दो-फोटॉन माइक्रोस्कोप का उपयोग करके एक बंद-खोपड़ी दर्दनाक मस्तिष्क की चोट और कपाल खिड़की के साथ चूहों में फ्लोरोसेंट प्रोटीन अभिव्यक्ति की इंट्रावाइटल इमेजिंग
Summary
यह अध्ययन चूहों को दोहराए जाने वाले दर्दनाक मस्तिष्क की चोट के वितरण और दो-फोटॉन माइक्रोस्कोपी का उपयोग करके न्यूरॉन-व्यक्त ईजीएफपी के बाद के इंट्रावाइटल इमेजिंग के लिए एक कपाल खिड़की के एक साथ आरोपण को दर्शाता है।
Abstract
इस प्रोटोकॉल का लक्ष्य यह प्रदर्शित करना है कि बहिर्जात उत्तेजनाओं के संपर्क में आने पर किसी जानवर के मस्तिष्क के विशिष्ट सेल प्रकारों के भीतर रुचि के प्रोटीन की अभिव्यक्ति और स्थानीयकरण को अनुदैर्ध्य रूप से कैसे देखा जाए। यहां, एक बंद-खोपड़ी दर्दनाक मस्तिष्क की चोट (टीबीआई) का प्रशासन और चूहों में बाद में अनुदैर्ध्य इंट्रावाइटल इमेजिंग के लिए एक कपाल खिड़की का एक साथ आरोपण दिखाया गया है। चूहों को इंट्राक्रैनियल रूप से एडेनो से जुड़े वायरस (एएवी) के साथ इंजेक्ट किया जाता है जो एक न्यूरोनल विशिष्ट प्रमोटर के तहत बढ़े हुए हरे फ्लोरोसेंट प्रोटीन (ईजीएफपी) को व्यक्त करता है। 2 से 4 सप्ताह के बाद, चूहों को एएवी इंजेक्शन स्थान पर वजन घटाने वाले डिवाइस का उपयोग करके दोहराए जाने वाले टीबीआई के अधीन किया जाता है। उसी सर्जिकल सत्र के भीतर, चूहों को एक धातु हेडपोस्ट और फिर टीबीआई प्रभाव स्थल पर एक ग्लास क्रैनियल विंडो के साथ प्रत्यारोपित किया जाता है। ईजीएफपी की अभिव्यक्ति और सेलुलर स्थानीयकरण की जांच महीनों के दौरान आघात के संपर्क में आने वाले एक ही मस्तिष्क क्षेत्र में दो-फोटॉन माइक्रोस्कोप का उपयोग करके की जाती है।
Introduction
दर्दनाक मस्तिष्क की चोट (टीबीआई), जो खेल की चोटों, वाहन टकराव और सैन्य लड़ाई के परिणामस्वरूप हो सकती है, एक विश्वव्यापी स्वास्थ्य चिंता है। टीबीआई शारीरिक, संज्ञानात्मक और व्यवहार संबंधी घाटे और आजीवन विकलांगता या मृत्यु दर 1,2 का कारण बन सकता है। टीबीआई गंभीरता को हल्के, मध्यम और गंभीर के रूप में वर्गीकृत किया जा सकता है, विशाल बहुमत हल्के टीबीआई (75% -90%) 3 है। यह तेजी से मान्यता प्राप्त है कि टीबीआई, विशेष रूप से टीबीआई की दोहराव वाली घटनाएं, न्यूरोनल अपघटन को बढ़ावा दे सकती हैं और अल्जाइमर रोग (एडी), एमियोट्रोफिक लेटरल स्केलेरोसिस (एएलएस), फ्रंटोटेम्पोरल डिमेंशिया (एफटीडी), और क्रोनिक ट्रॉमेटिक एन्सेफैलोपैथी (सीटीई) 4,5,6 सहित कई न्यूरोडीजेनेरेटिव बीमारियों के लिए जोखिम कारक ों के रूप में काम कर सकती हैं।. हालांकि, टीबीआई-प्रेरित न्यूरोडीजेनेरेशन के अंतर्निहित आणविक तंत्र अस्पष्ट रहते हैं, और इस प्रकार अध्ययन के एक सक्रिय क्षेत्र का प्रतिनिधित्व करते हैं। टीबीआई से न्यूरॉन्स कैसे प्रतिक्रिया करते हैं और उससे कैसे उबरते हैं, इस बारे में अंतर्दृष्टि प्राप्त करने के लिए, टीबीआई के बाद चूहों में अनुदैर्ध्य इंट्रावाइटल इमेजिंग द्वारा विशेष रूप से न्यूरॉन्स के भीतर फ्लोरोसेंटली टैग किए गए प्रोटीन की निगरानी के लिए एक विधि यहां वर्णित है।
