Imágenes intravitales de la expresión de proteínas fluorescentes en ratones con una lesión cerebral traumática de cráneo cerrado y ventana craneal utilizando un microscopio de dos fotones
Summary
Este estudio demuestra la administración de una lesión cerebral traumática repetitiva a ratones y la implantación simultánea de una ventana craneal para la posterior obtención de imágenes intravitales de un EGFP expresado por neuronas mediante microscopía de dos fotones.
Abstract
El objetivo de este protocolo es demostrar cómo visualizar longitudinalmente la expresión y localización de una proteína de interés dentro de tipos celulares específicos del cerebro de un animal, tras la exposición a estímulos exógenos. En este trabajo se muestra la administración de un traumatismo craneoencefálico (TCE) cerrado y la implantación simultánea de una ventana craneal para la posterior obtención de imágenes intravitales longitudinales en ratones. A los ratones se les inyecta intracranealmente un virus adenoasociado (AAV) que expresa una proteína verde fluorescente mejorada (EGFP) bajo un promotor neuronal específico. Después de 2 a 4 semanas, los ratones se someten a una lesión cerebral traumática repetitiva utilizando un dispositivo de caída de peso sobre el lugar de inyección de AAV. Dentro de la misma sesión quirúrgica, a los ratones se les implanta un poste de cabeza de metal y luego una ventana craneal de vidrio sobre el sitio de impacto de la LCT. La expresión y localización celular de EGFP se examina utilizando un microscopio de dos fotones en la misma región cerebral expuesta a un trauma en el transcurso de meses.
Introduction
Las lesiones cerebrales traumáticas (TBI, por sus siglas en inglés), que pueden ser el resultado de lesiones deportivas, colisiones de vehículos y combates militares, son un problema de salud mundial. El TCE puede provocar déficits fisiológicos, cognitivos y conductuales, y discapacidad o mortalidad de por vida 1,2. La gravedad del TCE se puede clasificar en leve, moderada y grave, siendo la gran mayoría un TCE leve (75-90%)3. Cada vez se reconoce más que el TCE, en particular la ocurrencia repetitiva de TCE, puede promover la degeneración neuronal y servir como factores de riesgo para varias enfermedades neurodegenerativas, incluida la enfermedad de Alzheimer (EA), la esclerosis lateral amiotrófica (ELA), la demencia frontotemporal (DFT) y la encefalopatía traumática crónica (ETC)4,5,6. Sin embargo, los mecanismos moleculares que subyacen a la neurodegeneración inducida por LCT siguen sin estar claros y, por lo tanto, representan un área activa de estudio. Para obtener información sobre cómo las neuronas responden y se recuperan de un TCE, se describe aquí un método para monitorear proteínas de interés marcadas con fluorescencia, específicamente dentro de las neuronas, mediante imágenes intravitales longitudinales en ratones después de un TCE.
Con este fin, este estudio muestra cómo combinar un procedimiento quirúrgico para la administración de TCE de cráneo cerrado que es similar al descrito previamente7,8, junto con un procedimiento quirúrgico para la implantación de una ventana craneal para la imagen intravital posterior, según lo descrito por Goldey et al9. En particular, no es factible implantar primero una ventana craneal y posteriormente realizar un TCE en la misma región, ya que es probable que el impacto de la caída de peso que induce el TCE dañe la ventana y cause daños irreparables al ratón. Por lo tanto, este protocolo fue diseñado para administrar el TCE y luego implantar la ventana craneal directamente sobre el sitio del impacto, todo dentro de la misma sesión quirúrgica. Una ventaja de combinar el TCE y el implante de la ventana craneal en una sola sesión quirúrgica es la reducción del número de veces que un ratón se somete a cirugía. Además, permite monitorear la respuesta inmediata (es decir, en la escala de tiempo de horas) a la LCT, en lugar de implantar la ventana en una sesión quirúrgica posterior (es decir, las imágenes iniciales comienzan en una escala de tiempo de días después de la LCT). La ventana craneal y la plataforma de imagen intravital también ofrecen ventajas sobre la monitorización de proteínas neuronales mediante métodos convencionales como la inmunotinción de tejidos fijos. Por ejemplo, se requieren menos ratones para la obtención de imágenes intravitales, ya que el mismo ratón se puede estudiar en múltiples puntos de tiempo, a diferencia de las cohortes separadas de ratones necesarias para puntos de tiempo discretos. Además, las mismas neuronas pueden ser monitoreadas a lo largo del tiempo, lo que permite rastrear eventos biológicos o patológicos específicos dentro de la misma célula.
