTRON MICROSCOPY SCIENCES | Catlog# 0508-5/45-PO | style 5/45, curved |
| Surgical gauze | ZORO | catlog #: G0593801 | |
| Surgical lamp | Leica | Leica KL300 LED | |
| UV box | Spectrolinker | XL-1000 | also called UV crosslinker |
| Vaporguard | Vetequip | 931401 | |
| Vetbond Tissue Adhesive | 3M Animal Care | Part Number:014006 |
Riferimenti
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