Intravital billeddannelse af fluorescerende proteinekspression hos mus med en lukket kranium traumatisk hjerneskade og kranievindue ved hjælp af et to-fotonmikroskop
Summary
Denne undersøgelse viser levering af en gentagen traumatisk hjerneskade på mus og samtidig implantation af et kranievindue til efterfølgende intravital billeddannelse af en neuron-udtrykt EGFP ved hjælp af to-fotonmikroskopi.
Abstract
Målet med denne protokol er at demonstrere, hvordan man i længderetningen visualiserer ekspression og lokalisering af et protein af interesse inden for specifikke celletyper i et dyrs hjerne ved udsættelse for eksogene stimuli. Her vises administrationen af en lukket kranietraumatisk hjerneskade (TBI) og samtidig implantation af et kranievindue til efterfølgende langsgående intravital billeddannelse hos mus. Mus injiceres intrakranielt med en adenoassocieret virus (AAV), der udtrykker forbedret grønt fluorescerende protein (EGFP) under en neuronal specifik promotor. Efter 2 til 4 uger udsættes musene for en gentagen TBI ved hjælp af en vægttabsenhed over AAV-injektionsstedet. Inden for samme kirurgiske session implanteres musene med en metalhovedstolpe og derefter et kranievindue af glas over TBI-påvirkningsstedet. Ekspression og cellulær lokalisering af EGFP undersøges ved hjælp af et to-fotonmikroskop i samme hjerneområde udsat for traumer i løbet af måneder.
Introduction
Traumatisk hjerneskade (TBI), som kan skyldes sportsskader, køretøjskollisioner og militær kamp, er et verdensomspændende sundhedsproblem. TBI kan føre til fysiologiske, kognitive og adfærdsmæssige underskud og livslang handicap eller dødelighed 1,2. TBI-sværhedsgraden kan klassificeres som mild, moderat og svær, langt størstedelen er mild TBI (75% -90%)3. Det anerkendes i stigende grad, at TBI, især gentagne forekomster af TBI, kan fremme neuronal degeneration og tjene som risikofaktorer for flere neurodegenerative sygdomme, herunder Alzheimers sygdom (AD), amyotrofisk lateral sklerose (ALS), frontotemporal demens (FTD) og kronisk traumatisk encefalopati (CTE) 4,5,6. Imidlertid forbliver de molekylære mekanismer, der ligger til grund for TBI-induceret neurodegeneration, uklare og repræsenterer således et aktivt studieområde. For at få indsigt i, hvordan neuroner reagerer på og kommer sig efter TBI, er en metode til overvågning af fluorescerende mærkede proteiner af interesse, specifikt inden for neuroner, ved langsgående intravital billeddannelse hos mus efter TBI beskrevet heri.
Til dette formål viser denne undersøgelse, hvordan man kombinerer en kirurgisk procedure til administration af TBI med lukket kranium, der ligner det, der tidligere er rapporteret7,8, sammen med en kirurgisk procedure til implantation af et kranievindue til nedstrøms intravital billeddannelse, som beskrevet af Goldey et al9. Især er det ikke muligt at implantere et kranievindue først og derefter udføre en TBI i samme region, da virkningen af vægtfaldet, der inducerer TBI, sandsynligvis vil beskadige vinduet og forårsage uoprettelig skade på musen. Derfor blev denne protokol designet til at administrere TBI og derefter implantere kranievinduet direkte over slagstedet, alt sammen inden for samme kirurgiske session. En fordel ved at kombinere både TBI og kranial vinduesimplantation i en enkelt kirurgisk session er en reduktion i antallet af gange, en mus udsættes for kirurgi. Desuden giver det mulighed for at overvåge den øjeblikkelige reaktion (dvs. på timeskalaen) på TBI, i modsætning til at implantere vinduet ved en senere kirurgisk session (dvs. indledende billeddannelse, der starter på en tidsskala på dage efter TBI). Kranievinduet og den intravitale billeddannelsesplatform giver også fordele i forhold til overvågning af neuronale proteiner ved konventionelle metoder såsom immunfarvning af fast væv. For eksempel kræves færre mus til intravital billeddannelse, da den samme mus kan studeres på flere tidspunkter, i modsætning til separate kohorter af mus, der er nødvendige for diskrete tidspunkter. Endvidere kan de samme neuroner overvåges over tid, så man kan spore specifikke biologiske eller patologiske hændelser i samme celle.