Como prueba de concepto, aquí se demuestra la expresión neuronal específica de la proteína fluorescente verde mejorada (EGFP) bajo el promotor de sinapsina10. Este enfoque puede extenderse a 1) diferentes tipos de células cerebrales mediante la utilización de otros promotores específicos del tipo de célula, como el promotor de la proteína básica de mielina (MBP) para los oligodendrocitos y el promotor de la proteína ácida fibrilar glial (GFAP) para los astrocitos11, 2) diferentes proteínas diana de interés mediante la fusión de sus genes con el gen EGFP, y 3) la coexpresión de múltiples proteínas fusionadas con diferentes fluoróforos. Aquí, el EGFP se empaqueta y se expresa a través de la administración de virus adenoasociados (AAV) a través de una inyección intracraneal. Se administra un traumatismo craneoencefálico cerrado mediante un dispositivo de caída de peso, seguido de la implantación de una ventana craneal. La visualización del EGFP neuronal se logra a través de la ventana craneal, utilizando microscopía de dos fotones para detectar la fluorescencia del EGFP in vivo. Con el láser de dos fotones, es posible penetrar más profundamente en el tejido cortical con un mínimo de fotodaño, lo que permite obtener imágenes longitudinales repetidas de las mismas regiones corticales dentro de un ratón individual durante días y hasta meses12,13,14,15. En resumen, este enfoque de combinar una cirugía de TCE con imágenes intravitales tiene como objetivo avanzar en la comprensión de los eventos moleculares que contribuyen a la patología de la enfermedad inducida por LCT16,17.
Protocol
Representative Results
Discussion
En este estudio, se combinaron la inyección de AAV, la administración de TBI y un poste de cabeza con implante de ventana craneal para el análisis de imágenes longitudinales de neuronas marcadas con EGFP dentro de la corteza cerebral del ratón (capas IV y V) para observar los efectos de TBI en las neuronas corticales. Este estudio señala que el sitio de TCE elegido aquí, por encima del hipocampo, proporciona una superficie relativamente plana y amplia para la implantación de la ventana craneal. Por el contrario, …
Divulgazioni
The authors have nothing to disclose.
Acknowledgements
Agradecemos al Dr. Miguel Sena-Esteves, de la Facultad de Medicina Chan de la Universidad de Massachusetts, por regalar el virus AAV(PHP.eB)-Syn1-EGFP, y a Debra Cameron, de la Facultad de Medicina Chan de la Universidad de Massachusetts, por dibujar el boceto del cráneo de los ratones. También agradecemos a los miembros actuales y pasados de los laboratorios Bosco, Schafer y Henninger por sus sugerencias y apoyo. Este trabajo fue financiado por el Departamento de Defensa (W81XWH202071/PRARP) para DAB, DS y NH.
