Intravital avbildning av fluorescerende proteinuttrykk hos mus med en lukket skalle traumatisk hjerneskade og kranialvindu ved bruk av et to-foton mikroskop
Summary
Denne studien demonstrerer levering av en repeterende traumatisk hjerneskade på mus og samtidig implantasjon av et kranialvindu for etterfølgende intravital avbildning av en nevronuttrykt EGFP ved bruk av to-foton mikroskopi.
Abstract
Målet med denne protokollen er å demonstrere hvordan man langsgående visualiserer uttrykket og lokaliseringen av et protein av interesse innenfor bestemte celletyper i et dyrs hjerne, ved eksponering for eksogene stimuli. Her vises administrering av en lukket hodeskalle traumatisk hjerneskade (TBI) og samtidig implantasjon av et kranialvindu for etterfølgende langsgående intravital avbildning hos mus. Mus injiseres intrakranielt med et adenoassosiert virus (AAV) som uttrykker forbedret grønt fluorescerende protein (EGFP) under en nevronspesifikk promotor. Etter 2 til 4 uker blir musene utsatt for en repeterende TBI ved hjelp av et vekttapsapparat over AAV-injeksjonsstedet. Innenfor samme kirurgiske økt blir musene implantert med en metallstolpe og deretter et glasskranialvindu over TBI-påvirkningsstedet. Ekspresjonen og cellulær lokalisering av EGFP undersøkes ved hjelp av et to-foton mikroskop i samme hjernegruppe utsatt for traumer i løpet av måneder.
Introduction
Traumatisk hjerneskade (TBI), som kan skyldes sportsskader, kjøretøykollisjoner og militærkamp, er et verdensomspennende helseproblem. TBI kan føre til fysiologiske, kognitive og atferdsmessige underskudd, og livslang funksjonshemming eller dødelighet 1,2. TBI-alvorlighetsgraden kan klassifiseres som mild, moderat og alvorlig, de aller fleste er mild TBI (75%-90%)3. Det blir stadig mer anerkjent at TBI, spesielt repeterende forekomster av TBI, kan fremme nevronal degenerasjon og tjene som risikofaktorer for flere nevrodegenerative sykdommer, inkludert Alzheimers sykdom (AD), amyotrofisk lateralsklerose (ALS), frontotemporal demens (FTD) og kronisk traumatisk encefalopati (CTE)4,5,6. Imidlertid forblir de molekylære mekanismene som ligger til grunn for TBI-indusert nevrodegenerasjon uklare, og representerer dermed et aktivt studieområde. For å få innsikt i hvordan nevroner reagerer på og gjenoppretter fra TBI, er en metode for overvåking av fluorescerende merkede proteiner av interesse, spesielt i nevroner, ved langsgående intravital avbildning i mus etter TBI beskrevet her.
For dette formål viser denne studien hvordan man kombinerer en kirurgisk prosedyre for administrering av lukket skalle TBI som ligner på det som tidligere er rapportert7,8, sammen med en kirurgisk prosedyre for implantasjon av et kranialvindu for nedstrøms intravital avbildning, som beskrevet av Goldey et al9. Spesielt er det ikke mulig å implantere et kranialvindu først og deretter utføre en TBI i samme region, da virkningen av vektfallet som induserer TBI sannsynligvis vil skade vinduet og forårsake uopprettelig skade på musen. Derfor ble denne protokollen designet for å administrere TBI og deretter implantere kranialvinduet direkte over slagstedet, alt innenfor samme kirurgiske økt. En fordel med å kombinere både TBI og kranialvinduimplantasjon i en enkelt kirurgisk økt er en reduksjon i antall ganger en mus blir utsatt for kirurgi. Videre tillater det en å overvåke den umiddelbare responsen (dvs. på tidsskalaen for timer) til TBI, i motsetning til å implantere vinduet ved en senere kirurgisk økt (dvs. innledende bildebehandling som starter på en tidsskala på dager etter TBI). Kranialvinduet og den intravitale bildebehandlingsplattformen gir også fordeler i forhold til overvåking av nevronproteiner ved konvensjonelle metoder som immunfarging av faste vev. For eksempel kreves færre mus for intravital avbildning, da samme mus kan studeres på flere tidspunkter, i motsetning til separate kohorter av mus som trengs for diskrete tidspunkter. Videre kan de samme nevronene overvåkes over tid, slik at man kan spore spesifikke biologiske eller patologiske hendelser i samme celle.