Som et bevis på konceptet demonstreres det neuronspecifikke udtryk for forbedret grønt fluorescerende protein (EGFP) under synapsinpromotoren her10. Denne tilgang kan udvides til 1) forskellige hjernecelletyper ved at anvende andre celletypespecifikke promotorer, såsom myelinbasisk protein (MBP) promotor til oligodendrocytter og glialfibrillært surt protein (GFAP) promotor til astrocytter11, 2) forskellige målproteiner af interesse ved at fusionere deres gener med EGFP-genet og 3) co-ekspression af flere proteiner fusioneret til forskellige fluoroforer. Her pakkes EGFP og udtrykkes via adeno-associeret virus (AAV) levering gennem en intrakraniel injektion. En TBI med lukket kranium administreres ved hjælp af en vægtfaldsanordning efterfulgt af implantation af et kranievindue. Visualisering af neuronal EGFP opnås gennem kranievinduet ved hjælp af to-fotonmikroskopi til påvisning af EGFP-fluorescens in vivo. Med to-fotonlaseren er det muligt at trænge dybere ind i det kortikale væv med minimal fotoskade, hvilket muliggør gentagen langsgående billeddannelse af de samme kortikale regioner inden for en individuel mus i dage og op til måneder12,13,14,15. Alt i alt har denne tilgang til at kombinere en TBI-operation med intravital billeddannelse til formål at fremme forståelsen af de molekylære begivenheder, der bidrager til TBI-induceret sygdomspatologi16,17.
Protocol
Representative Results
Discussion
I denne undersøgelse blev AAV-injektion, TBI-administration og en hovedpost med kranial vinduesimplantation kombineret til langsgående billeddannelsesanalyse af EGFP-mærkede neuroner i musehjernebarken (lag IV og V) for at observere virkningerne af TBI på kortikale neuroner. Denne undersøgelse bemærker, at TBI-stedet valgt her, over hippocampus, giver en relativt flad og bred overflade til implantation af kranievinduet. Omvendt er kraniet relativt smalt foran dette sted, og derfor er det svært at sikre, at hovedst…
Divulgazioni
The authors have nothing to disclose.
Acknowledgements
Vi takker Dr. Miguel Sena-Esteves ved University of Massachusetts Chan Medical School for at give AAV (PHP.eB) -Syn1-EGFP-virus og Debra Cameron ved University of Massachusetts Chan Medical School for at tegne musens kranieskits. Vi takker også nuværende og tidligere medlemmer af Bosco-, Schafer- og Henninger-laboratorierne for deres forslag og støtte. Dette arbejde blev finansieret af forsvarsministeriet (W81XWH202071/PRARP) til DAB, DS og NH.
Materials
| Adjustable Precision Applicator Brushes | Parkell | S379 | |
| BD insulin syringe | BD | NDC/HRI#08290-3284-38 | 5/16" x 31G |
| Betadine | Purdue | NDC67618-151-17 | including 7.5% povidone iodine |
| Buprenorphine | PAR Pharmaceutical | NDC 42023-179-05 | |
| Cefazolin | HIKMA Pharmaceutical | NDC 0143-9924-90 | |
| Ceramic Mixing Dish | Parkell | SKU: S387 | For dental cement preparation |
| Cotton Tipped Applicators | ZORO | catlog #: G9531702 | |
| Catalyst | Parkell | S371 | full name: "C" Universal TBB Catalyst |
| Dental cement powder | Parkell | S396 | Radiopaque L-Powder for C&B Metabond |
| Dental drill | Foredom | H.MH-130 | |
| Dental drill controller | Foredom | HP4-310 | |
| Dexamethasone | Phoenix | NDC 57319-519-05 | |
| EF4 carbide bit | Microcopy | Lot# C150113 | Head Dia/Lgth/mm 1.0/4.2 |
| Ethonal | Fisher Scientific | 04355223EA | 75% |
| FG1/4 carbide bit | Microcopy | Lot# C150413 | Head Dia/Lgth/mm 0.5/0.4 |
| FG4 carbide bit | Microcopy | Lot# C150309 | Head Dia/Lgth/mm 1.4/1.1 |
| Headpost | N/A | N/A | Custom-manufactured |
| Heating apparatus | CWE | TC-1000 Mouse | equiped with the stereotaxic instrument and be used while operating surgery |
| Heating blanket | CVS pharmacy | E12107 | extra heating device and be used after surgery |
| Isoflurane | Pivetal | NDC 46066-755-03 | |