Materials
| Adjustable Precision Applicator Brushes | Parkell | S379 | |
| BD insulin syringe | BD | NDC/HRI#08290-3284-38 | 5/16" x 31G |
| Betadine | Purdue | NDC67618-151-17 | including 7.5% povidone iodine |
| Buprenorphine | PAR Pharmaceutical | NDC 42023-179-05 | |
| Cefazolin | HIKMA Pharmaceutical | NDC 0143-9924-90 | |
| Ceramic Mixing Dish | Parkell | SKU: S387 | For dental cement preparation |
| Cotton Tipped Applicators | ZORO | catlog #: G9531702 | |
| Catalyst | Parkell | S371 | full name: "C" Universal TBB Catalyst |
| Dental cement powder | Parkell | S396 | Radiopaque L-Powder for C&B Metabond |
| Dental drill | Foredom | H.MH-130 | |
| Dental drill controller | Foredom | HP4-310 | |
| Dexamethasone | Phoenix | NDC 57319-519-05 | |
| EF4 carbide bit | Microcopy | Lot# C150113 | Head Dia/Lgth/mm 1.0/4.2 |
| Ethonal | Fisher Scientific | 04355223EA | 75% |
| FG1/4 carbide bit | Microcopy | Lot# C150413 | Head Dia/Lgth/mm 0.5/0.4 |
| FG4 carbide bit | Microcopy | Lot# C150309 | Head Dia/Lgth/mm 1.4/1.1 |
| Headpost | N/A | N/A | Custom-manufactured |
| Heating apparatus | CWE | TC-1000 Mouse | equiped with the stereotaxic instrument and be used while operating surgery |
| Heating blanket | CVS pharmacy | E12107 | extra heating device and be used after surgery |
| Isoflurane | Pivetal | NDC 46066-755-03 | |
| Isoflurane induction chamber | Vetequip | 89012-688 | induction chamber for short |
| Isoflurane volatilizing machine | Vetequip | 911103 | |
| Isoflurane volatilizing machine holder | Vetequip | 901801 | |
| Leica surgical microscope | Leica | LEICA 10450243 | |
| Lubricant ophthalmic ointment | Picetal | NDC 46066-753-55 | |
| Marker pen | Delasco | SMP-BK | |
| Meloxicam | Norbrook | NDC 55529-040-10 | |
| Microinjection pump and its controller | World Precision Instruments | micro4 and UMP3 | |
| Microliter syringe | Hamilton | Hamilton 80014 | 1701 RN, 10 μL gauge for syringe and 32 gauge for needle, 2 in, point style 3 |
| Mosquito forceps | CAROLINA | Item #:625314 | Stainless Steel, Curved, 5 in |
| Depilatory agent | McKesson Corporation | N/A | Nair Hair Aloe & Lanolin Hair Removal Lotion |
| Microscope 1 | Nikon | SMZ745 | Nikon microscope for cranial window preparation |
| Microscope 2 | Zeiss | LSM 7 MP | two-photon microscope |
| Multiphoton laser | Coherent | Chameleon Ultra II, Model: MRU X1, VERDI 18W | laser for two-photon microscopy |
| Non-absorbable surgical suture | Harvard Apparatus | catlog# 59-6860 | 6-0, with round needle |
| Norland Optical Adhesive 81 | Norland Products | NOA 81 | |
| No-Snag Needle Holder | CAROLINA | Item #: 567912 | |
| Quick base liquid | Parkell | S398 | "B" Quick Base For C&B Metabond |
| Regular scissor 1 | Eurostat | eurostat es5-300 | |
| Regular scissor 2 | World Precision Instruments | No. 501759-G | |
| Round cover glass 1 | Warner instruments | CS-5R Cat# 64-0700 | for 5 mm of diameter |
| Round cover glass 2 | Warner instruments | CS-3R Cat# 64-0720 | for 3 mm of diameter |
| Rubber rings | Orings-Online | Item # OO-014-70-50 | O-Rings |
| Saline | Bioworld | L19102411PR | |
| Spring scissor 1 | World Precision Instruments | No. 91500-09 | tip straight |
| Spring scissor 2 | World Precision Instruments | No. 91501-09 | tip curved |
| Stereotaxic platform | KOPF | Model 900LS | |
| Super glue | Henkel | Item #: 1647358 | |
| surgical Caliper | World Precision Instruments | No. 501200 | |
| Surgical forceps 1 | ELECTRON MICROSCOPY SCIENCES | Catlog# 0508-5/45-PO | style 5/45, curved |
| Surgical forceps 2 | ELECTRON MICROSCOPY SCIENCES | catlog# 0103-5-PO | style 5, straight |
| Surgical forceps 3 | ELECTRON MICROSCOPY SCIENCES | catlog# 72912 | |
| Surgical forceps 4 | ELECTRON MICROSCOPY SCIENCES | Catlog# 0508-5/45-PO | style 5/45, curved |
| Surgical gauze | ZORO | catlog #: G0593801 | |
| Surgical lamp | Leica | Leica KL300 LED | |
| UV box | Spectrolinker | XL-1000 | also called UV crosslinker |
| Vaporguard | Vetequip | 931401 | |
| Vetbond Tissue Adhesive | 3M Animal Care | Part Number:014006 |
Riferimenti
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