इसके लिए, इस अध्ययन से पता चलता है कि बंद-खोपड़ी टीबीआई के प्रशासन के लिए एक शल्य चिकित्सा प्रक्रिया को कैसे संयोजित किया जाए, जो पहले7,8 के समान है, साथ ही डाउनस्ट्रीम इंट्रावाइटल इमेजिंग के लिए एक कपाल खिड़की के आरोपण के लिए एक शल्य चिकित्सा प्रक्रिया के साथ, जैसा कि गोल्डी एट अल9 द्वारा वर्णित है। विशेष रूप से, पहले एक कपाल खिड़की को प्रत्यारोपित करना और बाद में उसी क्षेत्र में टीबीआई करना संभव नहीं है, क्योंकि टीबीआई को प्रेरित करने वाले वजन में गिरावट का प्रभाव खिड़की को नुकसान पहुंचाने और माउस को अपूरणीय नुकसान पहुंचाने की संभावना है। इसलिए, इस प्रोटोकॉल को टीबीआई को प्रशासित करने और फिर एक ही सर्जिकल सत्र के भीतर प्रभाव स्थल पर सीधे कपाल खिड़की को प्रत्यारोपित करने के लिए डिज़ाइन किया गया था। एक ही सर्जिकल सत्र में टीबीआई और क्रैनियल विंडो इम्प्लांटेशन दोनों के संयोजन का एक फायदा यह है कि माउस को सर्जरी के अधीन होने की संख्या में कमी आती है। इसके अलावा, यह किसी को टीबीआई के लिए तत्काल प्रतिक्रिया (यानी, घंटों के टाइमस्केल पर) की निगरानी करने की अनुमति देता है, जो बाद के सर्जिकल सत्र में खिड़की को प्रत्यारोपित करने के विपरीत है (यानी, टीबीआई के बाद के दिनों के टाइमस्केल पर प्रारंभिक इमेजिंग)। कपाल खिड़की और इंट्रावाइटल इमेजिंग प्लेटफॉर्म भी पारंपरिक तरीकों से न्यूरोनल प्रोटीन की निगरानी पर लाभ प्रदान करते हैं जैसे कि निश्चित ऊतकों के इम्यूनोस्टेनिंग। उदाहरण के लिए, इंट्रावाइटल इमेजिंग के लिए कम चूहों की आवश्यकता होती है, क्योंकि एक ही माउस का अध्ययन कई समय बिंदुओं पर किया जा सकता है, असतत समय बिंदुओं के लिए आवश्यक चूहों के अलग-अलग समूहों के विपरीत। इसके अलावा, एक ही न्यूरॉन्स को समय के साथ निगरानी की जा सकती है, जिससे एक ही सेल के भीतर विशिष्ट जैविक या रोग संबंधी घटनाओं को ट्रैक किया जा सकता है।
अवधारणा के प्रमाण के रूप में, सिनैप्सिन प्रमोटर के तहत एन्हांस्ड ग्रीन फ्लोरोसेंट प्रोटीन (ईजीएफपी) की न्यूरॉन-विशिष्टअभिव्यक्ति यहां प्रदर्शित की गई है। इस दृष्टिकोण को अन्य सेल-प्रकार के विशिष्ट प्रमोटरों का उपयोग करके 1) विभिन्न मस्तिष्क कोशिका-प्रकारों तक बढ़ाया जा सकता है, जैसे कि ऑलिगोडेंड्रोसाइट्स के लिए माइलिन बेसिक प्रोटीन (एमबीपी) प्रमोटर और एस्ट्रोसाइट्स के लिए ग्लियल फाइब्रिलरी अम्लीय प्रोटीन (जीएफएपी) प्रमोटर11, 2) ईजीएफपी जीन के साथ अपने जीन को फ्यूज करके रुचि के विभिन्न लक्ष्य प्रोटीन, और 3) विभिन्न फ्लोरोफोरे से जुड़े कई प्रोटीनों को सह-व्यक्त करना। यहां, ईजीएफपी को एक इंट्राक्रैनील इंजेक्शन के माध्यम से एडेनो-संबद्ध वायरस (एएवी) वितरण के माध्यम से पैक और व्यक्त किया जाता है। एक बंद-खोपड़ी टीबीआई को एक वेट-ड्रॉप डिवाइस का उपयोग करके प्रशासित किया जाता है, इसके बाद एक कपाल खिड़की का आरोपण होता है। विवो में ईजीएफपी प्रतिदीप्ति का पता लगाने के लिए दो-फोटॉन माइक्रोस्कोपी का उपयोग करके न्यूरोनल ईजीएफपी का विज़ुअलाइज़ेशन कपाल खिड़की के माध्यम से प्राप्त किया जाता है। दो-फोटॉन लेजर के साथ, न्यूनतम फोटोडैमेज के साथ कॉर्टिकल ऊतक में गहराई से प्रवेश करना संभव है, जिससे दिनों और महीनों तक 12,13,14,15 तक एक व्यक्तिगत माउस के भीतर एक ही कॉर्टिकल क्षेत्रों की बार-बार अनुदैर्ध्य इमेजिंग की अनुमति मिलती है। संक्षेप में, इंट्रावाइटल इमेजिंग के साथ टीबीआई सर्जरी के संयोजन के इस दृष्टिकोण का उद्देश्य आणविक घटनाओं की समझ को आगे बढ़ाना है जो टीबीआई-प्रेरित रोग विकृति16,17 में योगदान करते हैं।
Protocol
Representative Results
Discussion
इस अध्ययन में, एएवी इंजेक्शन, टीबीआई प्रशासन और कपाल खिड़की प्रत्यारोपण के साथ एक हेडपोस्ट को कॉर्टिकल न्यूरॉन्स पर टीबीआई के प्रभावों का निरीक्षण करने के लिए माउस ब्रेन कॉर्टेक्स (परतों IV और V) के भीतर …