| Isoflurane induction chamber | Vetequip | 89012-688 | induction chamber for short |
| Isoflurane volatilizing machine | Vetequip | 911103 | |
| Isoflurane volatilizing machine holder | Vetequip | 901801 | |
| Leica surgical microscope | Leica | LEICA 10450243 | |
| Lubricant ophthalmic ointment | Picetal | NDC 46066-753-55 | |
| Marker pen | Delasco | SMP-BK | |
| Meloxicam | Norbrook | NDC 55529-040-10 | |
| Microinjection pump and its controller | World Precision Instruments | micro4 and UMP3 | |
| Microliter syringe | Hamilton | Hamilton 80014 | 1701 RN, 10 μL gauge for syringe and 32 gauge for needle, 2 in, point style 3 |
| Mosquito forceps | CAROLINA | Item #:625314 | Stainless Steel, Curved, 5 in |
| Depilatory agent | McKesson Corporation | N/A | Nair Hair Aloe & Lanolin Hair Removal Lotion |
| Microscope 1 | Nikon | SMZ745 | Nikon microscope for cranial window preparation |
| Microscope 2 | Zeiss | LSM 7 MP | two-photon microscope |
| Multiphoton laser | Coherent | Chameleon Ultra II, Model: MRU X1, VERDI 18W | laser for two-photon microscopy |
| Non-absorbable surgical suture | Harvard Apparatus | catlog# 59-6860 | 6-0, with round needle |
| Norland Optical Adhesive 81 | Norland Products | NOA 81 | |
| No-Snag Needle Holder | CAROLINA | Item #: 567912 | |
| Quick base liquid | Parkell | S398 | "B" Quick Base For C&B Metabond |
| Regular scissor 1 | Eurostat | eurostat es5-300 | |
| Regular scissor 2 | World Precision Instruments | No. 501759-G | |
| Round cover glass 1 | Warner instruments | CS-5R Cat# 64-0700 | for 5 mm of diameter |
| Round cover glass 2 | Warner instruments | CS-3R Cat# 64-0720 | for 3 mm of diameter |
| Rubber rings | Orings-Online | Item # OO-014-70-50 | O-Rings |
| Saline | Bioworld | L19102411PR | |
| Spring scissor 1 | World Precision Instruments | No. 91500-09 | tip straight |
| Spring scissor 2 | World Precision Instruments | No. 91501-09 | tip curved |
| Stereotaxic platform | KOPF | Model 900LS | |
| Super glue | Henkel | Item #: 1647358 | |
| surgical Caliper | World Precision Instruments | No. 501200 | |
| Surgical forceps 1 | ELECTRON MICROSCOPY SCIENCES | Catlog# 0508-5/45-PO | style 5/45, curved |
| Surgical forceps 2 | ELECTRON MICROSCOPY SCIENCES | catlog# 0103-5-PO | style 5, straight |
| Surgical forceps 3 | ELECTRON MICROSCOPY SCIENCES | catlog# 72912 | |
| Surgical forceps 4 | ELECTRON MICROSCOPY SCIENCES | Catlog# 0508-5/45-PO | style 5/45, curved |
| Surgical gauze | ZORO | catlog #: G0593801 | |
| Surgical lamp | Leica | Leica KL300 LED | |
| UV box | Spectrolinker | XL-1000 | also called UV crosslinker |
| Vaporguard | Vetequip | 931401 | |
| Vetbond Tissue Adhesive | 3M Animal Care | Part Number:014006 |
Riferimenti
- Bowman, K., Matney, C., Berwick, D. M. Improving traumatic brain injury care and research: a report from the National Academies of Sciences, Engineering, and Medicine. JAMA. 327 (5), 419-420 (2022).
- National Academies of Sciences, Engineering, and Medicine. . Traumatic Brain Injury: A Roadmap for Accelerating Progress. , (2022).
- Xu, X., et al. Repetitive mild traumatic brain injury in mice triggers a slowly developing cascade of long-term and persistent behavioral deficits and pathological changes. Acta Neuropathologica Communications. 9 (1), 60 (2021).
- Chen-Plotkin, A. S., Lee, V. M. Y., Trojanowski, J. Q. TAR DNA-binding protein 43 in neurodegenerative disease. Nature Reviews Neurology. 6 (4), 211-220 (2010).
- Mackenzie, I. R., Rademakers, R., Neumann, M. TDP-43 and FUS in amyotrophic lateral sclerosis and frontotemporal dementia. The Lancet. Neurology. 9 (10), 995-1007 (2010).
- McKee, A. C., et al. The first NINDS/NIBIB consensus meeting to define neuropathological criteria for the diagnosis of chronic traumatic encephalopathy. Acta Neuropathologica. 131 (1), 75-86 (2016).