Som et bevis på konsept er det nevronspesifikke uttrykket av forbedret grønt fluorescerende protein (EGFP) under synapsinpromotoren demonstrert her10. Denne tilnærmingen kan utvides til 1) forskjellige hjernecelletyper ved å benytte andre celletypespesifikke promotorer, for eksempel myelinbasisk protein (MBP) promotor for oligodendrocytter og glial fibrillary acidic protein (GFAP) promoter for astrocytter11, 2) forskjellige målproteiner av interesse ved å fusjonere sine gener med EGFP-genet, og 3) co-uttrykke flere proteiner fusjonert til forskjellige fluoroforer. Her pakkes EGFP og uttrykkes via adenoassosiert virus (AAV) levering gjennom en intrakraniell injeksjon. En lukket hodeskalle TBI administreres ved hjelp av en vektdråpeanordning, etterfulgt av implantasjon av et kranialvindu. Visualisering av neuronal EGFP oppnås gjennom kranialvinduet, ved bruk av to-foton mikroskopi for å oppdage EGFP-fluorescens in vivo. Med to-foton laseren er det mulig å trenge dypere inn i kortikale vev med minimal fotodamage, noe som muliggjør gjentatt langsgående avbildning av de samme kortikale områdene i en individuell mus i dager og opp til måneder12,13,14,15. I sum har denne tilnærmingen til å kombinere en TBI-kirurgi med intravital bildebehandling som mål å fremme forståelsen av molekylære hendelser som bidrar til TBI-indusert sykdomspatologi16,17.
Protocol
Representative Results
Discussion
I denne studien ble AAV-injeksjon, TBI-administrasjon og en hodepost med kranialvinduimplantasjon kombinert for langsgående bildeanalyse av EGFP-merkede nevroner i musehjernebarken (lag IV og V) for å observere effekten av TBI på kortikale nevroner. Denne studien bemerker at TBI-stedet som er valgt her, over hippocampus, gir en relativt flat og bred overflate for implantasjon av kranialvinduet. Omvendt er skallen relativt smal foran dette stedet, og derfor er det vanskelig å sikre at hodepinnen effektivt kommer i kon…
Divulgazioni
The authors have nothing to disclose.
Acknowledgements
Vi takker Dr. Miguel Sena-Esteves ved University of Massachusetts Chan Medical School for å gi bort AAV (PHP.eB)-Syn1-EGFP-viruset, og Debra Cameron ved University of Massachusetts Chan Medical School for å tegne mushodeskalleskissen. Vi takker også nåværende og tidligere medlemmer av Bosco, Schafer og Henninger laboratorier for deres forslag og støtte. Dette arbeidet ble finansiert av Department of Defense (W81XWH202071/PRARP) til DAB, DS og NH.
Materials
| Adjustable Precision Applicator Brushes | Parkell | S379 | |
| BD insulin syringe | BD | NDC/HRI#08290-3284-38 | 5/16" x 31G |
| Betadine | Purdue | NDC67618-151-17 | including 7.5% povidone iodine |
| Buprenorphine | PAR Pharmaceutical | NDC 42023-179-05 | |
| Cefazolin | HIKMA Pharmaceutical | NDC 0143-9924-90 | |
| Ceramic Mixing Dish | Parkell | SKU: S387 | For dental cement preparation |
| Cotton Tipped Applicators | ZORO | catlog #: G9531702 | |
| Catalyst | Parkell | S371 | full name: "C" Universal TBB Catalyst |
| Dental cement powder | Parkell | S396 | Radiopaque L-Powder for C&B Metabond |
| Dental drill | Foredom | H.MH-130 | |
| Dental drill controller | Foredom | HP4-310 | |
| Dexamethasone | Phoenix | NDC 57319-519-05 | |
| EF4 carbide bit | Microcopy | Lot# C150113 | Head Dia/Lgth/mm 1.0/4.2 |
| Ethonal | Fisher Scientific | 04355223EA | 75% |
| FG1/4 carbide bit | Microcopy | Lot# C150413 | Head Dia/Lgth/mm 0.5/0.4 |
| FG4 carbide bit | Microcopy | Lot# C150309 | Head Dia/Lgth/mm 1.4/1.1 |
| Headpost | N/A | N/A | Custom-manufactured |
| Heating apparatus | CWE | TC-1000 Mouse | equiped with the stereotaxic instrument and be used while operating surgery |
| Heating blanket | CVS pharmacy | E12107 | extra heating device and be used after surgery |
| Isoflurane | Pivetal | NDC 46066-755-03 | |