Divulgazioni
The authors have nothing to disclose.
Acknowledgements
हम मैसाचुसेट्स चैन मेडिकल स्कूल विश्वविद्यालय में डॉ मिगुएल सेना-एस्टेव्स को एएवी (पीएचपी.ईबी)-सिन 1-ईजीएफपी वायरस उपहार में देने के लिए धन्यवाद देते हैं, और मैसाचुसेट्स चैन मेडिकल स्कूल विश्वविद्यालय में डेबरा कैमरन को चूहों की खोपड़ी स्केच बनाने के लिए धन्यवाद देते हैं। हम बोस्को, शेफर और हेनिंगर प्रयोगशालाओं के वर्तमान और पिछले सदस्यों को उनके सुझावों और समर्थन के लिए भी धन्यवाद देते हैं। इस काम को रक्षा विभाग (W81XWH202071 / पीआरएआरपी) द्वारा डीएबी, डीएस और एनएच को वित्त पोषित किया गया था।
Materials
| Adjustable Precision Applicator Brushes | Parkell | S379 | |
| BD insulin syringe | BD | NDC/HRI#08290-3284-38 | 5/16" x 31G |
| Betadine | Purdue | NDC67618-151-17 | including 7.5% povidone iodine |
| Buprenorphine | PAR Pharmaceutical | NDC 42023-179-05 | |
| Cefazolin | HIKMA Pharmaceutical | NDC 0143-9924-90 | |
| Ceramic Mixing Dish | Parkell | SKU: S387 | For dental cement preparation |
| Cotton Tipped Applicators | ZORO | catlog #: G9531702 | |
| Catalyst | Parkell | S371 | full name: "C" Universal TBB Catalyst |
| Dental cement powder | Parkell | S396 | Radiopaque L-Powder for C&B Metabond |
| Dental drill | Foredom | H.MH-130 | |
| Dental drill controller | Foredom | HP4-310 | |
| Dexamethasone | Phoenix | NDC 57319-519-05 | |
| EF4 carbide bit | Microcopy | Lot# C150113 | Head Dia/Lgth/mm 1.0/4.2 |
| Ethonal | Fisher Scientific | 04355223EA | 75% |
| FG1/4 carbide bit | Microcopy | Lot# C150413 | Head Dia/Lgth/mm 0.5/0.4 |
| FG4 carbide bit | Microcopy | Lot# C150309 | Head Dia/Lgth/mm 1.4/1.1 |
| Headpost | N/A | N/A | Custom-manufactured |
| Heating apparatus | CWE | TC-1000 Mouse | equiped with the stereotaxic instrument and be used while operating surgery |
| Heating blanket | CVS pharmacy | E12107 | extra heating device and be used after surgery |
| Isoflurane | Pivetal | NDC 46066-755-03 | |
| Isoflurane induction chamber | Vetequip | 89012-688 | induction chamber for short |
| Isoflurane volatilizing machine | Vetequip | 911103 | |
| Isoflurane volatilizing machine holder | Vetequip | 901801 | |
| Leica surgical microscope | Leica | LEICA 10450243 | |
| Lubricant ophthalmic ointment | Picetal | NDC 46066-753-55 | |
| Marker pen | Delasco | SMP-BK | |
| Meloxicam | Norbrook | NDC 55529-040-10 | |
| Microinjection pump and its controller | World Precision Instruments | micro4 and UMP3 | |
| Microliter syringe | Hamilton | Hamilton 80014 | 1701 RN, 10 μL gauge for syringe and 32 gauge for needle, 2 in, point style 3 |
| Mosquito forceps | CAROLINA | Item #:625314 | Stainless Steel, Curved, 5 in |
| Depilatory agent | McKesson Corporation | N/A | Nair Hair Aloe & Lanolin Hair Removal Lotion |
| Microscope 1 | Nikon | SMZ745 | Nikon microscope for cranial window preparation |