- Henninger, N., et al. Attenuated traumatic axonal injury and improved functional outcome after traumatic brain injury in mice lacking Sarm1. Brain. 139, 1094-1105 (2016).
- Bouley, J., Chung, D. Y., Ayata, C., Brown, R. H., Henninger, N. Cortical spreading depression denotes concussion injury. Journal of Neurotrauma. 36 (7), 1008-1017 (2019).
- Goldey, G. J., et al. Removable cranial windows for long-term imaging in awake mice. Nature Protocols. 9 (11), 2515-2538 (2014).
- Kugler, S., et al. Neuron-specific expression of therapeutic proteins: evaluation of different cellular promoters in recombinant adenoviral vectors. Molecular and Cellular Neurosciences. 17 (1), 78-96 (2001).
- von Jonquieres, G., et al. Glial promoter selectivity following AAV-delivery to the immature brain. PLoS One. 8 (6), 65646 (2013).
- Trachtenberg, J. T., et al. Long-term in vivo imaging of experience-dependent synaptic plasticity in adult cortex. Nature. 420 (6917), 788-794 (2002).
- Mostany, R., et al. Altered synaptic dynamics during normal brain aging. The Journal of Neuroscience. 33 (9), 4094-4104 (2013).
- Yang, Q., Vazquez, A. L., Cui, X. T. Long-term in vivo two-photon imaging of the neuroinflammatory response to intracortical implants and micro-vessel disruptions in awake mice. Biomaterials. 276, 121060 (2021).
- Stosiek, C., Garaschuk, O., Holthoff, K., Konnerth, A. In vivo two-photon calcium imaging of neuronal networks. Proceedings of the National Academy of Sciences. 100 (12), 7319-7324 (2003).
- Grutzendler, J., Gan, W. B. Two-photon imaging of synaptic plasticity and pathology in the living mouse brain. NeuroRx. 3 (4), 489-496 (2006).
- Isshiki, M., et al. Enhanced synapse remodelling as a common phenotype in mouse models of autism. Nature Communications. 5, 4742 (2014).
- Mondo, E., et al. A developmental analysis of juxtavascular microglia dynamics and interactions with the vasculature. The Journal of Neuroscience. 40 (34), 6503-6521 (2020).
- White, M. A., et al. TDP-43 gains function due to perturbed autoregulation in a Tardbp knock-in mouse model of ALS-FTD. Nature Neuroscience. 21 (4), 552-563 (2018).
- Chou, A., et al. Inhibition of the integrated stress response reverses cognitive deficits after traumatic brain injury. Proceedings of the National Academy of Sciences. 114 (31), 6420-6426 (2017).
- Padmashri, R., Tyner, K., Dunaevsky, A. Implantation of a cranial window for repeated in vivo imaging in awake mice. Journal of Visualized Experiments. (172), e62633 (2021).
- Foda, M. A., Marmarou, A. A new model of diffuse brain injury in rats. Part II: Morphological characterization. Journal of Neurosurgery. 80 (2), 301-313 (1994).
- Flierl, M. A., et al. Mouse closed head injury model induced by a weight-drop device. Nature Protocols. 4 (9), 1328-1337 (2009).
- Sun, W., et al. In vivo two-photon imaging of anesthesia-specific alterations in microglial surveillance and photodamage-directed motility in mouse cortex. Frontiers in Neuroscience. 13, 421 (2019).
- Li, D., et al. A Through-Intact-Skull (TIS) chronic window technique for cortical structure and function observation in mice. eLight. 2 (1), 1-18 (2022).
- Paveliev, M., et al. Acute brain trauma in mice followed by longitudinal two-photon imaging. Journal of Visualized Experiments. (86), e51559 (2014).
- Han, X., et al. In vivo two-photon imaging reveals acute cerebral vascular spasm and microthrombosis after mild traumatic brain injury in mice. Frontiers in Neuroscience. 14, 210 (2020).
- Jang, S. H., Kwon, Y. H., Lee, S. J. Contrecoup injury of the prefronto-thalamic tract in a patient with mild traumatic brain injury: A case report. Medicina. 99 (32), 21601 (2020).
- Courville, C. B. The mechanism of coup-contrecoup injuries of the brain; a critical review of recent experimental studies in the light of clinical observations. Bulletin of the Los Angeles Neurological Society. 15 (2), 72-86 (1950).
- Drew, L. B., Drew, W. E. The contrecoup-coup phenomenon: a new understanding of the mechanism of closed head injury. Neurocritical Care. 1 (3), 385-390 (2004).