| Isoflurane induction chamber | Vetequip | 89012-688 | induction chamber for short |
| Isoflurane volatilizing machine | Vetequip | 911103 | |
| Isoflurane volatilizing machine holder | Vetequip | 901801 | |
| Leica surgical microscope | Leica | LEICA 10450243 | |
| Lubricant ophthalmic ointment | Picetal | NDC 46066-753-55 | |
| Marker pen | Delasco | SMP-BK | |
| Meloxicam | Norbrook | NDC 55529-040-10 | |
| Microinjection pump and its controller | World Precision Instruments | micro4 and UMP3 | |
| Microliter syringe | Hamilton | Hamilton 80014 | 1701 RN, 10 μL gauge for syringe and 32 gauge for needle, 2 in, point style 3 |
| Mosquito forceps | CAROLINA | Item #:625314 | Stainless Steel, Curved, 5 in |
| Depilatory agent | McKesson Corporation | N/A | Nair Hair Aloe & Lanolin Hair Removal Lotion |
| Microscope 1 | Nikon | SMZ745 | Nikon microscope for cranial window preparation |
| Microscope 2 | Zeiss | LSM 7 MP | two-photon microscope |
| Multiphoton laser | Coherent | Chameleon Ultra II, Model: MRU X1, VERDI 18W | laser for two-photon microscopy |
| Non-absorbable surgical suture | Harvard Apparatus | catlog# 59-6860 | 6-0, with round needle |
| Norland Optical Adhesive 81 | Norland Products | NOA 81 | |
| No-Snag Needle Holder | CAROLINA | Item #: 567912 | |
| Quick base liquid | Parkell | S398 | "B" Quick Base For C&B Metabond |
| Regular scissor 1 | Eurostat | eurostat es5-300 | |
| Regular scissor 2 | World Precision Instruments | No. 501759-G | |
| Round cover glass 1 | Warner instruments | CS-5R Cat# 64-0700 | for 5 mm of diameter |
| Round cover glass 2 | Warner instruments | CS-3R Cat# 64-0720 | for 3 mm of diameter |
| Rubber rings | Orings-Online | Item # OO-014-70-50 | O-Rings |
| Saline | Bioworld | L19102411PR | |
| Spring scissor 1 | World Precision Instruments | No. 91500-09 | tip straight |
| Spring scissor 2 | World Precision Instruments | No. 91501-09 | tip curved |
| Stereotaxic platform | KOPF | Model 900LS | |
| Super glue | Henkel | Item #: 1647358 | |
| surgical Caliper | World Precision Instruments | No. 501200 | |
| Surgical forceps 1 | ELECTRON MICROSCOPY SCIENCES | Catlog# 0508-5/45-PO | style 5/45, curved |
| Surgical forceps 2 | ELECTRON MICROSCOPY SCIENCES | catlog# 0103-5-PO | style 5, straight |
| Surgical forceps 3 | ELECTRON MICROSCOPY SCIENCES | catlog# 72912 | |
| Surgical forceps 4 | ELECTRON MICROSCOPY SCIENCES | Catlog# 0508-5/45-PO | style 5/45, curved |
| Surgical gauze | ZORO | catlog #: G0593801 | |
| Surgical lamp | Leica | Leica KL300 LED | |
| UV box | Spectrolinker | XL-1000 | also called UV crosslinker |
| Vaporguard | Vetequip | 931401 | |
| Vetbond Tissue Adhesive | 3M Animal Care | Part Number:014006 |
Riferimenti
- Bowman, K., Matney, C., Berwick, D. M. Improving traumatic brain injury care and research: a report from the National Academies of Sciences, Engineering, and Medicine. JAMA. 327 (5), 419-420 (2022).
- National Academies of Sciences, Engineering, and Medicine. . Traumatic Brain Injury: A Roadmap for Accelerating Progress. , (2022).
- Xu, X., et al. Repetitive mild traumatic brain injury in mice triggers a slowly developing cascade of long-term and persistent behavioral deficits and pathological changes. Acta Neuropathologica Communications. 9 (1), 60 (2021).
- Chen-Plotkin, A. S., Lee, V. M. Y., Trojanowski, J. Q. TAR DNA-binding protein 43 in neurodegenerative disease. Nature Reviews Neurology. 6 (4), 211-220 (2010).
- Mackenzie, I. R., Rademakers, R., Neumann, M. TDP-43 and FUS in amyotrophic lateral sclerosis and frontotemporal dementia. The Lancet. Neurology. 9 (10), 995-1007 (2010).
- McKee, A. C., et al. The first NINDS/NIBIB consensus meeting to define neuropathological criteria for the diagnosis of chronic traumatic encephalopathy. Acta Neuropathologica. 131 (1), 75-86 (2016).