| Microscope 2 | Zeiss | LSM 7 MP | two-photon microscope |
| Multiphoton laser | Coherent | Chameleon Ultra II, Model: MRU X1, VERDI 18W | laser for two-photon microscopy |
| Non-absorbable surgical suture | Harvard Apparatus | catlog# 59-6860 | 6-0, with round needle |
| Norland Optical Adhesive 81 | Norland Products | NOA 81 | |
| No-Snag Needle Holder | CAROLINA | Item #: 567912 | |
| Quick base liquid | Parkell | S398 | "B" Quick Base For C&B Metabond |
| Regular scissor 1 | Eurostat | eurostat es5-300 | |
| Regular scissor 2 | World Precision Instruments | No. 501759-G | |
| Round cover glass 1 | Warner instruments | CS-5R Cat# 64-0700 | for 5 mm of diameter |
| Round cover glass 2 | Warner instruments | CS-3R Cat# 64-0720 | for 3 mm of diameter |
| Rubber rings | Orings-Online | Item # OO-014-70-50 | O-Rings |
| Saline | Bioworld | L19102411PR | |
| Spring scissor 1 | World Precision Instruments | No. 91500-09 | tip straight |
| Spring scissor 2 | World Precision Instruments | No. 91501-09 | tip curved |
| Stereotaxic platform | KOPF | Model 900LS | |
| Super glue | Henkel | Item #: 1647358 | |
| surgical Caliper | World Precision Instruments | No. 501200 | |
| Surgical forceps 1 | ELECTRON MICROSCOPY SCIENCES | Catlog# 0508-5/45-PO | style 5/45, curved |
| Surgical forceps 2 | ELECTRON MICROSCOPY SCIENCES | catlog# 0103-5-PO | style 5, straight |
| Surgical forceps 3 | ELECTRON MICROSCOPY SCIENCES | catlog# 72912 | |
| Surgical forceps 4 | ELECTRON MICROSCOPY SCIENCES | Catlog# 0508-5/45-PO | style 5/45, curved |
| Surgical gauze | ZORO | catlog #: G0593801 | |
| Surgical lamp | Leica | Leica KL300 LED | |
| UV box | Spectrolinker | XL-1000 | also called UV crosslinker |
| Vaporguard | Vetequip | 931401 | |
| Vetbond Tissue Adhesive | 3M Animal Care | Part Number:014006 |
Riferimenti
- Bowman, K., Matney, C., Berwick, D. M. Improving traumatic brain injury care and research: a report from the National Academies of Sciences, Engineering, and Medicine. JAMA. 327 (5), 419-420 (2022).
- National Academies of Sciences, Engineering, and Medicine. . Traumatic Brain Injury: A Roadmap for Accelerating Progress. , (2022).
- Xu, X., et al. Repetitive mild traumatic brain injury in mice triggers a slowly developing cascade of long-term and persistent behavioral deficits and pathological changes. Acta Neuropathologica Communications. 9 (1), 60 (2021).
- Chen-Plotkin, A. S., Lee, V. M. Y., Trojanowski, J. Q. TAR DNA-binding protein 43 in neurodegenerative disease. Nature Reviews Neurology. 6 (4), 211-220 (2010).
- Mackenzie, I. R., Rademakers, R., Neumann, M. TDP-43 and FUS in amyotrophic lateral sclerosis and frontotemporal dementia. The Lancet. Neurology. 9 (10), 995-1007 (2010).
- McKee, A. C., et al. The first NINDS/NIBIB consensus meeting to define neuropathological criteria for the diagnosis of chronic traumatic encephalopathy. Acta Neuropathologica. 131 (1), 75-86 (2016).
- Henninger, N., et al. Attenuated traumatic axonal injury and improved functional outcome after traumatic brain injury in mice lacking Sarm1. Brain. 139, 1094-1105 (2016).
- Bouley, J., Chung, D. Y., Ayata, C., Brown, R. H., Henninger, N. Cortical spreading depression denotes concussion injury. Journal of Neurotrauma. 36 (7), 1008-1017 (2019).
- Goldey, G. J., et al. Removable cranial windows for long-term imaging in awake mice. Nature Protocols. 9 (11), 2515-2538 (2014).
- Kugler, S., et al. Neuron-specific expression of therapeutic proteins: evaluation of different cellular promoters in recombinant adenoviral vectors. Molecular and Cellular Neurosciences. 17 (1), 78-96 (2001).
- von Jonquieres, G., et al. Glial promoter selectivity following AAV-delivery to the immature brain. PLoS One. 8 (6), 65646 (2013).
- Trachtenberg, J. T., et al. Long-term in vivo imaging of experience-dependent synaptic plasticity in adult cortex. Nature. 420 (6917), 788-794 (2002).
- Mostany, R., et al. Altered synaptic dynamics during normal brain aging. The Journal of Neuroscience. 33 (9), 4094-4104 (2013).
- Yang, Q., Vazquez, A. L., Cui, X. T. Long-term in vivo two-photon imaging of the neuroinflammatory response to intracortical implants and micro-vessel disruptions in awake mice. Biomaterials. 276, 121060 (2021).
- Stosiek, C., Garaschuk, O., Holthoff, K., Konnerth, A. In vivo two-photon calcium imaging of neuronal networks. Proceedings of the National Academy of Sciences. 100 (12), 7319-7324 (2003).
- Grutzendler, J., Gan, W. B. Two-photon imaging of synaptic plasticity and pathology in the living mouse brain. NeuroRx. 3 (4), 489-496 (2006).
- Isshiki, M., et al. Enhanced synapse remodelling as a common phenotype in mouse models of autism. Nature Communications. 5, 4742 (2014).
- Mondo, E., et al. A developmental analysis of juxtavascular microglia dynamics and interactions with the vasculature. The Journal of Neuroscience. 40 (34), 6503-6521 (2020).
- White, M. A., et al. TDP-43 gains function due to perturbed autoregulation in a Tardbp knock-in mouse model of ALS-FTD. Nature Neuroscience. 21 (4), 552-563 (2018).
- Chou, A., et al. Inhibition of the integrated stress response reverses cognitive deficits after traumatic brain injury. Proceedings of the National Academy of Sciences. 114 (31), 6420-6426 (2017).
- Padmashri, R., Tyner, K., Dunaevsky, A. Implantation of a cranial window for repeated in vivo imaging in awake mice. Journal of Visualized Experiments. (172), e62633 (2021).
- Foda, M. A., Marmarou, A. A new model of diffuse brain injury in rats. Part II: Morphological characterization. Journal of Neurosurgery. 80 (2), 301-313 (1994).
- Flierl, M. A., et al. Mouse closed head injury model induced by a weight-drop device. Nature Protocols. 4 (9), 1328-1337 (2009).
- Sun, W., et al. In vivo two-photon imaging of anesthesia-specific alterations in microglial surveillance and photodamage-directed motility in mouse cortex. Frontiers in Neuroscience. 13, 421 (2019).
- Li, D., et al. A Through-Intact-Skull (TIS) chronic window technique for cortical structure and function observation in mice. eLight. 2 (1), 1-18 (2022).
- Paveliev, M., et al. Acute brain trauma in mice followed by longitudinal two-photon imaging. Journal of Visualized Experiments. (86), e51559 (2014).
- Han, X., et al. In vivo two-photon imaging reveals acute cerebral vascular spasm and microthrombosis after mild traumatic brain injury in mice. Frontiers in Neuroscience. 14, 210 (2020).
- Jang, S. H., Kwon, Y. H., Lee, S. J. Contrecoup injury of the prefronto-thalamic tract in a patient with mild traumatic brain injury: A case report. Medicina. 99 (32), 21601 (2020).
- Courville, C. B. The mechanism of coup-contrecoup injuries of the brain; a critical review of recent experimental studies in the light of clinical observations. Bulletin of the Los Angeles Neurological Society. 15 (2), 72-86 (1950).
- Drew, L. B., Drew, W. E. The contrecoup-coup phenomenon: a new understanding of the mechanism of closed head injury. Neurocritical Care. 1 (3), 385-390 (2004).