- Henninger, N., et al. Attenuated traumatic axonal injury and improved functional outcome after traumatic brain injury in mice lacking Sarm1. Brain. 139, 1094-1105 (2016).
- Bouley, J., Chung, D. Y., Ayata, C., Brown, R. H., Henninger, N. Cortical spreading depression denotes concussion injury. Journal of Neurotrauma. 36 (7), 1008-1017 (2019).
- Goldey, G. J., et al. Removable cranial windows for long-term imaging in awake mice. Nature Protocols. 9 (11), 2515-2538 (2014).
- Kugler, S., et al. Neuron-specific expression of therapeutic proteins: evaluation of different cellular promoters in recombinant adenoviral vectors. Molecular and Cellular Neurosciences. 17 (1), 78-96 (2001).
- von Jonquieres, G., et al. Glial promoter selectivity following AAV-delivery to the immature brain. PLoS One. 8 (6), 65646 (2013).
- Trachtenberg, J. T., et al. Long-term in vivo imaging of experience-dependent synaptic plasticity in adult cortex. Nature. 420 (6917), 788-794 (2002).
- Mostany, R., et al. Altered synaptic dynamics during normal brain aging. The Journal of Neuroscience. 33 (9), 4094-4104 (2013).
- Yang, Q., Vazquez, A. L., Cui, X. T. Long-term in vivo two-photon imaging of the neuroinflammatory response to intracortical implants and micro-vessel disruptions in awake mice. Biomaterials. 276, 121060 (2021).
- Stosiek, C., Garaschuk, O., Holthoff, K., Konnerth, A. In vivo two-photon calcium imaging of neuronal networks. Proceedings of the National Academy of Sciences. 100 (12), 7319-7324 (2003).
- Grutzendler, J., Gan, W. B. Two-photon imaging of synaptic plasticity and pathology in the living mouse brain. NeuroRx. 3 (4), 489-496 (2006).
- Isshiki, M., et al. Enhanced synapse remodelling as a common phenotype in mouse models of autism. Nature Communications. 5, 4742 (2014).
- Mondo, E., et al. A developmental analysis of juxtavascular microglia dynamics and interactions with the vasculature. The Journal of Neuroscience. 40 (34), 6503-6521 (2020).
- White, M. A., et al. TDP-43 gains function due to perturbed autoregulation in a Tardbp knock-in mouse model of ALS-FTD. Nature Neuroscience. 21 (4), 552-563 (2018).
- Chou, A., et al. Inhibition of the integrated stress response reverses cognitive deficits after traumatic brain injury. Proceedings of the National Academy of Sciences. 114 (31), 6420-6426 (2017).
- Padmashri, R., Tyner, K., Dunaevsky, A. Implantation of a cranial window for repeated in vivo imaging in awake mice. Journal of Visualized Experiments. (172), e62633 (2021).
- Foda, M. A., Marmarou, A. A new model of diffuse brain injury in rats. Part II: Morphological characterization. Journal of Neurosurgery. 80 (2), 301-313 (1994).
- Flierl, M. A., et al. Mouse closed head injury model induced by a weight-drop device. Nature Protocols. 4 (9), 1328-1337 (2009).
- Sun, W., et al. In vivo two-photon imaging of anesthesia-specific alterations in microglial surveillance and photodamage-directed motility in mouse cortex. Frontiers in Neuroscience. 13, 421 (2019).
- Li, D., et al. A Through-Intact-Skull (TIS) chronic window technique for cortical structure and function observation in mice. eLight. 2 (1), 1-18 (2022).
- Paveliev, M., et al. Acute brain trauma in mice followed by longitudinal two-photon imaging. Journal of Visualized Experiments. (86), e51559 (2014).
- Han, X., et al. In vivo two-photon imaging reveals acute cerebral vascular spasm and microthrombosis after mild traumatic brain injury in mice. Frontiers in Neuroscience. 14, 210 (2020).
- Jang, S. H., Kwon, Y. H., Lee, S. J. Contrecoup injury of the prefronto-thalamic tract in a patient with mild traumatic brain injury: A case report. Medicina. 99 (32), 21601 (2020).
- Courville, C. B. The mechanism of coup-contrecoup injuries of the brain; a critical review of recent experimental studies in the light of clinical observations. Bulletin of the Los Angeles Neurological Society. 15 (2), 72-86 (1950).
- Drew, L. B., Drew, W. E. The contrecoup-coup phenomenon: a new understanding of the mechanism of closed head injury. Neurocritical Care. 1 (3), 385-390 (2004).
